專利名稱：河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及動物生物技術領域中的山羊分子標記輔助育種技術，具體涉及到河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒。
背景技術：
羊流產病是由衣原體、弓形蟲、布魯氏桿菌感染等因素引起以羊大量流產為特征的地方性亞急性傳染病，羊只患病后表現為流產、產弱羔、死羔等。河西絨山羊流產病發病率較高，平均流產率為25. 41%，最高可達83. 33%。動物主要組織相容性(基因)復合體(majorhistocompatibility complex ,MHC) 與多種疾病有密切關系，是目前開展抗病育種的首選基因座或候選基因。山羊的MHC基因結構和功能與綿羊、牛的非常相似，并具有高度的序列同源性，分為class I、classll和 classIII區。GOLA classll基因區域與人的結構相似，其多態性集中在II類區域的DR和 DQ基因家族，DR基因家族有A、B兩類基因座，包括I個DRAl功能基因和9個DRB基因，其中DRB1、B3、B5是功能基因，其余是假基因。DRBl是II類區域中多態性最豐富的基因，這些多態性的產生主要由第二個外顯子編碼的氨基酸序列差異性所決定的。據顏衛華(2002 年)報道，HLA與人的不明習慣性流產相關。但動物的傳染性流產病與MHC的關系還未見報道。目前國內對山羊流產病主要采用藥物防治措施，較難控制病情且有藥物殘留風險。在國外MHC基因已經作為多種動物疾病的遺傳標記加以應用，并且多種檢測技術檢測已商業化并用來開展抗病選育。河西絨山羊流產病抗性分子選種技術主要利用PCR-SSCP 技術對待測山羊的DRBl基因第2外顯子進行多態性分析，然后根據檢測結果確定攜帶不同等位基因的羊只對流產病的抗性強弱，從而判斷是否可以留作種用。
發明內容本實用新型的目的是避免現有檢測技術的不足提供一種河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒。以解決快速、敏感性高、成本低，用于抗河西絨山羊流產病性分子選種技術。通過PCR-SSCP對表型正常和流產個體G0LA-DRB1基因第2外顯子進行遺傳多態性分析，并克隆、測序群體內變異產生的各等位基因序列，結合表型觀測資料，確定易感等位基因和抗性較強的等位基因，為河西絨山羊沒有感染時的抗病選育進行指導。為實現上述目的，本實用新型采取的技術方案為一種河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒，包括有盒體，襯墊，在襯墊上設有數個容器孔，其主要特點是在容器孔中分別放置第一 PCR反應液，第二 PCR反應液，GOLA-DRBI*11的DNA標準樣和G0LA_DRB1*03 的DNA標準樣。所述的河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒，還包括在容器孔中還分別放置SSCP檢測試劑，去離子水，10%過硫酸銨，上樣變性緩沖液，TEMED, 12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠。[0008]上述各種液體分別裝在容器內，插入容器孔內。本實用新型的有益效果反應靈敏、特異性強、易操作，適用于各級畜牧獸醫教學科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型河西絨山羊養殖企業的抗流產病的選種。本實用新型對河西絨山羊流產病的分子標記選種具有快速、敏感性高、成本低等特點。


圖I是本實用新型的立體示意圖。
具體實施方式
以下結合實施例對本實用新型的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本實用新型，并非用于限定本實用新型的范圍。下面以河西絨山羊流產病抗性分子選種技術的建立為例，對本實用新型的內容進行詳細的說明。實施例I :一種河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒，包括有盒體1，襯墊 2，在襯墊2上設有數個容器孔，在容器孔中分別放置第一 PCR反應液4，第二 PCR反應液11， GOLA-DRBI*11 的 DNA 標準樣 10 和 G0LA_DRB1*03 的 DNA 標準樣 12。在容器孔中還分別放置SSCP檢測試劑，去離子水5，10%過硫酸銨7，上樣變性緩沖液6，TEMED (四甲基乙二胺)8，12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr:Bis = 37. 5:1) 9。所述的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，O. 025%溴酚藍，O. 025%二甲苯青，10mmol/L EDTA pH 8. O。所述的第一 PCR反應液總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2. O μ L，Mg2 + 濃度為2. 5mM, dNTPs的終濃度為 100 μ M，引物DRB1. I和GIo各O. I μ M，Taq聚合酶O. 5U, 模板DNA為50ng，ddH20補充體積至20 μ L。所述的第二 PCR反應液總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2. O μ L，Mg2 +濃度為2. 5mM, dNTPs的終濃度為100 μ M，引物DRB1. I和DRB1. 2各O. I μ M，Taq聚合酶
O.5U，稀釋10倍后的第一輪PCR產物I. O μ L，ddH20補充體積至20 μ L。所述的G0LA_DRB1*11的DNA標準樣的核苷酸序列為ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggt gtggtacctg 60gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttcg acaacgactg gggcgagtac 120cgggcggtgg ccgagctggg gcggccggac gccaagtact ggaacagcca gaaggagatc 180ctggagcagaggcggaccgaggtggacacggtgtgcagacacacatacggggtaggt240所述的G0LA_DRB1*03的DNA標準樣的核苷酸序列為ctggagtatc ataagagcga gtgtcatttc ttcaacggga ccgagcgggc gcggttcctg 60gacagatact tctataatgg agaagagtac gtgcgcttgg acaacgactg gggcgagttc 120cgggcggtgg ccgagctggg gcggcagacc gccaagtact ggaacagcca gaaggagctc[0028]ctggagcgga ggcggaccga ggtggacacg ttctgcagac acaactacgt ggtcttt 240上述河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒的制備方法，其步驟為(I)樣品采集采集表型正常和流產病的河西絨山羊,頸靜脈采血10ml, A⑶抗凝，-20 °C凍存；(2)基因組DNA的提取用常規的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA ；(3)聚合酶鏈式反應第一輪PCR反應體系總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2. O μ L ,Mg2 +濃度為2. 5mM, dNTPs的終濃度為100 μ Μ，引物層7. I和GIo各O. I μ M，Taq聚合酶O. 5U,模板DNA為50ng, ddH20補充體積至20 μ L ;反應條件預變性94°C 5 min,變性94°C Imin, 退火60°C 2min，延伸72°C 2min，共30個循環，最后延伸72°C 5 min。第二輪PCR反應體系總體積20 μ L，其中IOXbuffer緩沖液為2. O μ L ,Mg2 +濃度為2. 5mM, dNTPs的終濃度為100 μ M，引物I _RB1.之各O. I μ M，Taq聚合酶O. 5U, 稀釋10倍后的第一輪PCR產物I. O μ L，ddH20補充體積至20 μ L ;反應條件預變性94°C 5 min，變性94°C lmin，退火60°C 30s，延伸72°C 30s，共25個循環，最后延伸72°C 5 min。引物序列為DRBI · I，5 ’ -TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3，，GIo，5 ’ -CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3，，DRBI · 2, 5，-TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3，。(4 ) PCR 產物的 SSCP 檢測取2μ I的PCR產物加入8μ I的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺、O. 025% 溴酚藍、O. 025% 二甲苯青、10mmol/L EDTA pH 8. O ,98 °C變性 IOmin，立即冰浴 IOmin ; 12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，250V電壓條件下，8 °C電泳20h，銀染法顯色后拍照；(5)結果判斷在河西絨山羊GOLA-DRBI基因第2外顯子的PCR-SSCP檢測，發現了 26個等位基因，河西絨山羊流產病抗性等位基因為G0LA_DRB1*03核苷酸序列為ctggagtatc ataagagcgagtgtcatttcttcaacgggaccgagcgggcgcggttcctggacagatacttctataatggagaagag tacgtgcgcttcgacaacgactggggcgagttccgggcggtggccgagctggggcggcagaccgccaagtactggaa cagccagaaggagctcctggagcggaggcggaccgaggtggacacgttctgcagacacaactacgtggtcttt ；GOLA-DRBI^11 核苷酸序列為ctggagtatcataagagcgagtgtcatttcttcaacgggaccg agcgg gtgtggtacctggacagatacttctataatggagaagagtacgtgcgcttcgacaacgactggggcgagta ccgggcggtggccgagctggggcggccggacgccaagtactggaacagccagaaggagatcctggagcagaggcgga ccgaggtggacacggtgtgcagacacacatacggggtcggt)，易感等位基因為GOLA-DRBl^lSGOLA-DRBl^lS 的核苷酸序列為ctggagtattacaag agagagtgtcatttcttcaatgggaccgagcgggtgcggttcctggacagatacttccataatggagaagagttcgt gcgcttcgacagcgactggggcgagttccgggcagtgaccgagctggggcggccggacgccgagtactggaacagcc agaaggacttcctggagagcaggaggaccgcggtggacacgtactgcagatacaactacggggtcagg)0上述河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒的使用方法，其步驟為(I)待檢基因組DNA (I μ L/50ng)與試劑盒中第一 PCR擴增液混合，按上述第一組引物PCR反應條件進行擴增；(2)試劑盒中第二 PCR擴增液與步驟(I)的PCR擴增產物混合，按上述第二組引物 PCR反應條件進行擴增；(3)用步驟(2)中擴增的PCR產物和G0LA_DRB1*03或G0LA_DRB1*11的DNA標準樣與試劑盒中SSCP檢測試劑各組分混合進行SSCP檢測；(4)步驟(3)中檢測到的帶型與G0LA-DRB1*03或G0LA_DRB1*11標準樣帶型一致的樣品為攜帶河西絨山羊流產病抗性等位基因的個體。本實用新型通過對試驗羊只G0LA-DRB1基因第2外顯子的PCR-SSCP檢測，發現了 26 個等位基因，其中 23 個等位基因 G0LA-DRB1*01、G0LA_DRB1*02、GOLA-DRBI*04, G0LA-DRB1*05, G0LA-DRB1*06, G0LA-DRB1*07 , G0LA-DRB1*08, G0LA_DRB1*09、 G0LA-DRB1*12、G0LA_DRB1*13、G0LA_DRB1*14、GOLA-DRBI * 15, G0LA_DRB1*16、 G0LA-DRB1*17、G0LA_DRB1*19、G0LA_DRB1*20、G0LA_DRB1*21、G0LA_DRB1*22、 G0LA-DRB1*23、GOLA-DRBI*24, G0LA_DRB1*25、GOLA-DRBI*26 在正常和患病群體中都存在， 2個等位基因G0LA-DRB1*03和G0LA_DRB1*11只在正常群體中存在，另有I個等位基因 GOLA-DRBI* 18只在患病群體中存在。將等位基因G0LA_DRB1*03和G0LA_DRB1*11作為河西絨山羊流產病抗病相關MHC基因標記，建立了抗病相關基因標記輔助選種技術。以上所述僅為本實用新型的較佳實施例，并不用以限制本實用新型，凡在本實用新型的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本實用新型的保護范圍之內。
權利要求1.一種河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒，包括有盒體(1)，襯墊(2)，在襯墊(2)上設有數個容器孔，其特征是在容器孔中分別放置第一 PCR反應液(4)，第二 PCR反應液(11)，GOLA-DRBI*11 的 DNA 標準樣(10)和 G0LA_DRB1*03 的 DNA 標準樣(12)。
2.如權利要求I所述的河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒，其特征是還包括在容器孔中還分別放置SSCP檢測試劑，去離子水(5)，10%過硫酸銨(7)，上樣變性緩沖液(6), TEMED (8)，12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(9)。
專利摘要本實用新型涉及動物生物技術領域中的山羊分子標記輔助育種技術，具體涉及到河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒。一種河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒，包括有盒體，襯墊，在襯墊上設有數個容器孔，其主要特點是在容器孔中分別放置第一PCR反應液，第二PCR反應液，GOLA-DRB1*11和GOLA-DRB1*03的DNA標準樣。本實用新型的優點是反應靈敏、特異性強、易操作，適用于各級畜牧獸醫教學科研單位，獸用生物制品廠以及各大、中型河西絨山羊養殖企業的抗流產病的選種。
文檔編號C12Q1/68GK202347026SQ201120477830
公開日2012年7月25日 申請日期2011年11月27日 優先權日2011年11月27日
發明者劉秀, 李少斌, 王佳泰, 王繼卿, 羅玉柱, 胡江, 馬小軍 申請人:甘肅農業大學