用于向動(dòng)物或人體無創(chuàng)輸送活性蛋白質(zhì)的制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含至少一個(gè)活性肽、用于預(yù)防或治療動(dòng)物或人類疾病的制劑。所述活性肽在輸送至動(dòng)物或人體前和后，已在系統(tǒng)中表達(dá)，以有助于保持對(duì)所述肽的預(yù)防或治療作用至關(guān)重要的性質(zhì)，直至所述肽將其活性傳遞到所述動(dòng)物或人體內(nèi)的效應(yīng)部位為止。本發(fā)明與口服或黏膜疫苗或生物藥物制劑尤為相關(guān)。制劑的活性肽在細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)重組表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，制劑的活性多聚脯氨酸已在昆蟲細(xì)胞或昆蟲幼蟲中重組表達(dá)。
【專利說明】用于向動(dòng)物或人體無創(chuàng)輸送活性蛋白質(zhì)的制劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種由藥物活性劑，例如但不限于免疫原性劑（如疫苗），構(gòu)成的制 齊IJ。所述制劑利用融合肽在宿主細(xì)胞或機(jī)體中的異源表達(dá)制備而成。融合肽序列促使活性 劑組裝成穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，使有效量的藥物活性劑能輸送并到達(dá)動(dòng)物或人體的效應(yīng)物，而 不發(fā)生改變。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，該制劑通過對(duì)用于所述融合肽的異源表達(dá)的鱗 翅目幼蟲進(jìn)行均質(zhì)化處理制備而成，用于經(jīng)口輸送到動(dòng)物體內(nèi)。

【背景技術(shù)】
[0002] 誘導(dǎo)產(chǎn)生的粘模免疫在抗病原體的保護(hù)中非常重要，后者通常通過黏膜表面侵 入。將疫苗輸送到粘模表面能最有效地誘導(dǎo)黏膜免疫的產(chǎn)生。黏膜免疫系統(tǒng)明顯的聯(lián)結(jié)性 質(zhì)使疫苗能夠輸送到任何黏膜表面，誘導(dǎo)其他部位的潛在免疫（HOLMGREM，J等人黏膜免疫 和疫苗，《自然醫(yī)學(xué)》，2005年，第4卷，第S45-53頁）。口服是一種非常簡單且低成本的將 疫苗輸送到腸道黏膜表層的方法。但是，利用該途徑給藥的疫苗在胃腸道中易受到蛋白酶 解作用。因此，蛋白質(zhì)亞單元疫苗的劑量水平可能會(huì)很高，而且抗原可能需要蛋白酶解保護(hù) 才能使口服輸送有效（STREATFIELD等人，使用重組植物生產(chǎn)的口服疫苗的黏膜免疫接種， 《方法》，2006年，第38卷，第2期，第150-157頁）。
[0003] 因而，目前尚未證實(shí)口服輸送菌苗或亞單元疫苗是否有效，因?yàn)榭乖趥鬟f到腸 道黏膜免疫響應(yīng)細(xì)胞前一般會(huì)被胃改性。雖然已對(duì)大量的方法做過檢驗(yàn)以期提供一種能通 過胃的口服輸送載體，但大多數(shù)方法都無法發(fā)展為商業(yè)規(guī)模。
[0004] 有人提出用聚合物納米粒子/微粒作為常規(guī)藥物黏膜給藥的一種解決方案，雖然 目前正對(duì)一些用于黏膜疫苗輸送的聚合物輸送系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，但是商業(yè)上尚未開發(fā)這些材 料用于疫苗輸送。以聚合物為基礎(chǔ)的方法設(shè)計(jì)成能保護(hù)腸道中的抗原，將抗原靶向腸道相 關(guān)淋巴組織，或通過生物粘著增加抗原在腸道中的停留時(shí)間（VYAS，S.P.等人，納米粒子/ 微粒在黏膜疫苗輸送中的影響因子，《疫苗專家評(píng)論》，2007年，第6卷，第3期，第401-18 頁）。但在這些方法成為切合實(shí)際的現(xiàn)實(shí)前，必須克服很多難關(guān)。其中，使用有機(jī)溶劑和材 料制備顆粒會(huì)對(duì)接種疫苗的機(jī)體或環(huán)境構(gòu)成威脅（EP 2105129 A(HAREL))。此外，顆粒的制 備常常使生產(chǎn)成本增加至無法接受的水平，尤其是在獸醫(yī)領(lǐng)域。
[0005] 由于口服蛋白質(zhì)亞單元疫苗在胃腸道中必定面臨蛋白酶解，因此蛋白質(zhì)亞單元疫 苗的劑量水平可能會(huì)很高，而且抗原可能需要蛋白酶解保護(hù)才能使口服輸送有效。如果使 用經(jīng)典的以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的重組表達(dá)平臺(tái)，獲得較高含量的抗原不僅困難，而且成本昂 貴。另一方面，一旦有效量的未改變抗原到達(dá)腸道粘膜，抗原必須靶向?qū)ｉT引發(fā)免疫反應(yīng)的 黏膜細(xì)胞（JEPS0N，M.A.等人，凝集素介導(dǎo)的M細(xì)胞靶向：黏膜疫苗接種和藥物輸送的策略， 《先進(jìn)藥物輸送評(píng)論》，2004年，第56卷，第4期，第511-25頁）。
[0006] 通過研究能生產(chǎn)大量重組蛋白的低成本生產(chǎn)系統(tǒng)，人們開發(fā)出一些新的技術(shù)平 臺(tái)。以鱗翅目幼蟲為基礎(chǔ)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種低成本、高水平的表達(dá)系統(tǒng)。該技術(shù)的 一個(gè)有趣方面得到不同實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，即表明疫苗或生物藥物在鱗翅目幼蟲的粗提取物中經(jīng) 口向小鼠給藥會(huì)導(dǎo)致黏膜以不同的水平進(jìn)行吸收，使該活性化合物產(chǎn)生系統(tǒng)性活性（GONG， Z.，通過口服蠶中生產(chǎn)的霍亂毒素 B亞單元-胰島素 B-鏈融合蛋白疫苗抑制患非肥胖型糖 尿病（NOD)小鼠的糖尿病，《疫苗》，2007年，第25卷，第8期，第1444-51頁，XIA0，H.L.等 人。來自蠶幼蟲的重組骨保護(hù)素的口服活性測定，《分子生物技術(shù)》，2007年，第35卷，第8 期，第179-84頁）
[0007] 桿狀病毒表達(dá)技術(shù)廣泛用于生產(chǎn)供人和獸使用的、以病毒樣顆粒（VLP)為基礎(chǔ)的 重組疫苗或糖基化病毒抗原。其中一些產(chǎn)品在市場上已有銷售。例如GSK ΜΟΝΙΕ,Α.等人商 業(yè)化的人乳頭狀瘤病毒疫苗Cervarix? (卉研康：用于預(yù)防與人乳頭狀瘤病毒（HPV) 16, 18型有關(guān)的子宮頸癌的疫苗，《生物學(xué)》，2008年，第2卷，第1期，第97-105頁）或英特威 (默沙東動(dòng)物保健）公司銷售的預(yù)防豬圓環(huán)病毒2型的保護(hù)性疫苗-Circumvent PCV⑩:和 Porcilis PCY⑩（GRAU-R0MA，L.等人，豬圓環(huán)病毒疫苗2型引起的疾病的傳染病學(xué)、診斷和 控制，《獸醫(yī)學(xué)雜志》，2011年，第187卷，第1期，第23-32頁）。
[0008] 不同的作者已說明，利用桿狀病毒表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)的VLP是能高效地將異源細(xì)胞毒 素 T淋巴細(xì)胞表位輸送到MHC-I途徑的載體，因?yàn)樗鼈兡軌蛟跓o外源性佐劑存在的情況下 誘導(dǎo)強(qiáng)有力的免疫反應(yīng)。雖然這些免疫刺激性質(zhì)最初完全歸因于VLP的顆粒結(jié)構(gòu)，但現(xiàn)在 已證實(shí)這些顆粒的輔助作用取決于活性桿狀病毒的存在與否（HERVAS-STUBBS，S.等人，昆 蟲桿狀病毒通過誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素大大增強(qiáng)了適應(yīng)性免疫應(yīng)答，《免疫學(xué)雜志》，2007年， 第178卷，第4期，第2361-69頁），這些顆粒伴隨生產(chǎn)過程產(chǎn)生，使桿狀病毒表達(dá)的抗原成 為獨(dú)特的疫苗候選產(chǎn)品。
[0009] 本發(fā)明旨在解決目前阻礙疫苗或生物藥物開發(fā)和銷售的技術(shù)、環(huán)境和經(jīng)濟(jì)問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 在本發(fā)明中，活性劑通過融合肽的重組表達(dá)獲得。通過表達(dá)，活性物質(zhì)在宿主細(xì) 胞、培養(yǎng)基或宿主機(jī)體的體內(nèi)積累，附著在脂質(zhì)膜上或以穩(wěn)定粒子的形式聚集。活性劑是一 種由兩個(gè)序列聯(lián)結(jié)在一起構(gòu)成的融合肽，其中一個(gè)序列為目標(biāo)產(chǎn)物，另一個(gè)序列促進(jìn)目標(biāo) 產(chǎn)物向脂質(zhì)膜融合或促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物積聚成穩(wěn)定的粒子。目標(biāo)產(chǎn)物可從（但不限于）能在動(dòng) 物或人體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)抵抗病原體的免疫原性肽或蛋白中選擇。此外，目標(biāo)產(chǎn)物還可從 (但不限于）對(duì)動(dòng)物或人類疾病有治療作用的肽和蛋白中選擇。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，活性劑為表達(dá)融合序列的肽，一般而言這些序列能促進(jìn) 活性劑附著在脂滴或脂質(zhì)膜。宿主細(xì)胞或宿主機(jī)體經(jīng)過處理恢復(fù)所述活性劑時(shí)，附著在脂 質(zhì)膜上能促進(jìn)活性劑自然地封裝在脂質(zhì)體中。下文中對(duì)用于將活性劑附著在脂質(zhì)膜上的序 列進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，活性劑為表達(dá)融合序列的肽，這些序列能促進(jìn)所述活性 劑聚集成穩(wěn)定的蛋白顆粒。這些結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)能防止活性劑被蛋白酶的降解，從而增強(qiáng) 活性劑的穩(wěn)定性，并能通過黏膜免疫響應(yīng)細(xì)胞幫助識(shí)別活性劑。下文中將對(duì)用于誘發(fā)活性 劑聚集成蛋白顆粒的序列進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，利用活性劑融合到脂質(zhì)膜或聚集成蛋白顆粒的特性，開 發(fā)活性劑的具體純化方法。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，利用桿狀病毒表達(dá)載體技術(shù)在昆蟲幼蟲中表達(dá) 融合肽（KATO, T.等人，作為生命科學(xué)中平臺(tái)技術(shù)的蠶表達(dá)系統(tǒng)，《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技 術(shù)》，2010年，第85卷，第3期，第1459-70頁；C0X，M.M.等人，昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)的重組蛋白 疫苗，《疫苗》，2012年，第30卷，第10期，第1759-66頁）。
[0015] 本發(fā)明提供一種利用上述融合肽的異源表達(dá)獲得自然封裝的生物活性肽制劑的 方法。所述方法包括： 1. 在允許異源肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞或宿主機(jī)體，所述異源肽表達(dá)在于將目標(biāo) 產(chǎn)物融合到能促進(jìn)附著在脂質(zhì)膜上或聚集成穩(wěn)定的蛋白顆粒的序列上； 2. 收獲所述宿主細(xì)胞或宿主機(jī)體,或從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中或從所述機(jī)體的體內(nèi)取樣； 并（若需要） 3. 制備澄清勻漿或粗提物；并（若需要） 4. 提高勻漿或粗提物中所述異源肽的純度水平；并（若需要），添加使最終制劑理化性 質(zhì)改性的物質(zhì)。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述制劑通過對(duì)用至少一種重組桿狀病毒感染 來表達(dá)融合肽的昆蟲幼蟲進(jìn)行均質(zhì)化處理制備而成。在均質(zhì)化昆蟲幼蟲中利用桿狀病毒表 達(dá)載體技術(shù)積累融合肽，提供了一種用于口服或粘膜輸送的疫苗或生物藥物、具有成本效 益的天然制劑。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，利用融合肽異源表達(dá)獲得的制劑用于動(dòng)物或人的口服或 黏膜疫苗接種。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，接種疫苗的動(dòng)物從魚、甲殼類動(dòng)物、鳥或牛中 選擇。根據(jù)一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案，用該制劑喂動(dòng)物。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，使用通過融合肽的異源表達(dá)獲得的制劑，將藥物活性劑在 腸道內(nèi)輸送到動(dòng)物或人體內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，用該制劑來喂人，用于將活性劑 輸送到腸黏膜。根據(jù)一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案，活性劑為用于治療溶酶體貯積癥的溶酶體 酶。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)更具體的方面，融合肽為糖肽。若糖肽在優(yōu)選昆蟲宿主中重組 表達(dá)，則眾所周知糖肽具有較高水平的暴露的末端甘露糖殘基。明確地說，甘露糖受體存在 于像腸黏膜的巨噬細(xì)胞或特化細(xì)胞的免疫響應(yīng)細(xì)胞中，而這些殘基則與甘露糖受體相互作 用。這些相互作用能幫助本發(fā)明中自然封裝的活性劑靶向腸黏膜的效應(yīng)細(xì)胞。
[0020] 通過以下詳細(xì)說明，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)更加明顯。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，活性劑是表達(dá)融合序列的肽，且這些序列一般而言能促 進(jìn)活性劑附著在脂滴或脂質(zhì)膜。大多數(shù)真核細(xì)胞合成中性脂質(zhì)并將其包裹在細(xì)胞溶質(zhì)的脂 滴中。在脊椎動(dòng)物中，富含三酰甘油的脂肪細(xì)胞脂滴為身體提供一個(gè)重要的能量儲(chǔ)存庫，而 其他多種細(xì)胞富含膽固醇酯的小滴則為局部膜合成和修復(fù)提供材料。這些脂滴包被在圍脂 滴蛋白家族（PAT家族）五個(gè)成員中的一個(gè)或多個(gè)成員的表面：脂肪分化相關(guān)蛋白、TIP47、 OXPAT/MLDP、S3-12和圍脂滴蛋白（BRASAEMBLE，D. L.等人，主體評(píng)論系列：脂肪細(xì)胞生物 學(xué)）。脂滴結(jié)構(gòu)蛋白的圍脂滴蛋白家族：脂滴的穩(wěn)定化和脂解的控制，《脂質(zhì)研究雜志》，2007 年，第48卷，第12期，第2547-59頁。
[0022] PAT家族最初通過同源性鑒定為圍脂滴蛋白氨基末端中高度保守的含100個(gè)氨基 酸的結(jié)構(gòu)域，即"PAT結(jié)構(gòu)域"（圖1)。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，促進(jìn)融合肽附著在脂質(zhì)膜上的序列源于PAT家 族的蛋白質(zhì)或其同源物（BICKEL，P.E.等人，PAT蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)貯存的脂滴蛋白的原 始家族，《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》，2007年，第1791卷，第6期，第419-40頁）。根據(jù) 本發(fā)明的更為優(yōu)選的實(shí)施方案，所述序列源于昆蟲表達(dá)PAT蛋白或其同源物。
[0024] 昆蟲表達(dá)PAT蛋白分成兩個(gè)不同的亞科（LSD-1和LSD-2 ;脂質(zhì)儲(chǔ)存小滴蛋白-1 和-2)(圖1)。有新證據(jù)表明，像哺乳動(dòng)物家族成員一樣，昆蟲PAT也能在PKA引發(fā)的脂解 作用中起到至關(guān)重要的作用，并能促進(jìn)中性脂質(zhì)的儲(chǔ)存。此外，還與哺乳動(dòng)物PAT具有很多 共性：定位在脂滴，受磷酸化調(diào)節(jié)（PKA為其中一種引起磷酸化的激酶），與脂肪酶的ATGL/ Brmnmer家族共同協(xié)作（GR0NKE，S.等人，脂肪的儲(chǔ)存受果蠅PAT結(jié)構(gòu)域蛋白控制，《當(dāng)代生 物學(xué)》，2003年，第13卷，第7期，第603-6頁）。
[0025] 人們認(rèn)為，PAT蛋白通過數(shù)個(gè)嵌在核心中的疏水結(jié)構(gòu)域定位在脂滴上（圖1)，該 核心充滿中性脂質(zhì)，而中心的高度帶電酸性結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)離脂滴的表面形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。帶兩親 性β折疊片特性的序列可淺淺地嵌入小滴的表面磷脂中（GARCIA，A.等人，需要中心結(jié)構(gòu) 域?qū)蔚鞍譇靶向和定位到脂滴上，《生物化學(xué)雜志》，2003年，第278卷，第1期，第 625-35 頁）。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，用于促進(jìn)融合肽附著在脂質(zhì)膜上的序列包括家 蠶的LSDl蛋白的脂滴靶向螺旋（序列識(shí)別號(hào)：1)。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，促進(jìn)融合肽附著在脂質(zhì)膜上的序列源于人小窩蛋白 家族或其同源物（GLENNEY，J.R.等人，小窩蛋白（一種在勞斯肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞 中酪氨酸上磷酸化的細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷質(zhì)膜的蛋白成分）的序列和表達(dá)，《美國國家科學(xué)院院 刊》，1992年，第89卷，第21期，第10517-21頁）。
[0028] 細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷是質(zhì)膜上一些較小的凹陷部分，且被認(rèn)為在信號(hào)傳導(dǎo)、膽固醇輸 送和內(nèi)吞作用中起到重要作用。小窩蛋白是上述功能所必需的且構(gòu)成細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷的結(jié) 構(gòu)骨架（FUJM0T0，T.等人，小窩蛋白-2靶向脂滴，細(xì)胞中一種新的"膜結(jié)構(gòu)域"，《細(xì)胞生物 學(xué)雜志》，2001年，第152卷，第5期，第1079-85頁）。小窩蛋白-2,尤其是其β-異形體， 靶向脂滴的表面。小窩蛋白-2的中心疏水結(jié)構(gòu)域（87-119個(gè)殘基）以及N-末端（70-86 個(gè)殘基）和C-末端（120-150個(gè)殘基）的疏水結(jié)構(gòu)域?qū)χ沃械亩ㄎ欢际潜匦璧摹-和 C-末端似乎分別與膜結(jié)合和排出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)，這意味著小窩蛋白_2合成為膜蛋白運(yùn)送至 脂滴。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體方面，融合肽包含人小窩蛋白_2的β_異形體的N-和 C-末端和疏水中心結(jié)構(gòu)域（序列識(shí)別號(hào)：2)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，融合肽包含人小窩 蛋白-2的β -異形體的N-末端、疏水中心結(jié)構(gòu)域和C-末端處的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(hào)（序列識(shí) 別號(hào)：3)。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，促進(jìn)融合肽附著在脂質(zhì)膜上的序列源于原始廣泛存 在蛋白-I(AUPl)蛋白家族或其同源物。
[0031] 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的質(zhì)量控制涉及錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的識(shí)別與結(jié)合，使錯(cuò)誤折疊蛋白穿過 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)行位置轉(zhuǎn)換以及泛素介導(dǎo)靶向至蛋白酶體進(jìn)行降解。AUPl物理結(jié)合哺乳動(dòng)物 HRD1/SEI1L復(fù)合體，AUPl-消耗會(huì)損害錯(cuò)誤折疊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的降解。AUPl在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控 制中的其中一個(gè)功能是，補(bǔ)充可溶E2-泛素結(jié)合酶UBE2G2。AUPl的CUE結(jié)構(gòu)域?qū)Χ嗑鄯核?化進(jìn)行調(diào)節(jié)并對(duì)AUPl與HRDl復(fù)合體和位置轉(zhuǎn)換底物的相互作用起決定性作用（圖2)。
[0032] AUPl定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴上。AUPl表達(dá)水平影響細(xì)胞脂滴的豐度，因此它代表了 使脂滴調(diào)節(jié)活性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制相聯(lián)系的最重要的蛋白（KLEMM，E.J.等人，原始廣泛存 在蛋白-I(AUPl)在脂滴積累和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)量控制中的雙重作用，《生物化學(xué)雜志》，2011 年，第286卷，第43期，第37602-14頁）。AUPl包含靠近插入膜內(nèi)的N-末端（圖2)的疏 水區(qū)，因此細(xì)胞質(zhì)中有兩個(gè)末端（SPANDL，J.等人，原始廣泛存在蛋白-I(AUPl)定位在脂滴 上并通過其G2結(jié)合區(qū)與E2泛素結(jié)合酶G2 (Ube2g2)結(jié)合，《生物化學(xué)雜志》，2011年，第286 卷，第7期，第5599-5606頁）。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，用于促進(jìn)融合肽附著在脂質(zhì)膜上的序列包括西 方蜜蜂AUPl蛋白的脂滴靶向疏水區(qū)（序列識(shí)別號(hào)：4)。
[0034] 昆蟲的脂肪體在功能上與哺乳動(dòng)物的肝臟類似，包含合成、儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)糖原、脂質(zhì) 和蛋白質(zhì)的單細(xì)胞類型。脂肪體是一個(gè)相對(duì)較大的器官，分布在昆蟲整個(gè)身體中，優(yōu)先分布 在體被下面以及腸道和生殖器官的周圍。脂肪體的基本單元是脂肪細(xì)胞，特點(diǎn)是存在大量 脂滴（ARRESE，E. L.等人，昆蟲脂肪體：能量、新陳代謝和調(diào)節(jié)，《昆蟲學(xué)年評(píng)》，2010年，第55 期，第207-25頁）。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，當(dāng)所述目標(biāo)產(chǎn)物聯(lián)結(jié)上述任一脂質(zhì)膜靶向序列時(shí)， 目標(biāo)產(chǎn)物在昆蟲脂肪體脂肪細(xì)胞中積累。
[0036] 前面已經(jīng)對(duì)脂肪體的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)小泡的純化方法進(jìn)行了說明。根據(jù)本發(fā)明的另一 實(shí)施方案，昆蟲脂肪體內(nèi)積累的目標(biāo)產(chǎn)物通過采用所述細(xì)胞內(nèi)小泡的純化方法進(jìn)行純化， 其中所述方法可以，但不限于，以密度梯度純化法為基礎(chǔ)。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，還定義了促進(jìn)可定義為兩親性螺旋構(gòu)象的、能自組 裝的以及具有將定向組織傳遞到超分子結(jié)構(gòu)的序列。所述序列（見序列識(shí)別號(hào)：5)能進(jìn)行 自組裝。"Lee、LEE，K.K.等人，磷酸化絲氨酸和蘇氨酸二肽中位點(diǎn)選擇性分子內(nèi)氫鍵相互 作用，《化學(xué)物理雜志B》，2008年，第112卷，第51期，第16782-87頁"定義了類似的多聚脯 氨酸序列。由于能聚集形成超分子納米結(jié)構(gòu)，事實(shí)上Lee等人定義的分子能形成空心球。
[0038] 令人意外的是，活性多肽融合到該專利中定義的多聚脯氨酸序列上時(shí)，融合產(chǎn)物 形成有組織的納米結(jié)構(gòu)。
[0039] 該特殊發(fā)明的另一實(shí)施方案使用密度分離技術(shù)分離/濃縮納米結(jié)構(gòu)；另外，由于 序列中有組氨酸殘基，序列本身適合通過固定化金屬親和技術(shù)進(jìn)行純化，在形成多聚聚脯 氨酸時(shí)，會(huì)推動(dòng)這些組氨酸殘基彼此靠近。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1為脂滴蛋白PAT家族十個(gè)成員的結(jié)構(gòu)。所示的前七個(gè)（圍脂滴蛋白A至S3-12) 來自哺乳動(dòng)物，后三個(gè)來自非哺乳動(dòng)物物種（分別為蒼蠅和真菌）。這些蛋白質(zhì)在其N-末 端都有一個(gè)序列高度相似、約有100個(gè)氨基酸的區(qū)域（PAT結(jié)構(gòu)域）。信息摘自Bickel等人 的文獻(xiàn)。
[0041] 圖2為AUPl蛋白家族的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，AUPl具有410個(gè)氨基酸且在多細(xì)胞機(jī)體中 高度保守。該圖（人AUPl)顯示四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。N-末端發(fā)夾形跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)楸景l(fā)明中用 于將抗原靶向脂滴的結(jié)構(gòu)域。 具體實(shí)施例
[0042] 例 1
[0043] 虹鱒魚口服疫苗接種預(yù)防IHNV
[0044] 用以下材料感染不同組的粉紋夜蛾幼蟲：（a)表達(dá)傳染性造血器官壞死病毒 (IHNV)糖蛋白G和核蛋白N的重組桿狀病毒；(b)表達(dá)融合到家蠶1蛋白的脂滴靶向序列 上、在于IHNV糖蛋白G和核蛋白N序列的重組桿狀病毒；（c)表達(dá)融合到多聚脯氨酸序列 上、在于IHNV糖蛋白G和核蛋白N序列的重組桿狀病毒；并（d)帶空載體的對(duì)照桿狀病毒。
[0045] 感染和冷藏80小時(shí)后收獲被感染的幼蟲。將I. 5g經(jīng)均質(zhì)化處理的幼蟲和3g魚 油混合制備口服疫苗。用該含有混合物覆蓋在IOOg的虹鱒魚幼體標(biāo)準(zhǔn)商品飼料表面。將 平均體重為0. 12g的三十條虹鱒魚魚苗裝入I. 5L聚丙烯水箱中作研究用。在每次實(shí)驗(yàn)中， 用按如上所述用不同組的被感染幼蟲制備的口服疫苗和一個(gè)用未感染幼蟲覆蓋飼料表面 制備的對(duì)照組喂食這些魚，對(duì)其接種疫苗。
[0046] 利用以下方法測定接種疫苗的魚的免疫響應(yīng)：(a)對(duì)遺傳基因的表達(dá)和適應(yīng)性 免疫應(yīng)答進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(聚合酶鏈反應(yīng)）分析（免疫球蛋白、IFN-Y1、IFN-Y2、gig2、 mhc2b、mhcl、mxb和mxc) ;(b)酶聯(lián)免疫吸附測定法，即用接種疫苗的魚血清涂抹培養(yǎng)皿，捕 獲經(jīng)純化的IHNV-G和-N蛋白，然后用特異性第二抗體檢測。接種疫苗后兩個(gè)月內(nèi)，接種疫 苗的動(dòng)物產(chǎn)生抵抗IHNV的抗體，出現(xiàn)特異性免疫應(yīng)答。
【權(quán)利要求】
1. 一種用由宿主細(xì)胞或機(jī)體制備的部分純化勻漿或樣品制成的、將藥物活性劑輸送 到動(dòng)物或人體內(nèi)的制劑，其中，至少已表達(dá)一個(gè)異源肽，所述肽由兩個(gè)聯(lián)結(jié)在一起的序列構(gòu) 成，其中一個(gè)序列為目標(biāo)產(chǎn)物，另一個(gè)序列促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物組裝成穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，因?yàn)楹笠?個(gè)序列從能促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物融合到脂質(zhì)膜上的序列中選擇或從能促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物基于雙親性 螺旋構(gòu)象相互作用自組裝成蛋白顆粒的序列中選擇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物融合到脂質(zhì)膜上的序列為脂滴靶向 序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制劑，其中脂滴靶向序列從以下選擇：圍脂滴蛋白家族中的 蛋白，包括脂肪分化相關(guān)蛋白、TIP47、OXPAT/MLDP、S3-12、圍脂滴蛋白、LSD1、LSD2、ADRP、 MPL1或其同源性超過42 %的同源物；人小窩蛋白-2或其同源性超過80 %的同源物；AUP1 蛋白家族的蛋白或其同源性超過80%的同源物；序列識(shí)別號(hào)：1、序列識(shí)別號(hào)：2、序列識(shí)別 號(hào)：3和序列識(shí)別號(hào)：4的氨基酸序列中任一序列或其同源物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物組裝成蛋白顆粒的序列為多聚脯氨 酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其中多聚脯氨酸序列為序列識(shí)別號(hào)：5的氨基酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中目標(biāo)產(chǎn)物從能在動(dòng)物或人體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)抵抗 病原體的免疫原性肽或蛋白中選擇。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中目標(biāo)產(chǎn)物選自能引起對(duì)動(dòng)物或人類疾病預(yù)防或治 療作用的生物活性肽或糖肽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7所述的制劑的制備方法，包括：在允許權(quán)利要求1至7中任一 所述的融合肽的異源表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞或宿主機(jī)體；收獲所述宿主細(xì)胞或宿主機(jī) 體，或從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中或從所述機(jī)體的體內(nèi)取樣；若需要，制備澄清勻漿或粗提物；若 需要，提高勻漿或粗提物中所述異源肽的純度水平；若需要，添加使最終制劑理化性質(zhì)改性 的物質(zhì)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述制劑用昆蟲細(xì)胞、昆蟲幼蟲或昆蟲蛹制備。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中異源肽的表達(dá)通過用重組桿狀病毒感染宿主細(xì) 胞或機(jī)體實(shí)現(xiàn)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中融合肽僅僅包含目標(biāo)產(chǎn)物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中宿主機(jī)體為以下其中一種物種的昆蟲幼 蟲：粉紋夜蛾、草地夜蛾、甜菜夜蛾、銀紋夜蛾、疆夜蛾、大黃夜蛾、深褐黑夜蛾、四叉莜夜蛾、 魯夜蛾、地老虎和黃地老虎。
13. -種在動(dòng)物或人體中誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括向動(dòng)物或人施給根據(jù)權(quán)利要求8 至12中任一項(xiàng)所述制備的制劑。
14. 一種將藥物活性劑輸送到動(dòng)物或人體內(nèi)的方法，包括向動(dòng)物或人施給根據(jù)權(quán)利要 求8至12中任一項(xiàng)所述制備的制劑。
15. -種通過密度分離技術(shù)或使用序列識(shí)別號(hào)：5定義的序列分離或濃縮本發(fā)明的產(chǎn) 物的方法。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK104244970SQ201280071404
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月22日
【發(fā)明者】維克多·因凡特, 荷塞·胡安·因凡特, 凱文·O·康納, 大衛(wèi)·康坦 申請人:生物有機(jī)研究與服務(wù)有限公司