專利名稱：靶向免疫融合蛋白的構建、表達和純化方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質工程領域，具體而言，本發明涉及靶向免疫融合蛋白的生產方法，包括表達載體的構建、真核表達過程以及純化方法。
背景技術：
原癌基因HER2/neU，又名ErbB2，是膜受體中具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白， MT EGFR(epidermal growth factor rec印tor，EGH )家族的第二號成員。EAB2 通常只在胎兒時期表達，成年以后只在極少數組織內低水平表達，然而在人類多種惡性腫瘤中卻過度表達，如乳腺癌(25-30% )、卵巢癌(25-32% )、肺癌(30-35%)、原發性腎細胞癌 (30-40% )等，同時研究發現，HER2的過度表達通常預示著癌癥惡變率高或預后差(Slamon DJ, Godolphin W,Jones LA,et al. (1989)Studies of the ErbB2/neu Proto-oncogene in Human Breast and Ovarian Cancer.Science,244 (4905) :707_712·)。研究認為，HER2高表達的癌細胞發生是由于ErbB2蛋白與其家族成員(EGFR、 ErbB3, ErbB4)形成的異二聚體誘導酪氨酸激酶活化，激活受體胞內部分(C端)酪氨酸殘基發生自身磷酸化，然后激發細胞內信號級聯反應，導致下游信號分子的激活，刺激細胞增殖、發育、分化、遷移及瘤細胞形成(Alroy I，Yarden Y. (1997)The ErbB Signaling Network in Embryogenesis and Oncogenesis :Signal Diversification through Combinatorial Ligand-receptor Interactions. FEBS Lett, 410 :83-86.)。目前，國內夕卜生產銷售HER2過表達的抗癌藥物是以阻斷HER2異二聚體的形成或信號發生為靶點的單克隆抗體藥物或小分子酶類抑制劑。眾所周知，盡管單克隆抗體藥物的臨床應用使部分HER2過表達的癌癥患者獲得治療，但是其客觀有效率并不高，加上其費用高昂，因此，需要開發針對HER2/neU的新機制藥物并提供比目前人癌癥治療效果更佳、更安全、毒性更小的藥物成為同行們期盼的目標 (J.-L Merlin，M. Barberi-Heyob&N. Bachmann0 (2002)In vitro comparative evaluation of trastuzumab combined with paclitaxel or docetaxel in HER2_expressing human breast cancer cell lines.Annals of Oncology 13:1743-1748)。靶向免疫融合蛋白作為HER2/neU的新機制藥物，以其用藥量少、費用低、毒性更小而成為未來的主導藥物之一 (Ming Shi, Zhigang Xie，Jiannan Feng，Yingxun Sun， Ming YuiBeifen Shen&Ning Guo. (2003)A recombinant anti_erbB2，scFv-Fc-IL_2fusion protein retains antigen specificity and cytokine function. Biotechnology Letters 25 :815-819)、 (Jessica M. ， Manuela K. ， EvelineT. ， Roberto S. ， Stuart H.，Camilla B.，Leonardo G.，and Dario N. (2008)Antibody-Mediated Delivery of Interleukin-2to the Stroma of Breast Cancer Strongly Enhances the Potency of Chemotherapy. Clin Cancer Res ； 14 QO) 0ctoberl5.)。它是根據藥物的作用特點和生物學活性需求不同將抗體和某些藥物進行基因重組，然后，再利用質粒轉染技術在細胞或細菌中表達，經過純化而獲得的高純度融合蛋白，即“生物導彈”，其特點是(1)具有抗體的二聚體結構，增加了融合蛋白的分子量，提高其在體內的半衰期；(2)可利用抗體的靶向特性可將融合蛋白招募到靶細胞周圍，發揮融合蛋白中誘導免疫殺傷等功效的多肽功。然而，由于靶向免疫融合蛋白中成分來源復雜，結構超出了一般蛋白質的大小，因此其載體適應性往往不佳，其生產出的純度、均一性和穩定性也成問題。例如，中國專利 ZL200410039594. 3 及其引用的文獻(Biotechnol. Letters. 25 :815-819)改造了可以表達靶向免疫融合蛋白的整合載體pCMV-HFI-mNeo，其由Promega公司的pCI-neo載體出發，通過BamHI和MuI酶切其置換neo基因，構建載體pCMV_dhfr，然后在pCMV_dhfr的NheI和 EcoRI之間插入anti-c-erbB2-scFv基因，再在EcoRI和XhoI之間插入IgGl Fc段基因， 并在BioI和MluI之間插入IL-2基因。然而，本發明人發現，根據該專利教導，在NheI和 EcoRI之間插入基因之后，必將缺失掉BioI位點，無法繼續適應靶向免疫融合蛋白的實施， 即anti-C-erbB2-SCFV、IgGl Fc和IL-2基因片段無法同時插入，根本無法構建該整合載體pCMV-HFI-mNeo，相應無法生產靶向免疫融合蛋白。因此，本發明人克服了這些文獻的誤導和偏見，重新構建了整合的pCI-VCI-DHFR系列真核表達載體，盡管在多處編碼序列有突變，但是仍舊能夠表達出有活性的靶向免疫融合蛋白，也保證了該蛋白的均一性；另外本發明人根據該真核表達載體，重新組合并優化了蛋白質生產下游的細胞外分泌技術、無血清培養基懸浮培養以及抗體親和層析技術，簡化了工藝流程、提高樣品純度和穩定性，同時也降低了成本。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于克服現有技術的誤導，提供切實可行的靶向免疫融合蛋白的真核表達載體構建方法及生產方法。而且，盡管表達的靶向免疫融合蛋白序列結構在連接基因和/或白介素2基因等有多處相對于現有技術有變化，但是仍舊保留了靶向抗腫瘤的活性，另外還獲得了高穩定性的效果；構建的真核表達載體適應真核細胞的高表達，而且表達產物雜質少，方便下游純化，加之本發明人優化的純化步驟，能夠獲得藥物級純度的靶向免疫融合蛋白及其突變體。具體而言，在第一方面，本發明提供了靶向免疫融合蛋白或其突變體的生產方法， 其包括，構建選自pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI125A-DHFR和pCI_VCI125S-DHFR的真核表達載體，培養轉染了該真核表達載體的真核細胞，然后純化培養獲得的上清液，其中純化的過程包括進行陰離子交換層析、親和層析、和分子篩層析。在本文中，VCI、VCI125A、和VCI125s分別指的是靶向免疫融合蛋白和其兩個突變體。 其中，靶向免疫融合蛋白，VCI，由SEQ ID NO :1所示的核酸序列編碼；靶向免疫融合蛋白的突變體，VCI125A，由SEQ ID NO :2所示的核酸序列編碼；靴向免疫融合蛋白的突變體，VCI125s, 由SEQ ID NO :3所示的核酸序列編碼。因此，本發明第一方面的方法所生產的靶向免疫融合蛋白或其突變體由選自SEQ ID NO :1-3之一所示的核酸序列編碼。本發明的真核表達載體具有確定的、可重復構建的、切實可行的結構，克服了現有技術的誤導。具體而言，(a)pCI-VCI-DHFR 的構建過程包括，將用引物 DHFR-Pl 和 DHFR-P2PCR 擴增 DHFR 基因獲得的產物插入質粒pCI-neo的MuI和BamHI酶切位點之間，得到載體pCI_DHFR ；混合用引物V-Pl和V-P2 PCR擴增抗HER2抗體重鏈可變區基因獲得的產物與用引物V-P3和 V-P4 PCR擴增抗HER2抗體輕鏈可變區基因獲得的產物作為模板，用引物V-Pl和V-P4進行PCR擴增，將獲得的擴增產物插入載體pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位點之間，得到載體pCI-V-DHFR ；將用引物C-Pl和C_P2 PCR擴增人抗體IgGl重鏈恒定區基因獲得的產物插入載體pCI-V-DHFR的EcoRI和BioI酶切位點之間，得到載體pCI-VC_DHFR ；和，將用引物I-Pl和I-P2 PCR擴增白介素2基因獲得的產物插入載體pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI 酶切位點之間，得到載體pCI-VCI-DHFR。載體pCI-VCI_DHFR能夠在真核細胞中表達VCI。(b) pCI-VCI125A"DHFR 的構建過程包括，將用引物 DHFR-Pl 和 DHFR-P2 PCR 擴增DHFR基因獲得的產物插入質粒pCI-neo的MuI和BamHI酶切位點之間，得到載體 PCI-DHFR ；混合用引物V-Pl和V-P2PCR擴增抗HER2抗體重鏈可變區基因獲得的產物與用引物V-P3和V-P4PCR擴增抗HER2抗體輕鏈可變區基因獲得的產物作為模板，用引物V-Pl 和V-P4進行PCR擴增，將獲得的擴增產物插入載體pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位點之間，得到載體PCI-V-DHFR ；將用引物C-Pl和C-P2PCR擴增人抗體IgGl重鏈恒定區基因獲得的產物插入載體pCI-V-DHFR的EcoRI和BioI酶切位點之間，得到載體pCI-VC-DHFR ；和， 將用引物I-Pl和I-P3PCR擴增白介素2基因獲得的產物插入載體pCI-VC-DHFR的BioI和 MluI酶切位點之間，得到載體pCI-VCI125A-DHFR。載體pCI_VCI125A-DHFR能夠在真核細胞中表達 VCI1MA。(C) pCI-VCI125S"DHFR 的構建過程包括，將用引物 DHFR-Pl 和 DHFR-P2 PCR 擴增DHFR基因獲得的產物插入質粒pCI-neo的MuI和BamHI酶切位點之間，得到載體 pCI-DHFR ；混合用引物V-Pl和V_P2 PCR擴增抗HER2抗體重鏈可變區基因獲得的產物與用引物V-P3和V-P4 PCR擴增抗HER2抗體輕鏈可變區基因獲得的產物作為模板，用引物V-Pl 和V-P4進行PCR擴增，將獲得的擴增產物插入載體pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位點之間，得到載體pCI-V-DHFR ；將用引物C-Pl和C_P2 PCR擴增人抗體IgGl重鏈恒定區基因獲得的產物插入載體pCI-V-DHFR的EcoRI和BioI酶切位點之間，得到載體pCI-VC-DHFR ；和， 將用引物I-Pl和I-P4PCR擴增白介素2基因獲得的產物插入載體pCI-VC-DHFR的BioI和 MluI酶切位點之間，得到載體pCI-VCI125SDHFR。載體pCI_VCI125S-DHFR能夠在真核細胞中表達 VCI125s0在本文中，具體的基因可以通過熟知的公共數據庫(如，Genbank, http://www. ncbi.nlm.nih. gov)獲得，本領域技術人員根據基因序列可以合成或者從相應宿主細胞中RT-PCR擴增出。例如優選在本文中，DHFR基因的序列如Genbank :ΝΜ_010049. 3所示， 抗HER2抗體重鏈可變區基因如Genbank :A22466. 1所示，抗HER2抗體輕鏈可變區基因如 Genbank :A22467. 1所示，人抗體IgGl重鏈恒定區基因如Genbank :AF150959. 1所示，白介素2基因如Genbank :NM_000586. 3所示。當然，本發明的靶向免疫融合蛋白或其突變體并不是上述具體的基因序列的簡單拼接后所編碼的，而是其中具有一定的連接次序排列，而且不同基因之間通過各個編碼連接肽的連接基因連接。連接基因的序列以及突變體的突變位點由本發明人研究獲得的引物對所決定。這些引物對包括DHFR-Pl和DHFR-P2，V-Pl 和 V-P2，V-P3 禾口 V-P4，V-Pl 禾口 V—P4，C-Pl 禾口 C—P2，I-Pl 禾口 I—P2，I-Pl 禾口 I—P3，或 I-Pl 禾口 I-P4。這些引物對所決定的連接肽和突變體結構非但能夠保持靶向免疫融合蛋白或其突變體的靶向抗腫瘤活性，而且使得它們具有高穩定性。優選在本發明第一方面的生產方法中，所述真核細胞是哺乳動物細胞，例如人或鼠細胞，優選是中國倉鼠卵巢細胞(CHO)。在本發明的具體實施方式
中，真核細胞是CHO/4/10 頁
dhfr-細胞株。現有許多真核細胞都已經商品化，可以通過商業渠道購買。本發明人經過大量比較實驗發現，本發明的pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI125a-DHFR和pCI_VCI125S-DHFR載體通過脂質體介導法轉染入CHO/dhfr-細胞株，載體適應性非常佳，即轉染了 pCI-VCI-DHFR、 pCI-VCI125A-DHFR或pCI_VCI125S-DHFR載體的CHO/dhfr-細胞株相交其他多種商業化細胞株，表達的蛋白量高且穩定，而且雜質量少，更具有產業化前景，同時也方便了下游的純化工作。因此本發明也優選，真核表達載體通過脂質體介導法轉染入真核細胞，其中真核表達載體和真核細胞的配對為 pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI125A-DHFR 或 pCI-VCI125S-DHFR 載體與 CHO/ dhfr-細胞株的配對。本發明人發現，與常規CHO細胞于37 °C培養不同，當降低培養溫度，轉染了 pCI-VCI-DHFR、pCI_VCI125A-DHFR 或 pCI_VCI125S-DHFR 載體的 CHO/dhfr-細胞株的目的蛋白表達效率將大大提高。因此優選在本發明第一方面的生產方法中，培養是在^ 35°C的條件下培養，優選培養是在四 32°C的條件下培養。在本發明的具體實施方式
中，以30°C培養。優選在本發明第一方面的生產方法中，純化的過程依次包括將培養獲得的上清液進行離心、過濾、透析、陰離子交換層析、親和層析、任選的過濾、和分子篩層析。由于本發明的靶向免疫融合蛋白或其突變體連接結構導致的性質穩定，加之本發明人改良的陰離子交換層析和親和層析的收集體系可靠，因此在純化期間沒有出現蛋白質沉淀的現象。因此優選在本發明第一方面的生產方法中，純化的過程依次包括將培養獲得的上清液進行離心、 過濾、透析、陰離子交換層析、親和層析、和分子篩層析，其中在親和層析和分子篩層析之間不進行過濾，這可以進一步簡化生產過程。另外，本發明人發現，因為靶向免疫融合蛋白或其突變體的分子量較大，單此高速長時離心，在去除細胞及細胞碎屑的同時，會損失較多的靶向免疫融合蛋白，因此優選在本發明第一方面的生產方法中，純化的過程中的離心為分兩次離心。盡管本發明的純化過程的組合是現有技術所沒有啟示的，能夠純化蛋白達到超過藥用級的純度(大于95%)，然而其中每一步驟中使用的材料都可以通過商業途徑購買， 例如，其中陰離子交換層析優選是DEAE Sepharose FF陰離子交換層析；親和層析優選是 MabSelect Sure親和層析；和/或，分子篩層析優選是Superdex-200分子篩層析。在第二方面，本發明提供了本發明第一方面的生產方法生產出的靶向免疫融合蛋白或其突變體。這樣生產出的蛋白具有靶向抗腫瘤活性，而且性質穩定，在沒有蛋白質保護劑的條件下保存1個月未發現降解。本發明第一方面的生產方法能夠盡最大程度地保留二聚體形式的靶向免疫融合蛋白或其突變體，中間產物中單體和四聚體較少，提高了生產效率與產物的均一性。也就是說，本發明第一方面的生產方法已經盡可能沒有使得該二聚體降解(形成單體)，也盡可能沒有使得該二聚體多聚化(形成四聚體)。因此優選本發明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突變體是二聚體。靶向免疫融合蛋白或其突變體由選自SEQ ID NO :1-3之一所示的核酸序列編碼，因此優選本發明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突變體是由選自SEQ ID NO 1-3之一所示的核酸序列編碼的蛋白質二聚體。在第三方面，本發明提供了藥物組合物，其包含本發明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突變體，和藥學上可接受的載體。在本文中，“藥學上可接受的載體”指無毒固態、 半固態或液態填充劑、稀釋劑、緩沖劑、保護劑、防腐劑、包裹材料或其他制劑輔料。優選本
7發明第三個方面的藥物組合物，通過注射途徑來給藥，如靜脈注射、肌肉注射或皮下注射， 因此所述藥物組合物優選是粉針劑(如凍干粉針劑)和液體制劑。在第四方面，本發明提供了本發明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突變體在制備用于靶向抗腫瘤的藥物中的應用。該藥物可通過所屬領域技術人員所熟知的給藥方式來進行給藥，來治療腫瘤或癌癥。例如，可用給藥方式包括，注射、口服、直腸、舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內給藥，優選胃腸道外給藥，如皮下、肌內或靜脈內注射。給藥劑量根據制劑形式和期望的作用時間以及治療對象的情況而有所變化，實際治療所需的量可以由臨床醫生根據受試者實際情況(如，病人的病情、體重、年齡、性別等)而方便地確定。根據本發明的具體實施方式
，優選本發明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突變體在制備用于靶向抗乳腺癌、卵巢癌、胃癌或肺癌的藥物中的應用。另外，本發明還提供了用于本發明第一方面的生產方法中的中間體，包括核酸、引物對、載體、細胞和細胞上清液等；相應地，本發明還提供了中間體在本發明第一方面的生產方法中的應用。具體而言，在第五方面，本發明提供了核酸，其核苷酸序列如SEQ ID N0:l、2、或3 所示。所述核酸不但編碼了本發明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突變體，而且應用在本發明第一方面的生產方法中。因此，本發明還提供了核酸在本發明第一方面的生產方法中的應用，所述核酸的核苷酸序列如SEQ IDNO :1、2、或3所示。在第六方面，本發明提供了引物對，其為DHFR-Pl和DHFR-P2，為V-Pl和V-P2，為 V-P3 和 V-P4，為 V-Pl 和 V-P4，為 C-Pl 和 C-P2，為 I-Pl 和 I-P2，為 I-Pl 和 I-P3，或為 I-Pl 和I-P4。所述引物對決定了連接肽結構和突變位點，而且直接應用在本發明第一方面的生產方法中。因此，本發明還提供了引物對在本發明第一方面的生產方法中的應用，所述引物對為 DHFR-Pl 和 DHFR-P2，為 V-Pl 和 V-P2，為 V-P3 和 V-P4，為 V-Pl 和 V-P4，為 C-Pl 和 C-P2，為 I-Pl 和 I-P2，為 I-Pl 和 I-P3，或為 I-Pl 和 I-P4。在第七方面，本發明提供了載體，其包含本發明第五方面的核酸。載體可以是克隆載體，也可以是表達載體，優選是 pCI-VCI-DHFR、pCI_VCI125A-DHFR 或 pCI_VCI125S-DHFR， 這些優選的真核表達載體直接應用在本發明第一方面的生產方法中，與相應的真核細胞具有良好的適應性。因此，本發明還提供了載體在本發明第一方面的生產方法中的應用，所述載體包含本發明第五方面的核酸，優選所述載體是pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI125A-DHFR或 pCI-VCI125S-DHFR0在第八方面，本發明提供了細胞，其為轉染了載體pCI-VCI-DHFR、 pCI-VCI125A-DHFR或pCI-VCI125S-DHFR的真核細胞，如哺乳動物細胞，優選是中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，最優選是 CHO/dhfr-細胞株。優選的轉染了載體 pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI125A-DHFR 或pCI-VCI125S-DHFR的CHO/dhfr-細胞株在本發明第一方面的生產方法中，表達量高且穩定，雜質少。因此，本發明還提供了細胞在本發明第一方面的生產方法中的應用，所述細胞為轉染了載體 pCI-VCI-DHFR、pCI_VCI125A-DHFR 或 pCI_VCI125S-DHFR 的真核細胞，如哺乳動物細胞，優選是中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，最優選是CHO/dhfr-細胞株。在第九方面，本發明提供了細胞上清液，其為培養本發明第八方面的細胞所得的上清液。該上清液中目的蛋白含量高，雜質少，是本發明第一方面的生產方法中良好的下游純化的起始物。因此，本發明還提供了細胞上清液在本發明第一方面的生產方法中的應用，所述細胞上清液為培養本發明第八方面的細胞所得的上清液。本發明取得的有益效果包括，蛋白保持了活性，且結構穩定，純化過程中不易沉淀，純化后保存時間長；載體克服了現有技術的誤導，切實可行，與真核細胞(尤其是CHO/ dhfr-細胞株)的適應性好，能獲得高表達、低雜質的細胞上清液；純化步驟避免了蛋白質沉淀，也大大減少了降解和多聚現象的發生，能夠生產出超過藥用級純度的蛋白。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，并不構成對本發明范圍的限制。顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻也是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本發明進行參考，就好像它們的全文已經在本發明說明書中重復敘述過一樣。


圖1顯示了非還原電泳檢測的靶向免疫融合蛋白VCI、VCI125A、VCI125S的表達圖譜， 其中圖A是靶向免疫融合蛋白VCI在30°C條件下表達培養的不同時間點取樣檢測的結果， 其中0、3、6分別代表第0、3、6天收取的細胞上清液，M代表次高蛋白分子量標記；圖B是轉染了真核表達載體pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI125A-DHFR、和pCI-VCI125S-DHFR的細胞株表達培養 6天(以分別獲得的靶向免疫融合蛋白及其突變體)的電泳結果，其中1、2、3分別代表融合蛋白VCI、VCI125a和VCI125s, 140KDa和箭頭是VCI及其突變體在電泳中所處的位置，表達量均在100-150mg/L之間，而且表達培養的雜質含量不高。圖2顯示了靶向融合蛋白VCI層析純化圖譜，其中吸收峰是^Onm處測定的蛋白吸收，除了蛋白樣品吸收曲線外，還給出了 PH值曲線和鹽濃度曲線供參考。圖A是DEAE Sepharose FF離子交換純化圖譜；圖B是Mabklect Sure親和層析純化圖譜；圖C是 Superdex200凝膠層析純化圖譜，其中經檢測證明均為VCI，其中左側峰為VCI六或八聚體甚至更高聚體、中間峰為VCI四聚體、右側峰為VCI 二聚體(目標樣品)。圖3顯示了 VCI純化后的HPLC檢測圖譜，其中檢測樣品為分子篩層析并過濾后樣品，使用的設備為 Agilent 1100 (AgilentjTechnologies)，色譜柱為 TSKgel G3000Sff(XL), 箭頭所指為蛋白峰，其右側小峰是鹽峰，純度已經大大超過藥用規定95%的純度。圖4顯示了純化后新鮮的以及4°C放置一個月的VCI非還原電泳圖。檢測樣品為分子篩層析過濾后樣品，其中左圖為VCI樣品4°C放置O天，右側圖片為VCI樣品4°C放置 30天，泳道1、2為不同濃度的VCI，泳道3為高分子量標記，4為BSA。箭頭是VCI在電泳中所處的位置。圖5顯示了 HER2受體靶向活性的流式細胞檢測圖譜，其中左上圖為無HER2受體靶向活性的抗體對照，右上、左下、右下分別是靶向免疫融合蛋白及其突變體。
具體實施例方式以下本文將通過具體的實施例來描述發明。如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《分子克隆實驗指南(第三版)》(科學出版社，2002)、《細胞實驗指南》(科學出版社，北京，中國，2001年)、《蛋白質技術手冊》(科學出版社，2000)等手冊以及所用儀器和試劑盒的廠商說明所列的步驟來實施。另外，實施例中所使用的材料除有特別說明外， 均可通過商業途徑從市場上購買的醫藥級產品。實施例1 真核表達載體 pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI125A-DHFR 和 pCI_VCI125S-DHFR 的構
建1、材料大腸桿菌菌株DH5ci、CH0/dhfr_細胞株購自美國典型微生物保藏中心(ATCC No. CRL-9096)；載體pCI_neo、T4DNA連接酶購自Promega公司；核酸序列測定和合成通過商業途徑委托上海生工生物工程技術服務有限公司完成；Vent DNA聚合酶、核酸限制性內切酶購自NEB公司；mRNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒購自Axygen公司；DNA片段回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；脂質體2000購自^witrogen公司；羊抗人IgG、辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；DMEM培養基購自GIBCO公司產品。其中，DHFR基因(Genbank :ΝΜ_010049. 3)、抗HER2抗體重鏈可變區基因(Genbank :A22466. 1)、抗 HER2 抗體輕鏈可變區基因(Genbank :A22467. 1)、人抗體 IgGl 重鏈恒定區基因(Genbank :AF150959. 1)、白介素2基因(Genbank :NM_000586. 3)均委托合成出(或RT-PCR擴增出)后，測序驗證與現有公開的序列無誤。2、構建過程(a)以DHFR基因為模板，用引物DHFR-Pl (含MuI酶切位點)和DHFR-P2(含BamHI 酶切位點)進行PCR擴增，擴增產物用MuI和BamHI雙酶切，通過連接酶與用MuI和BamHI 雙酶切的pCI-neo連接，轉化菌株DH5ci后挑取陽性克隆，抽提質粒并測序驗證正確后，得到載體pCI-DHFR。引物DHFR-Pl和DHFR-P2的序列如下DHFR-Pl 5' GAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGGGGGGGGGGACAGCTCAGGGCTGCG 3'；DHFR-P2 5 ’ GGATCCTTATCGCTATCGATTCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTT ATTGCGGCCATGATCTAAAGCCAGCAAAAGTCC 3’。(b)以抗HER2抗體重鏈可變區基因為模板，用引物V-Pl (含NheI酶切位點和初始序列)和V-P2(含部分連接肽序列)進行PCR擴增，回收長約460bp的擴增產物；以抗HER2 抗體輕鏈可變區基因為模板，用引物V-P3 (含部分連接肽序列)和V-P4 (含EcoRI JhoI和 MluI酶切位點和末端用于連接的序列)進行PCR擴增，回收長約380bp的擴增產物；然后， 合并上述兩部分的擴增產物，用引物V-Pl和V-P4進行PCR擴增，回收長約SOObp的擴增產物，擴增產物用NheI和MluI雙酶切，通過連接酶與用NheI和MluI雙酶切的pCI-DHFR連接，轉化菌株DH5ci后挑取陽性克隆，抽提質粒并測序驗證正確后，得到載體pCI-V-DHFR， 其中初始序列和連接肽序列所編碼的氨基酸序列不同于ZL200410039594. 3等現有技術文獻所公開的。引物V-Pl V-P4的序列如下V-Pl (重鏈5'端引物)5’ GGCTAGCCACCATGGATAGACTTACTTCCTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTC CCAGGTACAACTGCAGCAGTCTGGACC 3'；V_P2(重鏈3'端引物)5 ‘ CGCCGGAGCCACCGCCACCAGAACCGCCACCGCCAGAGGAGACGGTGACCGTGGTC3‘；
V_P3(輕鏈5'端引物)5 ‘ TGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGACATCCAGCTGACCCAGTCTCACAAATTCC 3'；V_P4(輕鏈3'端引物)5' GGCGACGCGTCTCGAGGAATTCTTTGATTTCCAATTTTGTCCCCG 3'。(c)以人抗體IgGl重鏈恒定區基因為模板，用引物C-Pl (含EcoRI酶切位點)和 C-P2 (含BioI酶切位點)進行PCR擴增，擴增產物用EcoRI和BioI雙酶切，通過連接酶與用EcoRI和SioI雙酶切的pCI-V-DHFR連接，轉化菌株DH5 α后挑取陽性克隆，抽提質粒并測序驗證正確后，得到載體PCI-VC-DHFR，其中初始序列和多部分連接肽序列所編碼的氨基酸序列不同于ZL200410039594. 3等現有技術文獻所公開的。引物C-Pl和C-P2的序列如下C_P1(5'端引物)5' GGCGGAATTCACATGCCCACCGTGCCCAGCAC 3'；C_P2(3'端引物)5' CGCTCGAGTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC 3'。(d)以白介素2基因，分別用引物I-Pl (含BioI酶切位點和連接肽序列)和 I-P2 (含MluI酶切位點和和末端序列)、引物I-Pl和I-P3 (含MluI酶切位點和末端序列， 其中帶有I125A突變)、和I-Pl和I-P4(含MluI酶切位點和末端序列，其中帶有I125S突變)進行PCR擴增，擴增產物分別用BioI和MluI雙酶切，通過連接酶與用BioI和MluI 雙酶切的pCI-VC-DHFR連接，轉化菌株DH5 α后挑取陽性克隆，抽提質粒并測序驗證正確后，分別得到載體 pCI-VCI-DHFR、pCI_VCI125A-DHFR、和 pCI_VCI125S-DHFR，其中測序得到的編碼融合蛋白(VCI、VCI125a、和VCI125s)的核酸序列依次如SEQ ID NO :1、2和3所示，除了突變體之外，其中初始序列、多部分連接肽序列以及末端序列所編碼的氨基酸序列不同于 ZL200410039594. 3等現有技術文獻所公開的。引物I-Pl I_P4的序列如下I-P1(5'端引物)5' CCCTCGAGGGAGGGTCCGGCACCATGGCACCTACTTCAAGTTC 3'；I-P2(3'端無突變引物)5' GACGCGTTTCTAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGACAAAAGG 3'；I-P3(3'端125aa位點突變為丙氨酸引物)5' GGACGCGTTTCTAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGCGCAAAGG 3'；I-P4(3'端125aa位點突變為絲氨酸引物)5' GGACGCGTTTCTAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGAGAAAAGG 3'。通過以上步驟，最終構建出能夠整合表達靶向免疫融合蛋白的真核表達載體 pCI-VCI-DHFR、pCI_VCI125A-DHFR、和 pCI_VCI125S-DHFR。實施例2靶向免疫融合蛋白VCI、VCIima和VCI125s的表達和純化方法1，工程細胞株的獲得通過經本發明人優化的脂質體介導法利用脂質體2000 (LipofectamindOOO)將實施例 1 構建的真核表達載體 pCI-VCI-DHFR、pCI_VCI125A-DHFR、和 pCI_VCI125S-DHFR 分別轉染入CHO/dhfr-細胞。具體而言，將CHO/dhfr-細胞在20ml/培養瓶的無抗生素培養液(含10% (V/V)胎牛血清(FBS)的DMEM培養基)中培養至細胞密度達到飽和密度的85%。 然后分別將15 μ g實施例1構建的一種真核表達載體DNA和45 μ 1 Lipofectamine2000混勻，室溫置20分鐘后，加到培養瓶中，37°C溫箱中培養6小時后更換無抗生素培養液，24小時后加入500 μ 1 0. 25% (w/w)胰蛋白酶溶液消化細胞，以IOOOrmp離心aiiin棄去培養液， 用新鮮無抗生素培養液洗滌一次，然后將細胞輕輕懸浮于200ml無抗生素培養液中，等分成10份，分別置于細胞培養皿中。37°C培養箱培養36小時后更換培養液(含甲氨蝶呤(MTX)(購自Sigma公司)100 μ mol/ml的DMEM培養基)，然后每隔3天更換培養液，更換的培養液中甲氨蝶呤濃度依次為100ymol/ml、200ymol/ml和500ymol/ml，其他不變。甲氨蝶呤濃度遞加至 500 μ mol/ml時培養12 15天，當對照的空白細胞(不轉入實施例1構建的任何一種真核表達載體)全部死亡時，轉染的細胞仍舊出現存活的細胞。然后細胞株更換含甲氨蝶呤 300 μ mol/ml的DMEM培養基進行30°C蛋白表達培養，培養6天后取其上清液進行電泳檢測，選取蛋白表達量在40mg/L以上的細胞株，用含300 μ mol/ml MTX的EX_CELI 325無蛋白無血清培養基(Sigma)于37°C懸浮培養至飽和細胞密度的80%，然后分離細胞株克隆分別于30°C在含甲氨蝶呤300 μ mol/ml的DMEM培養基中培養6天后，取其上清液進行電泳檢測，選取蛋白表達量在100mg/L以上的細胞株，再用含300 μ mol/ml MTX的EX_CELL 325 無蛋白無血清培養基于37°C懸浮培養至飽和細胞密度的80%，于30°C用含甲氨蝶呤 300 μ mol/ml的DMEM培養基滾瓶(50rpm/min)培養(即，表達培養)6天，期間電泳檢測目的蛋白(VCI)表達的結果如圖IA所示。經電泳檢測(檢測圖譜如圖IB所示)，各細胞株表達蛋白水平均高而且穩定，根據面積歸一法測定，其中轉化了不同真核表達載體的細胞株表達的各靶向免疫融合蛋白(VCI、VCI125a、和pCI-VCI125S)表達培養6天的表達水平均穩定在100-150mg/L之間，可以作為工程細胞株，而且雜質蛋白水平不高，有利于下游的純化。 重復上述培養步驟，均能獲得該表達量水平的工程細胞株。2，靶向免疫融合蛋白的純化以純化VCI為例，將上述靶向免疫融合蛋白的工程細胞株在30°C滾瓶條件下表達培養7天后，取培養上清液2500ml，然后在4°C條件下以1500rpm離心5min取上清液，再以 SOOOrpm離心30min (本發明人發現，因為融合蛋白分子量較大，單此高速長時離心，在去除細胞及細胞碎屑的同時，會損失較多的靶向免疫融合蛋白，故分兩次離心)收取上清液；隨后，收取的細胞上清液經過微濾和超濾處理，其中微濾是采用0. 2μπι孔徑的微孔濾膜(購自MILLIP0RE公司)過濾，微濾液用截留30kDa的透析膜(購自MILLIP0RE公司)濃縮，同時用含 50mMNaCl 和 0. 01% (w/w)Triton X-100 的 IOmM PBS 緩沖液(pH7. 2)換液、洗脫。濃縮液以3. 5ml/min 的流速上樣于用含 IOOmM NaCl 和 0.01% (w/w) Triton X-100 的IOmM PBS緩沖液(pH7. 2)平衡的DEAE Sepharose FF陰離子交換層析柱(GE公司)并收集流穿液(圖譜如圖2A所示，所收集的樣品為兩箭頭之間的峰)。將收集的穿流液以^il/min的流速上樣于用含400mM NaCl和0. 01 % (w/w) TritonX-100的IOmM PBS緩沖液(pH 7. 2)平衡的Mabklect Sure親和層析柱(GE公司)， 棄去穿流液，然后用5倍柱體積的含50mM NaClUOOmM精氨酸和0.01% (w/w) Triton X-100 的IOmM檸檬酸緩沖液(pH3. 5)洗脫并收集洗脫液(圖譜如圖2B所示，所收集的峰為箭頭所指的峰)，然后向收集的洗脫液中加入中和液(含50mM NaCl和0.01% (w/w)TritonX-100的IOOmM PBS緩沖液，PH8.5)中和至pH中性，期間蛋白質均沒有發生沉淀，表明該收集體系可靠，而且本發明的蛋白質性質穩定，可以不需要用0.22μπι濾膜過濾。但是，為了保險起見，仍舊將收集的洗脫液通過0. 22 μ m濾膜過濾，收集濾液。將收集的濾液以3ml/min的流速上樣于用含50mM NaCl的IOmM PBS緩沖液 (pH7. 2)平衡的Superdex-200分子篩層析柱(GE公司)并收集流穿液主峰(圖譜如圖2C 所示，所收集的樣品為兩箭頭之間的峰)，其中絕大大多數產物都是二聚化的目標產物，進一步提高了純化效率。然后將收集的穿流液用50nm孔徑的聚醚砜納米膜(MILLIP0RE公司)過濾，收集純化的樣品采用TSK3000色譜柱進行HPLC檢測。檢測結果如圖3所示，純度達到了 98%。該純化的樣品在不添加任何蛋白保護劑的情況下，于4°C放置一個月，性質穩定(結果如圖4所示)，表明本發明對部分連接序列的改造能夠使得該蛋白結構穩定。另取表達上述靶向免疫融合蛋白突變體VCI125a和VCI125sW工程細胞株重復上述過程，也能夠純化出性質相當的高純度、高穩定性的蛋白。實施例3靶向免疫融合蛋白及其突變體的活性檢測用實施例2制備獲得的靶向免疫融合蛋白及其突變體進行活性檢測。根據文獻(Stacy L. Μ. ,F. Michael Y. ,Senthil K. Μ. et al. Α. Epidermal Growth Factor Receptor (HERl) Tyrosine Kinase Inhibitor ZD1839 (Iressa) Inhibits HER2/ neu (erbB2)-overexpressing Breast Cancer Cells in Vitro and in Vivo.Cancer Research. 2001. Vol. 61，8887-8895.)記載的流式細胞檢測方法，測定純化的VCI、VCI1MA和 VCI125s與HER2高表達的乳腺癌(SKBRD細胞的HER2受體結合能力的大小，由此測定針對 HER2受體的靶向活性。結果如圖5所示，所有融合蛋白及其突變體，均有高特異性的HER2 受體靶向活性，表明該活性未受多個連接肽序列改變的影響。根據文獻(Hui Guan, Shu-Fang Jia, Zhichao Zhou, et al. Herceptin Down-Regulates HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression and Enhances Taxol-Induced Cytotoxicity of Human Ewing's Sarcoma Cells In vitro and In vivo. Clinical Cancer Research. 2005. Vol. 11，2008-2017·)記載的體外細胞增值抑制方法，首先用不同的細胞在96孔細胞培養板中培養，細胞增殖至細胞密度達到飽和密度的50%時，分別加入不同濃度的蛋白或其突變體共同培養，定時檢測細胞生長狀態，同時用 MTT方法檢測細胞凋亡情況，以便分析純化的VCI、VCI125a和VCI125s的腫瘤細胞殺傷活性。 重復多次試驗，結果穩定，例如，VCI能以IC50為0. 30-0. 40mg/ml抑制SK-BR-3乳腺癌細胞，以 IC50 為 0. 50-0. 65mg/ml 抑制 SK-0V-3 卵巢癌細胞，以 IC50 為 0. 30-0. 40mg/ml 抑制 Calu-3肺癌細胞，以IC50為0. 30-0. 45mg/ml抑制低分化BGC-823胃腺癌細胞；VCI125a能以 IC50 為 0. 30-0. 40mg/ml 抑制 SK-BR-3 癌細胞，以 IC50 為 0. 40-0. 50mg/ml 抑制 SK-0V-3 癌細胞，以 IC50 為 0. 30-0. 50mg/ml 抑制 Calu-3 癌細胞，以 IC50 為 0. 35-0. 45mg/ml 抑制低分化BGC-823胃腺癌細胞；VCI125s能以IC50為0. 20-0. 40mg/ml抑制SK-BR-3癌細胞，以 IC50 為 0. 40-0. 60mg/ml 抑制 SK-0V-3 癌細胞，以 IC50 為 0. 20-0. 30mg/ml 抑制 Calu-3 癌細胞，以IC50為0. 25-0. 40mg/ml抑制低分化BGC-823胃腺癌細胞。從結果可以看出，所有融合蛋白及其突變體對多種腫瘤細胞均有穩定高效的殺傷活性，表明本發明的構建方式能夠構建出抗腫瘤藥物載體。
權利要求
1.靶向免疫融合蛋白或其突變體的生產方法，其包括，構建選自PCI-VCI-DHFR、 pCI-VCI125A-DHFR和PCI-VCI125S-DHFR的真核表達載體，培養轉染了該真核表達載體的真核細胞，然后純化培養獲得的上清液，其中純化的過程包括進行陰離子交換層析、親和層析、 和分子篩層析。
2.權利要求1的生產方法，其中，(a)pCI-VCI-DHFR的構建過程包括，將用引物DHFR-Pl和DHFR-P2PCR擴增DHFR基因獲得的產物插入質粒pCI-neo的MuI和BamHI酶切位點之間，得到載體pCI_DHFR ；混合用引物V-Pl和V-P2PCR擴增抗HER2抗體重鏈可變區基因獲得的產物與用引物V-P3和 V-P4PCR擴增抗HER2抗體輕鏈可變區基因獲得的產物作為模板，用引物V-Pl和V-P4進行 PCR擴增，將獲得的擴增產物插入載體pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位點之間，得到載體 pCI-V-DHFR ；將用引物C-Pl和C_P2 PCR擴增人抗體IgGl重鏈恒定區基因獲得的產物插入載體pCI-V-DHFR的EcoRI和BioI酶切位點之間，得到載體pCI-VC_DHFR ；和，將用引物 I-Pl和I-P2PCR擴增白介素2基因獲得的產物插入載體pCI-VC-DHFR的BioI和MluI酶切位點之間，得到載體pCI-VCI-DHFR ；(b)pCI-VCI125A-DHFR的構建過程包括，將用引物DHFR-Pl和DHFR-P2 PCR擴增DHFR基因獲得的產物插入質粒pCI-neo的MuI和BamHI酶切位點之間，得到載體pCI-DHFR ；混合用引物V-Pl和V-P2 PCR擴增抗HER2抗體重鏈可變區基因獲得的產物與用引物V-P3和 V-P4 PCR擴增抗HER2抗體輕鏈可變區基因獲得的產物作為模板，用引物V-Pl和V-P4進行PCR擴增，將獲得的擴增產物插入載體pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位點之間，得到載體pCI-V-DHFR ；將用引物C-Pl和C_P2 PCR擴增人抗體IgGl重鏈恒定區基因獲得的產物插入載體pCI-V-DHFR的EcoRI和BioI酶切位點之間，得到載體pCI-VC-DHFR ；和，將用引物I-Pl和I-P3 PCR擴增白介素2基因獲得的產物插入載體pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI 酶切位點之間，得到載體pCI-VCI125A-DHFR ；或者，(c)pCI-VCI125S-DHFR的構建過程包括，將用引物DHFR-Pl和DHFR-P2 PCR擴增DHFR基因獲得的產物插入質粒pCI-neo的MuI和BamHI酶切位點之間，得到載體pCI-DHFR ；混合用引物V-Pl和V-P2 PCR擴增抗HER2抗體重鏈可變區基因獲得的產物與用引物V-P3和 V-P4 PCR擴增抗HER2抗體輕鏈可變區基因獲得的產物作為模板，用引物V-Pl和V-P4進行PCR擴增，將獲得的擴增產物插入載體pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位點之間，得到載體pCI-V-DHFR ；將用引物C-Pl和C_P2 PCR擴增人抗體IgGl重鏈恒定區基因獲得的產物插入載體pCI-V-DHFR的EcoRI和BioI酶切位點之間，得到載體pCI-VC-DHFR ；和，將用引物I-Pl和I-P4 PCR擴增白介素2基因獲得的產物插入載體pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI 酶切位點之間，得到載體pci-vci125s-dhfr。
3.權利要求1的生產方法，其中靶向免疫融合蛋白或其突變體由選自SEQID NO 1-3 之一所示的核酸序列編碼。
4.權利要求1的生產方法，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞，優選是中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，最優選是CHO/dhfr-細胞株。
5.權利要求1的生產方法，其中培養是在^ 35°C(優選是四 321，最優選是 300C )的條件下培養。
6.權利要求1的生產方法，其中純化的過程依次包括將培養獲得的上清液進行離心、過濾、透析、陰離子交換層析、親和層析、任選的過濾、和分子篩層析。
7.權利要求1或6的生產方法，其中陰離子交換層析是DEAESepharose FF陰離子交換層析；親和層析是Mabklect Sure親和層析；和/或，分子篩層析是Superdex-200分子篩層析。
8.權利要求1-7之任一的生產方法生產出的靶向免疫融合蛋白或其突變體，優選所述靶向免疫融合蛋白或其突變體是二聚體。
9.權利要求8所述的靶向免疫融合蛋白或其突變體在制備用于靶向抗腫瘤的藥物中的應用，優選用于靶向抗乳腺癌、卵巢癌、胃癌或肺癌。
10.中間體，或中間體在權利要求1-7之任一的生產方法中的應用，所述中間體選自(a)核酸，其序列如SEQID NO :1、2、或3所示；(b)引物對，其為DHFR-Pl 和 DHFR-P2,為 V-Pl 和 V-P2,為 V-P3 和 V-P4,為 V-Pl 和 V-P4,為 C-Pl 和 C-P2，為 I-Pl 和 I-P2，為 I-Pl 和 I-P3，或為 I-Pl 和 I-P4 ；(c)載體，其包含(a)所述的核酸，優選其為pCI-VCI-DHFR、pCI-VCIima-DHFR或 pCI-VCI125S-DHFR ；(d)細胞，其為轉染了載體pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI125A-DHFR 或 pCI-VCI125S-DHFR 的真核細胞，如哺乳動物細胞，優選是中國倉鼠卵巢細胞(CH0)，最優選是CHO/dhfr-細胞株；和(e)細胞上清液，其為培養(d)所述的細胞所得的上清液。
全文摘要
本發明涉及靶向免疫融合蛋白及其突變體的生產方法，包括表達載體的構建、真核表達過程以及純化方法。另外，本發明還涉及免疫融合蛋白及其突變體等上述方法中的中間體和它們的應用。
文檔編號C12N15/85GK102586323SQ20111046309
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月18日 優先權日2011年7月22日
發明者馮秀萍, 毛旭艷, 王剛, 王成忠, 王昌慶, 王春笛, 趙英華, 都宇佳, 金磊 申請人:長春金賽藥業股份有限公司