專利名稱：用于改善脂肪酸含量而開發(fā)的銅綠假單孢菌菌株及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因的重組銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)及其制備方法，尤其是一種以有關(guān)脂肪酸生物合成的基因轉(zhuǎn)基因的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌及其制備方法。
背景技術(shù)：
使用化石燃料時大量排放地球暖化氣體及廢棄物，從而為人類帶來了嚴重的環(huán)境危機。因此迫切需要開發(fā)能夠替代基于化石燃料的化學(xué)工業(yè)，亦即以盡量減少有害于人類的廢棄物的生產(chǎn)及能源消耗的生物物質(zhì)作為原料的新環(huán)保生物工藝。生物乙醇、生物柴油、生物氣(biogas)、丁醇作為生物能(Bio energy)而受到人們重視，上述的生物能雖然都能作為發(fā)電或運輸用燃料使用，但因為它們在實際應(yīng)用與生產(chǎn)方法上的若干缺點而使得作為新再生能源的烴(hydrocarbon)形態(tài)的化合物日益受到關(guān)注。因此，能夠以代謝產(chǎn)物的方式生成長鏈脂肪酸(long chain fatty acid)的重組菌株也日益受到人們關(guān)注。銅綠假單抱菌(Pseudomonas aeruginosa)是綠胺桿菌，1882年由Gessard在綠色的膿汁發(fā)現(xiàn)，由于形成綠色而被稱為綠膿桿菌。綠膿桿菌廣泛存在于自然界，可以從膿、咳痰、糞便、尿、膽汁、子宮分泌物、血、脊髓液等分離。銅綠假單孢菌綠膿桿菌的形態(tài)為革蘭陰性桿菌，培養(yǎng)時形成類似于莢膜的細胞外多糖粘質(zhì)層。形成類似于莢膜的細胞外多糖粘質(zhì)層。它是一種對自然界具有強大適應(yīng)能力的微生物。該菌生長所需營養(yǎng)條件非常單純。化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)能夠引起肺炎、咽喉炎、急性腎炎、毒性休克癥候群之類的疾病。脂肪酸(fatty acid)是具有I個羧基(-C00H)的烴鏈的羧酸，表示鏈狀I(lǐng)價羧酸(Carboxylic acid)。由于水解脂肪時生成而使用該名稱。脂肪酸分子由烴鏈(hydrocarbonchain)構(gòu)成，烴在碳的基本架 構(gòu)上以側(cè)鏈鏈接氫并且在一端附著羧基。在生體內(nèi)部，脂肪酸可由脂肪酸循環(huán)(fatty acid cycle)分解或合成。該循環(huán)以2個碳為單位合成或分解脂
肪酸，因此存在于自然界的脂肪酸幾乎大部分以雙數(shù)碳數(shù)形成。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 利用含有編碼化膿性鏈球菌來源的酰基(酰基載體蛋白質(zhì))硫酯酶的核苷酸的表達載體進行轉(zhuǎn)基因。
2.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 利用含有編碼銅綠假單孢菌的乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基的核苷酸與編碼化膿性鏈球菌的酰基(酰基載體蛋白質(zhì))硫酯酶的核苷酸的表達載體進行轉(zhuǎn)基因。
3.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 利用含有編碼銅綠假單孢菌的丙二酰-輔酶A-[酰基載體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶的核苷酸與編碼化膿性鏈球菌的酰基(酰基載體蛋白質(zhì))硫酯酶的核苷酸的表達載體進行轉(zhuǎn)基因。
4.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 利用含有編碼銅綠假單孢菌的乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基的核苷酸及編碼丙二酰-輔酶A-[酰基載體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶的核苷酸，含有編碼化膿性鏈球菌的酰基(酰基載體蛋白質(zhì))硫酯酶的核苷酸的表達載體進行轉(zhuǎn)基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4的任意一項所述的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 上述表達載體是具有圖2所記載的基因地圖的大腸桿菌-綠膿桿菌穿梭載體PUCP19。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到4的任意一項所述的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于，編碼上述酰基-酰基載體蛋白質(zhì)硫酯酶的核苷酸具有記載為序列編號:6的鹽基順序。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 上述編碼乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基的核苷酸具有記載為序列編號:2的鹽基順序。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 上述編碼丙二酰-輔酶A-[酰基載體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶的核苷酸具有記載為序列編號:4的鹽基順序。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到4的任意一項所述的脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌，其特征在于， 上述銅綠假單孢菌是銅綠假單孢菌PA14。
10.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌的制備方法，包括下列步驟: i)把編碼化膿性鏈球菌的酰基(酰基載體蛋白質(zhì))硫酯酶的核苷酸插入表達載體的步驟；及 ii)利用上述步驟i)的表達載體讓銅綠假單孢菌轉(zhuǎn)基因的步驟.
11.一種脂肪酸過量表達用銅綠假單孢菌的制備方法，包括下列步驟: i)把編碼乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基的核苷酸或編碼丙二酰-輔酶A-[酰基載體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶的核苷酸中的一個或兩個全部、及編碼化膿性鏈球菌的酰基(酰基載體蛋白質(zhì))硫酯酶的核苷酸插入表達載體的步驟；及 ii)利用上述步驟i)的表達載體讓銅綠假單孢菌轉(zhuǎn)基因的步驟。
12.一種脂肪酸生產(chǎn)方法，包括下列步驟: i)培養(yǎng)權(quán)利要求1到4的任意一項的銅綠假單孢菌后生物合成脂肪酸的步驟；及ii)獲取上述步驟i)中生物合成的脂肪酸的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種為了改善脂肪酸含量而開發(fā)的銅綠假單孢菌菌株及制備方法，更具體地，本發(fā)明涉及一種利用含有編碼銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)的乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基的核苷酸及/或編碼丙二酰-輔酶A-[酰基載體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶轉(zhuǎn)酰酶的核苷酸，及/或編碼化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的酰基(酰基載體蛋白質(zhì))硫酯酶的核苷酸的表達載體轉(zhuǎn)基因的銅綠假單孢菌及其制備方法。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的銅綠假單孢菌具有較高的遺傳穩(wěn)定性而且脂質(zhì)或脂肪酸含量非常高，因此適用于脂肪酸的批量生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/52GK103080297SQ201180020363
公開日2013年5月1日 申請日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者李辰遠, 李善熙, 全恩英 申請人:西江大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團