專利名稱：一種dna分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DNA分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌。
技術(shù)背景
L-蘇氨酸是人體所必需的8種氨基酸之一，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、飼料等，目前 L-蘇氨酸主要以微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)，多種細菌可用于L-蘇氨酸生產(chǎn)，如谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌等。由于大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸具有繁殖迅速、發(fā)酵溫度高、生理生化基礎(chǔ)研究較深入的優(yōu)勢，逐漸成為L-蘇氨酸生產(chǎn)的常用菌株。
隨著世界對L-蘇氨酸需求量的不斷增加，L-蘇氨酸高產(chǎn)菌株的研究越來越受到重視。其中，影響大腸桿菌高產(chǎn)的最關(guān)鍵的一個因素就是其耐受L-蘇氨酸的能力，只有解除L-蘇氨酸對代謝途徑的抑制，才能進而增加L-蘇氨酸的產(chǎn)量。雖然野生型的大腸桿菌具有表達L-蘇氨酸耐受蛋白的基因，但該基因所表達的蛋白量較低，僅為大腸桿菌正常生長所需，并不能耐受大于0. IM濃度的L-蘇氨酸，使得野生型的大腸桿菌的產(chǎn)酸能力較低。
因此，利用生物技術(shù)手段對野生型大腸桿菌進行改造，使其能夠具有較高L-蘇氨酸耐受能力，對L-蘇氨酸的生產(chǎn)具有十分重要的意義。發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種DNA分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌，使得所述大腸桿菌對L-蘇氨酸具有較高的耐受活性。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案
一種DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
本發(fā)明從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得來自于耶爾森氏菌屬-Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica 8081菌株的一段蛋白質(zhì)序列，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示， NCBI蛋白序號為Gi :123440599，該蛋白具體功能尚未得到公開確認，而經(jīng)申請人研究其具有耐受L-蘇氨酸的活性，但是表達該蛋白的基因來源于同大腸桿菌種屬差異較大的耶爾森氏菌屬，其在大腸桿菌中并不能正確表達該蛋白。故本發(fā)明按照大腸桿菌W3110密碼子的偏好性，優(yōu)化密碼子，通過核酸合成儀合成核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的DNA分子， 測序驗證該序列的正確性，合成基因酶切位點為Smal/Hindlll，其中優(yōu)化、合成工作由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成。
本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒pKR-D，由質(zhì)粒pKK223-3在其SmaI和HindIII酶切位點間插入如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的DNA分子獲得，經(jīng)PCR和酶切驗證并測序， 表明如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的DNA分子已成功構(gòu)建至質(zhì)粒pKK223_3中Sma I和 HindIII酶切位點間，其質(zhì)粒圖譜見圖1。
本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒PKTR-D，其由以下方法制備
以重組質(zhì)粒pKR-D為模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的下游引物擴增，BamHI/SphI雙酶切擴增產(chǎn)物，獲得由Tac啟動子、SEQ ID NO 1所示核苷酸序列的DNA分子、rrnB Tl Terminator終止子、rrnB Terminator終止子組成的片段，然后與經(jīng)過BamHI/SphI雙酶切的質(zhì)粒pKK223-3_ThrA，BC 連接即得；
其中，所述Tac啟動子、rrnB Tl ^Terminator終止子位于片段兩端，SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的DNA分子位于Tac啟動子、rrnBTerminator終止子之間，rrnB Terminator 終止子位于SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB Tl Terminator終止子之間。
經(jīng)PCR和酶切驗證并測序，表明所述片段已成功構(gòu)建至質(zhì)粒pKK223-3-HirA’BC中 BamHI和SphI酶切位點間，其質(zhì)粒圖譜見圖2。
質(zhì)粒pKK223-3 和 pKK223_3_ThrA，BC 已在文獻“Kwang Ho Lee, Molecy Iar Systems Biology 3 :149，2007”中公開，并可通過市售獲得，兩者皆為強表達質(zhì)粒，以兩者為基礎(chǔ)質(zhì)粒構(gòu)建的重組質(zhì)粒pKR-D和pKTR-D有助于本發(fā)明所述DNA分子在大腸桿菌中的表達。其中，PKR-D帶有基礎(chǔ)質(zhì)粒PKK223-3的Tac強啟動子，能增加大腸桿菌中所述 DNA分子的拷貝數(shù)和表達量，并通過基礎(chǔ)質(zhì)粒PKK223-3原有的具有強終止結(jié)構(gòu)的rrnB Tl Terminator終止子和rrnB Terminator終止子終止該基因的表達，以防所述DNA分子中TAG 終止密碼子不能終止基因表達造成的通讀。
pKTR-D是以pKR-D為模板，將上述帶有Tac啟動子、rrnB TlTerminator終止子和 rrnB Terminator終止子的所述DNA分子克隆到質(zhì)粒pKK223_3_ThrA，BC中BamHI和SphI 酶切位點間，同樣具有上述優(yōu)勢。此外，pKTR-D帶有基礎(chǔ)質(zhì)粒pKK223-3-ThrA’BC的定點突變蘇氨酸操縱子_ThrA’BC，該操縱子與引入的強Tac啟動子可以共同增強所述DNA分子的表達量，有利于改造后的大腸桿菌的L-蘇氨酸耐受能力的提高。
本發(fā)明將重組質(zhì)粒pKR-D按照本領(lǐng)域常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到經(jīng)氯化鈣法制備的大腸桿菌W3110感受態(tài)細胞中，得到一種能夠耐受L-蘇氨酸的新型大腸桿菌，命名為MHZ-0211-1， 經(jīng)PCR和酶切驗證并測序，表明所述重組質(zhì)粒pKR-D已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌W3110中，并于 2011年12月四日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No :5665，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。
本發(fā)明將重組質(zhì)粒pKTR-D按照本領(lǐng)域常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到經(jīng)氯化鈣法制備的大腸桿菌W3110感受態(tài)細胞中，得到一種能夠耐受L-蘇氨酸的新型大腸桿菌，命名為MHZ-0211-2， 經(jīng)PCR和酶切驗證并測序，表明所述重組質(zhì)粒pKR-D已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌W3110中，并于 2011年12月四日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No :5666，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。
所述大腸桿菌W3110購自于美國模式培養(yǎng)物集存庫，商品貨號為ATCC Number 39936 。
將保藏編號為CGMCC No :5665和CGMCC No :5666的大腸桿菌(以下簡稱為 MHZ-0211-1 和 MHZ-0211-2)與分別轉(zhuǎn)入 pKK223_3 和 pKK223_3_ThrA’ BC 的兩株大腸桿菌W3110(以下簡稱為MHZ-0200-1和MHZ-0200-2)進行L-蘇氨酸耐受試驗，結(jié)果表明，MHZ-0211-1和MHZ-0211-2兩菌株均可耐受0. 4M的L-蘇氨酸，而MHZ-0200-1和 MHZ-0200-2兩菌株在0. 1-0. 5M范圍內(nèi)均不耐受，表明本發(fā)明所述的新型大腸桿菌菌殼耐受較高濃度的L-蘇氨酸。
此外，將MHZ-0211-1、MHZ-0211-2、MHZ-0200-1 和 MHZ-0200-2 分別在相同環(huán)境下進行L-蘇氨酸發(fā)酵試驗，結(jié)果表明，MHZ-0211-1和MHZ-0211-2兩菌株L-蘇氨酸產(chǎn)量分別為0. 4g/L、l. lg/L，而MHZ-0200-1和MHZ-0200-2L-蘇氨酸產(chǎn)量分別為0、0. 9g/L，本發(fā)明所述新型大腸桿菌L-蘇氨酸產(chǎn)量均高于各自的對照菌株，表明其可以應用于L-蘇氨酸發(fā)酵中。
由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明以一段功能未知的蛋白序列為參照，優(yōu)化并合成一段新DNA序列，并克隆至強表達載體pKK223-3和pKK223-3_ThrA，BC中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 W3110中得到兩株具有高L-蘇氨酸耐受活性的新型大腸桿菌，能夠應用于L-蘇氨酸的發(fā)酵中。
生物材料保藏信息說明
1、MHZ-0211-1大腸桿菌，已于2011年12月四日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No :5665，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。
2、MHZ-0211-2大腸桿菌，已于2011年12月四日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No :5666，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。


圖1示本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pKR-D質(zhì)粒圖譜；
圖2示本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pKTR-D質(zhì)粒圖譜；
圖3示本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pKR-D的電泳鑒定其中，最右側(cè)為Marker,從上之下依次為 5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、 IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ；左側(cè)條帶為雙酶切產(chǎn)物條帶，從上至下依次為 4296bp、893bp ；
圖4示本發(fā)明所述重組質(zhì)粒pKTR-D的電泳鑒定其中，最右側(cè)為Marker,從上之下依次為 5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、 IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ；左側(cè)條帶為單酶切產(chǎn)物條帶，從上至下依次為 5201bp、4824bp。
具體實施例方式
本發(fā)明公開了一種DNA分子及重組質(zhì)粒和大腸桿菌，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的DNA分子、重組質(zhì)粒、大腸桿菌已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。
下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明。其中，實施例部分如未說明，則所有分子克隆、轉(zhuǎn)化等生物技術(shù)方法均參照《分子克隆試驗指南》(J.薩姆布魯克等著，科學出版社出版,第三版)O
實施例1 本發(fā)明所述DNA分子的優(yōu)化和合成
本發(fā)明從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得來自于耶爾森氏菌屬-Yersinia enterocoliticasubsp. enterocolitica 8081的一段蛋白質(zhì)序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示，NCBI 蛋白序號為Gi :123440599。本發(fā)明按照大腸桿菌W3110密碼子的偏好性，優(yōu)化密碼子，通過核酸合成儀合成核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的DNA分子，測序驗證該序列的正確性， 合成基因酶切位點為Smal/Hindlll。以Smal/Hindlll為插入位點，將其克隆到高拷貝質(zhì)粒載體pUC57上，以大腸桿菌DH5 α為受體菌株進行擴增。
其中優(yōu)化、合成工作由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成。
實施例2 構(gòu)建重組質(zhì)粒pKR-D
提取上述大腸桿菌DH5a中pUC57質(zhì)粒，Smal/Hindlll雙酶切，50 μ 1體系，T by ffer+BSA，酶切產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，待合適時間取下凝膠，切膠回收目的基因片段，取3μ 1與已制作好的同樣用Smal/Hindlll雙酶切的pKK223_3質(zhì)粒1 μ 1混合，加入高效連接酶4μ1制作8μ1的連接體系。16°C過夜連接，次日轉(zhuǎn)化已制作好的大腸桿菌 Trans Tl感受態(tài)細胞，終濃度100 μ g/ml氨芐青霉素LB平板篩選，培養(yǎng)20h后挑單菌落， 提質(zhì)粒用使用HindIII和BamHI雙酶切驗證，見圖3。結(jié)果表明，已將所述DNA分子構(gòu)建至 PKK223-3，形成新重組質(zhì)粒pKR-D，質(zhì)粒圖譜見圖1。
由圖3可知，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌能夠提出質(zhì)粒，酶切條帶位置正確、大小正確，且測序結(jié)果與所述DNA分子序列一致，說明該質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功。
實施例3 構(gòu)建重組質(zhì)粒pKTR-D
提取實施例2中大腸桿菌中的質(zhì)粒pKR-D做模板，以序列表中SEQ ID NO :2和 SEQ ID NO :3所示引物，擴增目的基因片段，該片段帶有pKTR-D上的一段源于基礎(chǔ)質(zhì)粒 PKK223-3 的 Tac 啟動子序列和 rrnB Tl Terminator、rrnB Terminator 終止子序列。BamHI/ SphI酶切擴增產(chǎn)物，取3 μ 1與已制作好的同樣用BamHI/SphI雙酶切的pKK223_3_thrA’BC 質(zhì)粒1 μ 1混合，加入高效連接酶4 μ 1制作8 μ 1的連接體系。16°C過夜連接，次日轉(zhuǎn)化已制作好的大腸桿菌Trans Tl感受態(tài)細胞，終濃度100 μ g/ml氨芐青霉素LB平板篩選， 培養(yǎng)20h后挑單菌落，提質(zhì)粒HindIII酶切驗證，見圖4。結(jié)果表明，已將所述片段構(gòu)建至 pKK223-3-thrA，BC，形成新重組質(zhì)粒pKTR-D，質(zhì)粒圖譜見圖2。
由圖4可知，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌能夠提出質(zhì)粒，酶切條帶位置正確、大小正確，且測序結(jié)果與所述DNA分子序列一致，說明該質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功。
實施例4 轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pKR-D至大腸桿菌W3110
氯化鈣法制備大腸桿菌W3110感受態(tài)細胞，從實施例2中的大腸桿菌Trans Tl感受態(tài)細胞中提取質(zhì)粒PKR-D，轉(zhuǎn)化W3110菌株，氨芐青霉素濃度100 μ g/ml濃度平板篩選，得到MHZ-0210-1大腸桿菌。
經(jīng)PCR和酶切驗證并測序，表明所述重組質(zhì)粒pKR-C已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌W3110 中，并于2011年12月四日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No :5665，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。
實施例5 轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pKTR-D至大腸桿菌W3110
氯化鈣法制備大腸桿菌W3110感受態(tài)細胞，從實施例3中的大腸桿菌Trans Tl感受態(tài)細胞中提取質(zhì)粒PKTR-D，轉(zhuǎn)化W3110菌株，氨芐青霉素濃度100 μ g/ml濃度平板篩選， 得到MHZ-0210-2大腸桿菌。
經(jīng)PCR和酶切驗證并測序，表明所述重組質(zhì)粒pKTR-D已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌W3110中，并于2011年12月四日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No :5666，分類命名為大腸埃希氏菌，Escherichia, coli。
實施例6 =L-蘇氨酸耐受試驗
參照實施例4或?qū)嵤├?的方法，將質(zhì)粒pKK223-3和質(zhì)粒pKK223-3_thrA，BC分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌W3110中，得到MHZ-0200-1以及MHZ-0200-2大腸桿菌。
按照《分子克隆試驗指南》配制1. 5%瓊脂的M9基本培養(yǎng)基，115°C滅菌20min，分別配制成含0、0. 1M、0. 2M、0. 3M、0. 4M、0. 5M的L-蘇氨酸的培養(yǎng)基，待冷卻到60°C左右，加入 100mg/ml氨芐青霉素使終濃度100 μ g/ml, IM的IPTG 0. 1 μ 1/ml，倒平板。菌株培養(yǎng)過夜， 稀釋10000倍取100 μ 1涂布平板，每1 觀察生長狀況，培養(yǎng)7 菌落生長情況結(jié)果見表 1。
表1各菌種L-蘇氨酸耐受試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一種重組質(zhì)粒pKR-D，其特征在于，由質(zhì)粒pKK223-3在其Sma I和HindIII酶切位點間插入如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA分子獲得。
3.—種重組質(zhì)粒pKTR-D，其特征在于，由以下方法制備以重組質(zhì)粒PKR-D為模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的下游引物擴增，BamHI/SphI雙酶切擴增產(chǎn)物，獲得由Tac啟動子、 SEQ ID NO :1 所示核苷酸序列的 DNA 分子、rrnB Tl Terminator 終止子、rrnB Terminator 終止子組成的片段，然后與經(jīng)過BamHI/SphI雙酶切的質(zhì)粒pKK223_3_ThrA’ BC連接即得；其中，所述Tac啟動子、rrnB Tl Terminator終止子位于片段兩端，SEQ IDNO :1所示核苷酸序列的DNA分子位于Tac啟動子、rrnB Terminator終止子之間，rrnB Terminator終止子位于SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的DNA分子和rrnB Tl Terminator終止子之間。
4.一種大腸桿菌，其保藏編號為CGMCC No :5665，由重組質(zhì)粒pKR-D轉(zhuǎn)化大腸桿菌 W3110獲得。
5.一種大腸桿菌，其保藏編號為CGMCC No :5666,由重組質(zhì)粒pKTR-D轉(zhuǎn)化大腸桿菌 W3110獲得。
6.保藏編號為CGMCCNo 5665的大腸桿菌在L-蘇氨酸發(fā)酵中的應用。
7.保藏編號為CGMCCNo 5666的大腸桿菌在L-蘇氨酸發(fā)酵中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA分子，以及由質(zhì)粒pKK223-3在其Sma I和HindIII酶切位點間插入所述DNA分子獲得的重組質(zhì)粒pKR-D和由質(zhì)粒pKK223-3-ThrA’BC在其BamHI和SphI酶切位點間插入由Tac啟動子、所述DNA分子、rrnB T1Terminator和rrnB Terminator終止子組成的片段獲得的重組質(zhì)粒pKTR-D。將本發(fā)明所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入W3110大腸桿菌中獲得兩株具有高L-蘇氨酸耐受活性的菌種，能夠應用于L-蘇氨酸的發(fā)酵中。
文檔編號C12N15/70GK102517300SQ20111046021
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者宮衛(wèi)波, 李巖, 王秋巖, 王靜波, 胡炎華 申請人:梅花生物科技集團股份有限公司