專利名稱：一種制備脂肪烷烴及其中間體烯烴的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。具體地，本發明涉及烴類化合物的制備方法。更具體地,本發明涉及一種微生物、一種適于轉化微生物的系統、一種制備重組微生物的方法、一種生產烴類化合物的方法、一種烴類化合物、以及一種制備生物燃料的系統。
背景技術：
第一代生物柴油，主要以動植物油脂為原料油，通過化學法或酶法催化的酯交換工藝來制備。這種生產方式的不足在于生產原料短缺、甲醇的使用以及甘油副產物的去除等問題。目前，在工業上用于制備生物柴油的主要油脂原料(如大豆油、菜籽油等)同時也是人類生活的必需品，而大量種植油料作物又受到耕地不足、糧食供應不足、天氣地理環境不適等多方面限制。第二代生物柴油，則是近年來隨著合成生物學和代謝工程的迅速發展，通過選擇合適的微生物并利用各種生物技術改造其代謝合成途徑(如脂肪酸合成途徑、異戊二烯合成途徑等)而獲得的。研究人員能利用微生物直接生產性能更加優越、品質更高的新型第二代生物柴油——長鏈烷烴。但是第二代生物柴油的生產仍然受到微生物自身代謝途徑的限制，得到的產物產量低、副產物多。目前利用生物方法生產燃料的方法，仍有待改進。

發明內容
本發明旨在解決現有技術的問題之一。為此，根據本發明的一個方面，本發明提出了一種微生物，其特征在于，包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列編碼聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體。 利用根據本發明實施例的微生物，能夠有效地生產烴類化合物。根據本發明的實施例，上述微生物還可以具有下列附加技術特征:根據本發明的一個實施例，進一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列編碼硫酯酶基因SgcElO或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，進一步包括第三核酸序列，其中，所述第三核酸序列編碼乙酰輔酶A羧化酶基因或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，所述乙酰輔酶A羧化酶基因為選自accA、accB、accC和accD的至少一種。根據本發明的一個實施例，進一步包括第四核酸序列，其中，所述第四核酸序列編碼烯醇還原酶基因mupE、fabl或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述微生物為大腸桿菌。
根據本發明的第二方面，本發明還提出了一種適于轉化微生物的系統。根據本發明的實施例，該適于轉化微生物的系統包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列編碼聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體。利用該系統，能夠轉化微生物，從而得到前述的微生物，進而可以有效地生產烴類化合物。根據本發明的實施例，上述適于轉化微生物的系統還可以具有下列附加技術特征:根據本發明的一個實施例，進一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列編碼硫酯酶基因SgcElO或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，所述第一核酸序列與所述第一核酸序列被設置于不同的載體上。根據本發明的一個實施例，進一步包括第三核酸序列，其中，所述第三核酸序列編碼乙酰輔酶A羧化酶基因或其功能等同體。
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根據本發明的一個實施例，所述乙酰輔酶A羧化酶基因為選自accA、accB、accC和accD的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述第一、第二和第三核酸序列被設置在相互不同的載體上。根據本發明的一個實施例，進一步包括第四核酸序列，其中，所述第四核酸序列編碼烯醇還原酶基因mupE、fabl或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，所述第一、第二、第三和第四核酸序列被設置在相互不同的載體上。根據本發明的一個實施例，進一步包括IPTG-誘導型啟動子，其中，所述第一、第二、第三或第四核酸序列的至少之一被設置在所述IPTG-誘導型啟動子的控制之下。根據本發明的一個實施例，所述IPTG-誘導型啟動子為選自T7啟動子、tac啟動子和Iac啟動子的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述微生物為大腸桿菌。根據本發明的第三方面，本發明提出了一種制備重組微生物的方法，其特征在于，包括使用前面所述的適于轉化微生物的系統轉化微生物，以便獲得所述重組微生物。利用該方法，能夠有效地制備重組微生物，該重組微生物能夠有效地生產烴類化合物。根據本發明的實施例，上述制備重組微生物的方法，還可以具有下列附加技術特征:根據本發明的一個實施例，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述微生物為大腸桿菌。
根據本發明的一個實施例，所述重組微生物包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列編碼聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，所述重組微生物進一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列編碼硫酯酶基因SgcElO或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，所述重組微生物進一步包括第三核酸序列，其中，所述第三核酸序列編碼乙酰輔酶A羧化酶基因或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，所述乙酰輔酶A羧化酶基因為選自accA、accB、accC和accD的至少一種。根據本發明的一個實施例，進一步包括第四核酸序列，其中，所述第四核酸序列編碼烯醇還原酶基因mupE或其功能等同體。根據本發明的第四方面，本發明還提出了一種生產烴類化合物的方法。根據本發明的實施例，該方法包括下列步驟:培養微生物，以便生產所述烴類化合物；以及分離所述烴類化合物，其中，所述微生物包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列編碼聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體。利用該方法，能夠有效地生產烴類化合物。根據本發明的實施例，上述用于生產烴類化合物的方法，還可以具有下列附加技術特征:根據本發明的一個實施例，所述微生物進一步包括第二核酸序列，其中，所述第二核酸序列編碼硫酯酶基因SgcElO或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，所述微生物進一步包括第三核酸序列，其中，所述第三核酸序列編碼乙酰輔酶A羧化酶基因或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，所述乙酰輔酶A羧化酶基因為選自accA、accB、accC和accD的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述烴類化合物具有化學式CxHy，其中x = 4-40的任意整數，y = 6-82的任意整數。根據本發明的一個實施例，所述烯烴化合物為十五烯烴。根據本發明的一個實施例，進一步包括第四核酸序列，其中，所述第四核酸序列編碼烯醇還原酶基因mupE、fabl或其功能等同體。根據本發明的一個實施例，所述烴類化合物為烷烴化合物。根據本發明的一個實施例，所述烴類化合物為十五烷烴。根據本發明的一個實施例，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種。根據本發明的一個實施例，所述微生物為大腸桿菌。根據本發明的一個實施例，進一步包括對所述烯烴化合物進行氫化的步驟。根據本發明的一個實施例，所述氫化反應是在10% Pd/C的作用下進行的。根據本發明的一個實施例，分離所述烴類化合物進一步包括:使所述烴類化合物進入有機相；以及從有機相中純化所述烴類化合物。根據本發明的第五方面， 本發明還提出了一種烴類化合物，其是通過前面所述的制備烴類化合物的方法制備的。根據本發明的實施例，該烴類化合物可以用作生物燃料。根據本發明的第六方面，本發明還提出了一種制備生物燃料的系統，包括:生物反應器，其中，所述生物反應器中設置有前面所述的微生物，用于在所述生物反應器中產生烴類化合物。根據本發明的實施例，上述用于制備生物燃料的系統還可以具有下列附加技術特征:根據本發明的一個實施例，進一步包括:氫化裝置，所述氫化裝置與所述生物反應器相連，以便從所述生物反應器接收所述烴類化合物，并對所述烴類化合物進行氫化。根據本發明的一個實施例，所述氫化裝置中設置有10% Pd/C,以便催化所述氫化反應。根據本發明的一個實施例，所述氫化裝置為耐高溫高壓的反應容器。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。


本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1顯不了質粒 pWKl的基本構造，SgcE基因克隆于pET28a載體,基因片段的兩端帶有BamH I和HindIII位點。圖2顯示了質粒pWK2的基本構造，SgcElO基因克隆于pET28a載體，基因片段的兩端帶Nde I和Spe 1、Xho I位點。圖3顯示了質粒pWK3的基本構造，SgcElO基因克隆于pET28a載體，基因片段的兩端帶Nde I和Spe 1、Xho I位點。圖4顯示了質粒pWK4的基本構造，SgcE和SgcElO基因串聯克隆于pET28a載體，基因片段的兩端帶Xba I和Xho I位點。圖5顯示了質粒pWK7的基本構造，sgcE, SgcElO和mupE基因串聯克隆于pET28a載體，基因片段的兩端帶Xba I和Xho I位點。圖6顯示了大腸桿菌WKl經IPTG誘導后，其培養物進行提取后的GC-MS結果圖。目標分子C15H32已經用箭頭指出。圖7顯示了大腸桿菌WK2經IPTG誘導后，其培養物進行提取后的LC-APC1-MS結果圖。圖中M/Z = 199.14827即為目標分子C15H18。圖8顯示了大腸桿菌WK2經IPTG誘導后，其培養物進行提取后的GC-MS結果圖。目標分子C15H32已經用箭頭指出。圖9顯示了大腸桿菌WK3經IPTG誘導后，其培養物進行提取后的LC-APC1-MS結果圖。圖中M/Z = 201.16383即為目標分子C15H200圖10顯示了大腸桿菌WK3經IPTG誘導后，其培養物進行提取后的LC-APC1-MS結果圖。圖中M/Z = 205.19503即為目標分子C15H24。
具體實施例方式下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。縮寫及術語提供下列關于術語和方法的解釋一遍更好的描述本發明，并指導本領域普通技術人員實施本發明。本文使用的“包括”表示“包含”，單數形式的“一個”，除非上下明確的另外指出。例如，“包括一個細胞”指包含一個或者多個這類細胞，“包括硫酯酶”指包含一種或者多種硫酯酶肽以及本領域普通技術人員已知的其同等物，等等。術語“或者”是指陳述的可選擇要素或者兩個或更多個要素組合中的單個要素，除非上下文明確的另外指出。例如短語“生物燃料或者其中間體”是指生物燃料、生物燃料中間體或者生物燃料和生物燃料中間體兩者的組合。除非另外解釋，所有本文使用的技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員通常的理解具有相同的含義。盡管與本文描述的類似或者等同的方法和材料可用于本發明的實施或者實驗，但下文描述了適合的方法和材料。所述材料、方法和實施例子只是說明性的，而不是用于限制。根據下面的詳細說明和權利要求，本發明的其他特征將是明顯。登錄號:貫穿本說明書的登錄號來源于美國國立衛生研究院維護的NCBI數據庫(國立生物技術信息中心)。所述登錄號是2011年3月I日由該數據庫提供的。酶分類號(EC):貫穿本說明書提供的EC編號來自京都基因與基因百科全書(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomics)維護的KEGG Ligand數據庫,這由東京大學部分資助。所述EC編號是2011年3月I日由該數據庫提供的。碳源:通常指適合作為原核生物或者簡單真核生物細胞生長的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各種形式，包括但不限于聚合物，糖、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽，等等。這些包括，例如，各種單糖諸如葡萄糖、低聚糖、多糖、纖維素質、木糖和阿拉伯糖，二糖，諸如蔗糖、飽和或者不飽和的脂肪酸、琥珀酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽、乙醇，等等，或者其混合物。此外，碳源還可以是光合作用產物，包括但不限于葡萄糖。可檢測的:能夠確定出現或者存在。例如，使用下面實施例子提供的方法，從發酵液中產物是可檢測的。DNA:脫氧核糖核酸。DNA是長鏈聚合物，其包括大部分的有機體(一些病毒具有包括核糖核酸RNA的基因)的遺傳物質。DNA聚合物中的重復單位是4種不同的核苷酸，其包括4中堿基，腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一種，所述堿基上結合有脫氧核糖，而磷酸基與所述脫氧核糖連接。DNA分子中被稱為密碼子的是核苷酸三聯體編碼肽的氨基酸。術語密碼子還指mRNA中3核苷酸的對應(和互補)序列，所述DNA序列被轉錄成所述mRNAo內源的:當在本文中對核酸分子和特定的細胞或者微生物使用時，是指位于細胞內的核酸序列或者肽，其不是利用重組工程技術導入細胞的。例如，當細胞最初從自然界分離時，已經存在于所述細胞中的基因。即使調控序列諸如激活轉錄或者翻譯的啟動子或者增強子序列已經通過重組技術被改變，基因仍被認為是內源的。外源的:本文中對核酸分子和特定的細胞使用時，是指不是來源于自然界發現的特定細胞的任意核酸分子。因此，一旦非天然存在的核酸分子被引入細胞，則其被認為是外源的。對特定細胞來說，天然存在的核酸分子也可以是外源的。例如，一旦從細胞X分離的完整編碼序列被引入細胞Y，則該編碼序列對細胞Y來說是外源核酸，即使X和Y是相同的細胞類型。表達:基因的編碼信息被轉變為細胞的結構與功能諸如蛋白、轉移RNA或者核糖體RNA的過程。表達的基因包括那些被轉錄為mRNA然后被翻譯為蛋白的基因，以及那些被轉錄為RNA但不被翻譯為蛋白的基因(例如，轉移和核糖體RNAs)。發酵肉湯:包括任意支持微生物生命(即主動代謝碳的微生物)的培養基。發酵培養基通常包含碳源。碳源是可以被微生物用作(利用或者不利用其他的酶)能量的任何物。烴:包括那些包含元素碳(C)和氫(H)的化合物。所有的烴都由碳骨架以及與該骨架連接的氫原子構成。有時，該術語被用作術語“脂肪烴”的簡稱。基本上存在3種類型的烴:(1)芳香族烴，其具有至少一個芳香環；(2)飽和烴，亦稱為烷，其缺少雙鍵、三鍵或者芳香鍵；和(3)不飽和烴，其在碳原子之間具有一個或者多個雙鍵或者三鍵，被分成:烯烴、炔和二烯。液體的地質提取的烴被稱作石油或者礦物油，而氣態的地質烴被稱作天然氣。所有這些均是作為制備有機化學品的原料的燃料和原材料的主要來源，它們通常是石油地質工具在地球表面下發現的。沉積巖中的石油儲備是用于能源和化學工業的烴的主要來源。烴在經濟上非常重要，因為它們包括了主要化石燃料(煤、石油、天然氣，等等)和生物燃料以及塑料、蠟、溶劑和油類的成分。分離的:“分離的”生物學組分(諸如核酸分子、蛋白或者細胞)已經基本上從該組分天然存在的其他生物學組分中分離 或者純化，諸如其他染色體的和染色體外的DNA和RNA,以及蛋白。已經被“分離的”核酸分子和蛋白包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白。該術語還包括在宿主細胞中利用重組表達制備的核酸分子和蛋白，以及化學合成的核酸分子和蛋白。微生物:包括來自古細菌域、真細菌域和真核生物域的原核和真核微生物種，后者包括酵母和絲狀酵母、原生動物、藻類或者更高等的原生生物。術語“微生物細胞”可以與“微生物”互換使用。核酸分子:包括RNA和DNA分子，其包括但不限于，cDNA、基因組DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，例如那些化學合成或者重組產生的核酸分子。核酸分子可以是雙鏈或者單鏈的。單鏈時，核酸分子可以是正義鏈或者反義鏈。此外，核酸分子可以是環狀或者線性的。可操作的連接:當第一核酸序列與第二核酸序列具有功能關系時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作的連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或者表達，則所述啟動子與所述編碼序列為可操作的連接。通常，可操作連接的DNA序列是連接的，并且必要時在相同閱讀框內連接兩個蛋白編碼區域。作為單個信使RNA串聯轉錄的分離基因的結構被稱為操縱子。因此將基因緊密相鄰置于單個啟動子的轉錄調節下，例如在質粒載體中，則構成合成操縱子。ORF(開放閱讀框):不含任何終止密碼子的一系列編碼氨基酸的核苷酸三聯體(密碼子)。這些序列通常可以被翻譯為肽。
過表達:當基因的轉錄速率與其內源轉錄速率相比提高的時候。在一些實例中，過表達還包括基因的翻譯速率高于該基因的內源翻譯速率。檢測過表達的方法是本領域公知的。例如可以利用RT-PCR評價轉錄的RNA水平，以及利用SDS-PAGE凝膠分析評價蛋白水平。純化的:術語“純化的”并不需要絕對的純度；它只是一個相對術語。因此，例如，純化的生物燃料或其中間體是指比位于其細胞環境內的產物濃度更高的產物。重組:重組核酸分子或者蛋白，其具有非天然存在的序列，具有由人工組合序列的兩個另外分離的序列片段制備的序列，或者以上兩者。例如可以通過化學合成或者人工操作核酸分子或者蛋白的分離片段，諸如遺傳工程技術，實現這種人工組合。重組還用于描述以下核酸分子，它們已經被人工處理，但包含的調控序列和編碼區與分離所述核酸的生物體中發現的相同。重組細胞或者微生物是包含外源核酸分子諸如重組核酸分子的細胞或者微生物。轉化或者重組細胞:例如通過分子生物學技術，已經被引入核酸分子(諸如編碼酰基輔酶A合酶的核酸分子)的細胞。轉化包括能夠將核酸分子引入這類細胞的所有技術，包括但不限于，利用病毒載體轉染、接合作用、利用質粒載體轉化、通過電穿孔的裸DNA引入、脂質體轉染和顆粒槍加速。在允許產物生成的條件下:任何允許微生物產生所需產物(諸如烷烴、烯烴等)的發酵條件。發酵條件通常包括溫度范圍、通氣水平和培養基選擇，將上述條件組合時允許微生物生長。示例性培養基包括肉湯或者凝膠。通常，培養基包括碳源諸如葡萄糖、果糖、纖維素或者可以被微生物直接代謝的類似物，或者可以在培養基中使用促進代謝碳源的酶。為了確定培養條件是否允許產物生成，將微生物培養8、16或者24小時，收集并分析樣品。例如，可以檢測樣品或者培養基 (細胞在其中生長)的細胞中所需產物存在。當分析產物的存在時，可以使用下面實例提供的那些方法。載體:作為引入細胞從而產生轉化細胞的核酸分子。載體可以包括允許其在細胞中復制的核酸序列，諸如復制原點。載體還可以包括一種或者多種選擇性標志物基因和本領域已知的其他遺傳成分。在本發明中所使用的術語“第一”、“第二”等類似的術語，是為了區別的目的，而不以任何方式表明或者暗示各自所表示術語之間的重要性的區別。微牛物根據本發明的第一方面，本發明提出了一種微生物。該微生物，包括第一核酸序列。該第一核酸序列編碼聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體。利用該微生物，可以通過在微生物細胞內過表達聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體，從而發揮聚酮合酶的生物活性，進而聚酮合酶可以與宿主微生物體內的固有基因相互作用，從可再生碳源產生烴類化合物。發明人發現，利用該微生物所得到的烴類化合物可以作為生物燃料或者其中間體。在本文中所使用的術語“功能等同體”是指這樣的一種基因，其能夠在宿主細胞內發揮與例如SgcE相同的功能，但在序列上與例如SgcE有所區別的基因，從而利用該功能等同體也能夠有效地生產烴類化合物。通過在微生物中引入外源DNA序列，可以在微生物細胞內表達具有生物活性的蛋白，這些蛋白能夠代謝可再生碳源以產生烴類化合物作為生物燃料或其中間體。因此，可以將這些微生物用于生產烴類化合物，以便得到可以作為生物燃料或者生物燃料中間體的烴類化合物。根據本發明的實施例，第一核酸序列不受特別限制，只要其能夠編碼SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(即NCBI登錄號:AAL06699.1所描述的SgcE蛋白序列)即可。根據本發明的具體示例，第一核酸序列具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，發明人驚奇地發現，當采用該核苷酸序列時，SgcE基因在微生物細胞尤其是在大腸桿菌細胞中的表達效率可以得到顯著地提高，進而可以進一步提高生產烴類化合物的效率。根據本發明的實施例，在微生物中還可以進一步包含編碼其他基因的核酸序列，從而賦予微生物額外的功能。根據本發明的實施例，在微生物中進一步包括第二核酸序列，該第二核酸序列編碼硫酯酶基因SgcElO或其功能等同體。由此，通過硫酯酶基因SgcElO的生物學功能，可以便于所合成的烴類化合物成為游離狀態，從而便于最終分離回收烴類化合物，從而可以顯著地提高，將這些微生物應用于制備烴類化合物時的生產效率。根據本發明的實施例，第二核酸序列不受特別限制，只要其能夠編碼SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(即NCBI登錄號:AAL06692.1所描述的SgcElO蛋白序列)即可。根據本發明的具體示例，第二核酸序列具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，發明人驚奇地發現，當采用該核苷酸序列時，SgcElO基因在微生物細胞尤其是在大腸桿菌細胞中的表達效率可以得到顯著地提高，進而可以進一步提高生產烴類化合物的效率。根據本發明的一個實施例，在該微生物中，可以進一步包含第三核酸序列。該第三核酸序列編碼乙酰輔酶A羧化酶基因或其功能等同體。根據具體的示例，所采用的乙酰輔酶A羧化酶基因為選自accA、accB、accC和accD的至少一種。由此,可以顯著提高利用該微生物生產烴類化合物的生產效率。根據本發明的一個實施例，在該微生物中，還可以進一步包括第四核酸序列。該第四核酸序列編碼烯醇還原酶基因mupE、fabl或其功能等同體。通過在該微生物的細胞中過表達烯醇還原酶基因mupE、fabl或其功能等同體，可以在微生物細胞內就能夠完成對所合成烴類化合物的氫化過程，由此，可以直接獲得飽和度較高的烴類化合物，更適于作為生物燃料，從而可以顯著提高生物燃料的制備效果。根據本發明的實施例，優選過表達FabI或其功能等同體，發明人驚奇地發現，FabI在微生物細胞內能夠實現更好的兼容性，從而與MupE相比能夠具有更高的烴類化合物生產效率。根據本發明的實施例，第四核酸序列不受特別限制，只要其能夠編碼SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(即NCBI登錄號:AAM12917.1所描述的MupE蛋白序列)即可。根據本發明的具體示例，第四核酸序列具有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，發明人驚奇地發現，當采用該核苷酸序列時，mupE基因在微生物細胞尤其是在大腸桿菌細胞中的表達效率可以得到顯著地提高，進而可以進一步提高生產烴類化合物的效率。在本發明中，所使用的術語“微生物”可以為真核微生物，也可以為原核微生物。其類型并不受特別限制。例如，根據本發明的實施例，可以采用的微生物包括但不限於細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母。可以為上述微生物的至少一種。根據本發明的實施例，優選采用大腸桿菌作為生產生物燃料的微生物。適于轉化 微生物的系統、制備重組微生物的方法根據本發明的實施例，可以通過常規的分子生物學方法獲得上述微生物。由此，本發明還提出了一種適于轉化微生物的系統。利用該系統可以通過常規的方法，將目的基因引入微生物細胞中，從而得到前面所述的適于制備烴類化合物的微生物。根據本發明的實施例，該系統包括第一核酸序列，該第一核酸序列編碼聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體。由此，可以通過常規的分子生物學手段，將第一核酸序列引入到微生物中，從而可以在微生物細胞中過表達聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體。進一步可以通過在微生物細胞內過表達聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體，從而發揮聚酮合酶的生物活性，進而聚酮合酶可以與宿主微生物體內的固有基因相互作用，從可再生碳源產生烴類化合物。另外，為了在微生物細胞中引入其他的核酸序列，從而為所得到的重組微生物賦予額外的生物學功能。根據本發明的實施例，在該適于轉化微生物的系統中，還可以具有其他的核酸序列。根據本發明的實施例，在該適于轉化微生物的系統中進一步包括第二核酸序列，該第二核酸序列編碼硫酯酶基因SgcElO或其功能等同體。從而可以借助該適于轉化微生物的系統，在微生物中引入硫酯酶基因SgcElO或其功能等同體。由此，通過硫酯酶基因SgcElO的生物學功能，可以便于所合成的烴類化合物成為游離狀態，從而便于最終分離回收烴類化合物，從而可以顯著地提高，將這些微生物應用于制備烴類化合物時的生產效率。根據本發明的一個實施例，在該適于轉化微生物的系統中，可以進一步包含第三核酸序列。該第三核酸序列編碼乙酰輔酶A羧化酶基因或其功能等同體。根據具體的示例，所采用的乙酰輔酶A羧化酶基因為選自accA、accB、accC和accD的至少一種。由此,可以通過借助該適于轉化微生物的系統，在微生物細胞中引入乙酰輔酶A羧化酶基因或其功能等同體，從而借助乙酰輔酶A羧化酶基因的生物學功能，可以顯著提高利用該微生物生產烴類化合物的生產效率。根據本發明的一個實施例，在該適于轉化微生物的系統中，還可以進一步包括第四核酸序列。該第四核酸序列編碼烯醇還原酶基因mupE、fabl或其功能等同體。借助該適于轉化微生物的系統，能夠有效地將適于轉化微生物的系統引入到微生物細胞中。通過在該微生物的細胞中過表達烯醇還原酶基因mupE、fabl或其功能等同體,可以在微生物細胞內就能夠完成對所合成烴類化合物的氫化過程，由此，可以直接獲得飽和度較高的烴類化合物，更適于作為生物燃料，從而可以顯著提高生物燃料的制備效果。根據本發明的實施例，優選過表達FabI或其功能等同體，發明人驚奇地發現，FabI在微生物細胞內能夠實現更好的兼容性，從而與MupE相比能夠具有更高的烴類化合物生產效率。借助上述適 于轉化微生物的系統，轉化微生物的方法，并不受特別限制，可以為諸如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體介導的轉染、接合作用、轉導等等，可以將異源DNA序列(即前面所述的第一、第二、第三和第四核酸序列)穩定地或者瞬時引入宿主細胞，所述異源DNA序列參與產生生物燃料或其中間物。根據本發明的實施例，對于穩定轉化，異源DNA序列還包括選擇性標志物，諸如，抗生素抗性，例如新霉素、四環素、氯霉素、卡那霉素的抗性，彌補營養缺陷型的基因等等。由此，根據本發明的實施例，本發明還提供了一種獲得重組微生物的方法，該方法包括使用前面適于轉化微生物的系統轉化微生物，以便獲得所述重組微生物。由此，根據本發明實施例，所得到的重組微生物中可以包含異源核酸序列，例如第一、第二、第三和第四核酸序列。關于這些核酸序列，前面已經進行了詳細描述，在此不再贅述。根據本發明的實施例，將上述異源DNA序列(即前面所述的第一、第二、第三和第四核酸序列)引入宿主細胞的順序并不受特別限制。既可以是同時引入到微生物細胞中，也可以是依次引入到微生物細胞中。根據本發明的實施例，可以將各個異源DNA序列設置在不同的載體上，例如各個核酸序列包含在不同的載體上。這些載體可以是本領域中任何已知的表達載體。合適的表達載體包括，但不限于，病毒載體，諸如桿狀病毒載體，曬菌體載體，諸如噬菌體載體，質粒，噬菌體，粘粒，fosmids，細菌人工染色體，病毒載體(例如，基于以下病毒的病毒載體:牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒、腺病毒、腺相關病毒、SV40、單純皰疹病毒，等等)，基于Pl的人工染色體，酵母質粒，酵母人工染色體，和任意對目的特定宿主具有特異性的其他載體(諸如大腸桿菌、Pseudomonas pisum和釀酒酵母)。根據本發明的實施例，表達載體上可以進一步包括一種或者多種選擇性標志基因，以提供用于選擇轉化宿主細胞的表型性狀。所述選擇性標志基因編碼在選擇性培養基中生長的轉化宿主細胞存活或者生長必需的蛋白。沒有轉化包含選擇性標志基因的載體的宿主細胞將不會在培養基中存活。通常的選擇基因編碼以下蛋白:(a)提供對抗生素或者其他毒素的抗性，例如，氨芐青霉素，新霉素，甲氨喋呤或者四環素，(b)彌補營養缺陷型缺陷，或者(C)提供復合培養基沒有的重要營養物，例如，編碼桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。在可選的實施方式中，選擇性標志基因是提供氨芐青霉素或者卡那霉素抗性(用于原核宿主細胞，諸如大腸桿菌)的基因。根據本發明的實施例，該適于轉化微生物的系統可以進一步包括表達調控序列(啟動子，增強子，等等)，以指導所編碼基因產物的合成，優選啟動子，更優選IPTG-誘導型啟動子。所述第一、第二、第三或第四核酸序列的至少之一被設置在所述IPTG-誘導型啟動子的控制之下。由此，可以通過在IPTG-誘導型啟動子的控制下，由此容易通過啟動子的調控，表達目的蛋白，從而實現烴類化合物的合成。根據本發明的實施例，可以用于本發明的啟動子可以來源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。根據使用的宿主/載體系統，表達載體可以使用大量合適的轉錄和翻譯控制元件中的任意一種，包括組成型和誘導型啟動子，轉錄增強子元件，轉錄終止子，等等(參見例如，Bitter et al.，Methods inEnzymology,153:156-544,1987，通過參照并入本文)。根據本發明的實施例，用于原核宿主細胞的合適啟動子包括，但不限于，能夠識別T4、T3、Sp6和17聚合酶的啟動子，噬菌體入的PR和PL啟動子，大腸桿菌的trp、recA、熱休克和IacZ啟動子，枯草芽孢桿菌的a -淀粉酶和E特異性啟動子，桿菌噬菌體啟動子，鏈霉菌啟動子，噬菌體入的int啟動子，pBR322 P -內酰胺酶基因的bla啟動子，和氯霉素乙酰轉移酶基因的CAT啟動子。原核啟動子的綜述可參見Glick，J.1nd.Microbiol.1:277，1987 ；ffatson et al.,Benjamin Cummins (1987);和Sambrook et al.，上文，通過參照并入本文。根據本發明的實施例，用于真核宿主內使用的合適真核啟動子的非限制性實例來源于病毒，包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子；皰疹病毒的TK啟動子；SV40早期啟動子；Rous肉瘤病毒啟動子；巨細胞病毒啟動子；酵母gal4基因啟動子；和IgG啟動子。根據本發明的實施例，合適的誘導型啟動子包括不限于，受體蛋白、代謝物或者化學制品影響的啟動子。這些包括:牛白血病病毒啟動子，金屬硫蛋白啟動子，地塞米松誘導型MMTV啟動子，SV40啟動子，MRP pol III啟動子，四環素誘導型CMV啟動子以及那些來自trp和Iac操縱子的啟 動子。根據本發明的一些實施例，前述的核酸序列可以被連接到組成型啟動子上。因而利用該系統轉化微生物所得到的重組微生物能夠持續地表達外源基因，從而代謝合成烴類化合物。
根據本發明的實施例，上述適于轉化微生物的系統，可以轉化的微生物的類型并不受特別限制。可以為真核微生物，也可以為原核微生物。其類型并不受特別限制。例如，根據本發明的實施例，可以采用的微生物包括但不限於細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母。可以為上述微生物的至少一種。根據本發明的實施例，優選用于轉化大腸桿菌，以便用于生產生物燃料。烴類化合物及其生產方法和系統根據本發明的實施例，本發明還提出了一種生產烴類化合物的方法。該方法包括包括下列步驟:培養微生物，以便生產所述烴類化合物；以及分離所述烴類化合物，其中，所述微生物包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列編碼聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體。通過在合適的條件下對根據本發明實施例的微生物進行培養，在微生物細胞中表達聚酮合酶SgcE或其功能等同體的作用下，微生物細胞通過對底物的代謝，可以合成烴類化合物。本領域技術人員可以通過對微生物以及所采用的外源核酸的載體進行分析，能夠獲得最適合的培養條件。另外，根據本發明的實施例，微生物中還可以包含額外的核酸序列，例如第一、第二、第三和第四核酸序列。關于這些核酸序列，前面已經進行了詳細描述，在此不再贅述。根據本發明的實施例，可以通過在培養微生物的過程中，提高生物合成途徑中間物的細胞內濃度(例如，遺傳修飾的宿主細胞的中間物濃度)以進一步提高終產物的產量。有許多方式可以增加中間物的胞內濃度，包括不限于，增加培養基中生物合成途徑底物的濃度；增強在生物合成途徑中起·作用的酶的催化活性；增加底物(例如，初始底物)的細胞內濃度，所述底物是在生物合成途徑中起作用的酶的底物；等等。通過本發明生產烴類化合物的方法，可以有效地獲得具有化學式CxHy的烴類化合物，其中X = 4-40的任意整數，y = 6-82的任意整數。根據具體的示例，可以有效地獲得十五烯烴。根據本發明的實施例，通過在微生物中引入第四核酸序列，即所述第四核酸序列編碼烯醇還原酶基因mupE、FabI或其功能等同體。可以有效地在微生物細胞中實現對烯烴的還原，獲得烷烴化合物，例如十五烷烴。根據本發明的實施例，優選過表達FabI或其功能等同體，發明人驚奇地發現，FabI在微生物細胞內能夠實現更好的兼容性，從而與MupE相比能夠具有更高的烴類化合物生產效率。另外，根據本發明的實施例，對于微生物所生產的烯烴，例如十五烯烴。可以通過氫化反應的化學處理方法，實現將其還原為烷烴。根據具體的實例，可以采用10% Pd/C作為催化劑，完成該氫化反應。因此，根據本發明的實施例，可以有效地獲得生物燃料，或者其中間體。因此可以在產生有用生物燃料或其中間體的發酵過程中使用經過修飾的微生物，并且可以利用可再生碳源(生物質)作為起始原料。根據本發明的實施例，所采用的微生物的類型不受特別限制。可以為真核微生物，也可以為原核微生物。例如，根據本發明的實施例，可以采用的微生物包括但不限於細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母。可以為上述微生物的至少一種。根據本發明的實施例，優選采用大腸桿菌，以便用于生產生物燃料。這是因為對于大腸桿菌或酵母而言，易于遺傳修飾，易于控制生長、產生以及減少或者消除降低生物合成途徑效率的副反應。此外，這種修飾的微生物可以直接利用可再生能源以生產可直接用做生物燃料的燃料，不需要專門的儲存或運輸方法。通過使用特定的發酵技術可以增強生物燃料或者其中間體的生產和分離。例如，將產生最大化并降低成本的方法是增加碳源百分比，所述碳源被轉變為烴類產物。在正常的細胞生命周期中，碳被用于細胞功能包括產生脂、糖、蛋白、有機酸和核酸。降低生長相關活性必需的碳的量可以增加碳源轉變為輸出物的功效。這可以通過首先增殖微生物到所需密度來實現，諸如在對數生長期的頂峰實現的密度。在這個時間點，復制檢查點基因可用于終止細胞生長。輸入的碳數轉變為烴類產物的百分比是成本動因。效率越高(即百分比更高)，則方法越低廉。對于含氧碳源(即基于葡萄糖和其他糖的來源)，氧必須以二氧化碳的形式釋放。每釋放2個氧原子，還釋放一個碳原子，導致約34% (w/w)的最大理論代謝效率。但是對于其他烴類產物和碳源來說，該數字是變化的。文獻中通常的效率是約小于5%。生成烴類產物的工程化微生物可以具有大于1%、3%、5%、10%、15%、20%、25%和30%的效率。可以從發酵培養基中分離發酵期間生成的生物燃料或其中間體。可以使用任何已知的從水介質分離烴類化合物的技術。本文提供一個示例性分離法是兩相(雙相)分離法。該方法涉及在足以產生生物燃料或者其中間體的條件下發酵遺傳工程化的制備宿主，允許在有機相中收集生物燃料或者其中間體并從水性發酵肉湯分離有機相。雙相分離利用生物燃料或者其中間體的相對不混溶性促進分離。不混溶是指化合物相對不能溶于水，由化合物的分配系數定義。分配系數P被定義為化合物在有機相(在雙相系統中，有機相通常是生成過程中由生物燃料或者其中間體形成的相，但是，在一些實例中可以提供有機相(諸如乙酸乙酯以促進產物分離))中的平衡濃度除以水相(即發酵肉湯)中處于平衡狀態 的濃度。當描述兩相系統時，通常采用1gP來描述P。1gP為10的化合物將為有機相分配10: 1，而1gP為0.1的化合物將為水相分配10: 1.本領域普通技術人員將理解，通過選擇發酵肉湯和有機相使生成的烴類化合物具有高1gP值，即使發酵容器中濃度非常低，烴類化合物也將進入有機相。通過本文所述方法產生的烴類化合物在發酵肉湯以及細胞質中是相對不混溶的。因此，烴類化合物會在胞內或者胞外于有機相中聚集。產物在有機相中的聚集將削弱烴類化合物對細胞功能的影響，這將允許制備宿主產生更多的產物。換言之，烴類化合物的濃度不會對宿主細胞有顯著的影響。根據本發明的實施例，本發明還提供了一種烴類化合物，其實通過前述的制備烴類化合物的方法所得到。根據具體的實施例，該烴類化合物，可以用作生物燃料。根據本發明實施例的烴類化合物可以用作生物燃料或者其中間物，即為烷烴或者烯烴。為烷烴者可以直接用作燃料，而為烯烴者則可以通過加氫還原或者酶催化法得到烷烴再用于燃料。本領域普通技術人員將理解，根據燃料的預定目的，可以制備和使用不同的烴類化合物。例如，對于預期在寒冷氣候中使用的汽車燃料，可能希望支化烷烴，因此利用本文提供的教導，可以制備支化烴。利用本文描述的方法，可以制備包括產物單一的烷烴類燃料，其具有需要的燃料質量。與石油衍生的燃料或者源自甘油三酯的生物柴油相比，它們不含雜質，此外，基于烷烴類燃料可以與其他燃料或者燃料添加劑組合以產生具有所需性質的燃料。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種制備生物燃料的系統，其包括生物反應器和氫化裝置。根據本發明的實施例，生物反應器中設置有根據本發明的微生物，這些微生物用于在生物反應器中產生烴類化合物。根據本發明的實施例，氫化裝置與生物反應器相連，可以從生物反應器中接受烴類化合物，從而實現對烴類化合物的氫化。如前所述，可以通過化學處理地方法實現對烴類化合物的氫化，例如可以在氫化裝置中設置有10% Pd/C，以便催化所述氫化反應。為此，根據本發明的一個實施例，氫化裝置可以為耐高溫高壓的反應容器，由此，可以實現有效地將烴類化合物進行氫化處理。關于在該系統中所采用的微生物，前面已經進行了詳細描述，此處不再贅述。下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1構建下列質粒用于在BL21(DE3)宿主細胞中引入外源核酸序列。所有被克隆的基因均在IPTG-誘導型啟動子(T7，tac或者Iac啟動子)的控制下。在本實施例中引入了聚酮合酶基因sgcE(SEQ ID NO:1)0聚酮合酶基因SgcE表達蛋白聚酮合酶SgcE (SEQ ID NO:5)。外源的聚酮合酶與烯醇-ACP-還原酶基因fabl (SEQIDNO:2)表達得到的烯醇-ACP-還原酶FabI (SEQ ID NO:6)相互作用可以合成十五烷。按照標準分子生物學方法，進行基因的克隆和載體的構建，簡言之，包括下列步驟:將sgcE基因克隆于pET28a上。質粒質粒pWKl (圖1)是SgcE基因通過BamH I和HindIII克隆于pET28a載體而得到的。將構建得到的質粒pWKl轉化到含質粒pMSD8的大腸桿菌BL21 (DE3)中，得到大腸桿菌菌株WKl。實施例2，生產作為生物燃料的烴類化合物在37攝氏度過夜培養的大腸桿菌WKl種液，按體積比1: 100的比例稀釋到200ml的LB培養基中；在37攝氏度培養3小時后，在大腸桿菌WKl的0D600為0.4-0.6時，加入IPTG (異丙基-P -D-硫代半乳糖苷)至終濃度為0.1mM ;在加入IPTG誘導15-20小時后，用乙酸乙酯萃取菌液，有機相回收后旋轉蒸發溶劑干燥至l_2ml。樣品經0.22 濾膜過濾后，用GC-MS檢測。實驗結果:在大腸桿菌WKl菌體沉淀中可以明顯的檢測到生物柴油正十五烷C15H32 (圖6)。說明通過在大腸桿菌中引入sgcE，能夠有效地得到烷烴化合物。實施例3在本實施例中引入了聚酮合酶基因sgcE (SEQ ID NO:1)和硫酯酶基因SgcElO (SEQIDNO:3)。聚酮合酶基因sgcE和硫酯酶基因SgcElO分別表達蛋白為聚酮合酶SgcE(SEQIDNO:5)和硫酯酶 SgcElO (SEQ ID NO:7)。
按照標準分子生物學方法，進行基因的克隆和載體的構建，簡言之，包括下列步驟:將SgcElO基因克隆于pET28a上。質粒pWK2 (圖2)是SgcElO基因通過Nde I和XhoI克隆于pET28a載體而得到的。sgcE和SgcElO基因串聯克隆于pET28a載體上。以SpeI和Xho I酶切質粒pWK2，回收線性DNA片段；以Xba I和Xho I酶切質粒pWKl后，回收sgcE基因片段；將sgcE基因片段和pWK2載體片段相連接，轉化入大腸桿菌，通過卡那霉素抗性篩選和酶切驗證鑒定sgcE片段正確插入的克隆，即得到質粒pWK4(圖4)。將構建得到的質粒pWK4轉化到含質粒pMSD8的大腸桿菌BL21 (DE3)中，就得到大腸桿菌菌株WK2。實施例4生產作為生物燃料中間體的烴類化合物在37攝氏度過夜培養的大腸桿菌WK2種液，按體積比1: 100的比例稀釋到200ml的LB培養基；在37攝氏度培養3小時后，大腸桿菌WK2的0D600為0.4-0.6時，力口A IPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)至終濃度為0.1mM;在加入IPTG誘導15-20小時后，用乙酸乙酯萃取菌液，有機相回收后旋轉蒸發溶劑干燥至l_2ml。樣品經0.22 濾膜過濾后，用LC-APC1-MS檢測。實驗結果:在大腸桿菌WK2菌體沉淀中可以明顯的檢測到生物柴油前體十五烯C15H18 (圖7)和少量的C15H32 (圖8)。結果顯示通過基因工程改造的大腸桿菌WK2能用于生產生物柴油前體十五烯C15H1815將得到的烯烴進行加氫還原可以得到C15H3215簡言之:將得到的烯烴沉淀收集在能耐高溫高壓的500ml圓底燒瓶中，加入10% Pd/C。將反應容器密封，排除空氣，5分鐘后通入氫氣，使壓力在25攝氏度下上升到35psi，邊反應邊攪拌反應物直到不能在觀察到液滴，反應大約需要16個小時來完成。實施例5在本實施例中引入了聚酮合酶基因sgcE (SEQ ID NO:1)、硫酯酶基因sgcE10(SEQIDNO:3)和烯醇還原酶基因mupE(SEQ ID NO:4)。聚酮合酶基因sgcE、硫酯酶基因SgcElO和烯醇還原酶基因mupE分別表達蛋白為聚酮合酶SgcE (SEQ ID NO:5)、硫酯酶SgcElO (SEQIDNO:7)和烯醇還原酶 MupE (SEQ ID NO:8)。按照標準分子生物學方法，進行基因的克隆和載體的構建，簡言之，包括下列步驟:A)將mupE基因克隆于pET28a上pWK3(圖3)mupE基因通過Nde I和Xho I克隆于pET28a載體而得到的。B) sgcE、SgcElO和mupE基因串聯克隆與pET28a載體上按照上面B)中同樣的方法，以Spe I和Xho I酶切質粒pWK3，回收線性DNA片段；以Xba I和Xho I酶切質粒pWK4后，回收sgcE10+sgcE基因片段；將sgcE10+sgcE基因片段和PWK3載體片段相連接，轉化入大腸桿菌，通過卡那霉素抗性篩選和酶切驗證鑒定sgcE10+sgcE片段正確插入的克隆，即得到質粒pWK7(圖5)。將構建得到的質粒pWK7轉化到含質粒pMSD8的大腸桿菌BL21 (DE3)中，就得到大腸桿菌菌株WK3。實施例6在37攝氏度過夜培養的大腸桿菌WK3種液，按體積比1: 100的比例稀釋到200ml的LB培養基；在37攝氏度培養3小時后，大腸桿菌WK3的0D600為0.4-0.6時加入IPTG (異丙基-0-D-硫代半乳糖苷)至終濃度為0.1mM;在加入IPTG誘導15-20小時后，用乙酸乙酯萃取菌液，有機相回收后旋轉蒸發溶劑干燥至l_2ml。樣品經0.22 濾膜過濾后，用LC-APC1-MS 和 GC-MS 檢測。
實驗結果:在大腸桿菌WK3菌體沉淀中可以明顯的檢測到生物柴油前體十五烯C15H18' C15H20 (圖 9)、C15H24 (圖 10)和十五烷 C15H32。將得到的烯烴進行加氫還原得到C15H32。將得到的烯烴沉淀收集在一個能耐高溫高壓的500ml圓底燒瓶中，加入10% Pd/C。將反應容器密封，排除空氣，5分鐘后通入氫氣，使壓力在25°C上升到35psi，邊反應邊攪拌反應物直到不能在觀察到液滴，反應大約需要16個小時來完成。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包括于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。盡管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解:在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由權利要求 及其等同物限定。
權利要求
1.一種微生物，其特征在于，包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核酸序列編碼聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體， 任選地，進一步包括第二核酸序列， 其中， 所述第二核酸序列編碼硫酯酶基因SgcElO或其功能等同體， 任選地，進一步包括第三核酸序列， 其中， 所述第三核酸 序列編碼乙酰輔酶A羧化酶基因或其功能等同體， 任選地，所述乙酰輔酶A羧化酶基因為選自accA、accB、accC和accD的至少一種， 任選地，進一步包括第四核酸序列， 其中， 所述第四核酸序列編碼烯醇還原酶基因mupE、fabl或其功能等同體。
2.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種， 任選地，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種， 任選地，所述微生物為大腸桿菌。
3.—種適于轉化微生物的系統，其特征在于，包括第一核酸序列， 其中， 所述第一核酸序列編碼聚酮合酶基因SgcE或其功能等同體， 任選地，進一步包括第二核酸序列， 其中， 所述第二核酸序列編碼硫酯酶基因SgcElO或其功能等同體， 任選地，所述第一核酸序列與所述第一核酸序列被設置于不同的載體上， 任選地，進一步包括第三核酸序列， 其中， 所述第三核酸序列編碼乙酰輔酶A羧化酶基因或其功能等同體， 任選地，所述乙酰輔酶A羧化酶基因為選自accA、accB、accC和accD的至少一種， 任選地，所述第一、第二和第三核酸序列被設置在相互不同的載體上， 任選地，進一步包括第四核酸序列， 其中， 所述第四核酸序列編碼烯醇還原酶基因mupE、fabl或其功能等同體， 任選地，所述第一、第二、第三和第四核酸序列被設置在相互不同的載體上， 任選地，進一步包括IPTG-誘導型啟動子， 其中， 所述第一、第二、第三或第四核酸序列的至少之一被設置在所述IPTG-誘導型啟動子的控制之下， 任選地，所述IPTG-誘導型啟動子為選自T7啟動子、tac啟動子和Iac啟動子的至少一種。
4.根據權利要求3所述的系統，其特征在于，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種， 任選地，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種， 任選地，所述微生物為大腸桿菌。
5.一種制備重組微生物的方法，其特征在于，包括使用權利要求3或4所述的系統轉化微生物，以便獲得所述重組微生物， 任選地，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種， 任選地，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種， 任選地，所述微生物為大腸桿菌。
6.一種生產烴 類化合物的方法，其特征在于，包括下列步驟: 培養權利要求1或2所述的微生物，以便生產所述烴類化合物；以及 分離所述烴類化合物， 任選地，所述微生物進一步包括第二核酸序列， 其中， 所述第二核酸序列編碼硫酯酶基因SgcElO或其功能等同體， 任選地，所述微生物進一步包括第三核酸序列， 其中， 所述第三核酸序列編碼乙酰輔酶A羧化酶基因或其功能等同體， 任選地，所述乙酰輔酶A羧化酶基因為選自accA、accB、accC和accD的至少一種，任選地，所述烴類化合物具有化學式CxHy,其中X = 4-40的任意整數，y = 6-82的任意整數， 任選地，所述烴類化合物為十五烯烴， 任選地，所述微生物進一步包括第四核酸序列， 其中， 所述第四核酸序列編碼烯醇還原酶基因mupE、fabl或其功能等同體， 任選地，所述烴類化合物為烷烴化合物， 任選地，所述烴類化合物為十五烷烴， 任選地，所述微生物為選自真核微生物和原核微生物的至少一種， 任選地，所述微生物為選自細菌、真菌、放線菌、螺旋體、支原體、衣原體、立克次體、病毒和酵母的至少一種。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述微生物為大腸桿菌。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，進一步包括對所述烯烴化合物進行氫化的步驟， 任選地，所述氫化反應是在10% Pd/C的作用下進行的。
9.一種烴類化合物，其是通過權利要求6-8任一項所述的方法制備的， 任選地，所述烴類化合物用作生物燃料。
10.一種制備生物燃料的系統，其特征在于，包括: 生物反應器，其中，所述生物反應器中設置有選自權利要求1-8任一項或2所述的微生物，用于在所述生物反應器中產生烴類化合物， 任選地，所述制備生物燃料的系統進一步包括: 氫化裝置，所述氫化裝置與所述生物反應器相連，以便從所述生物反應器接收所述烴類化合物，并對所述烴類化合物進行氫化， 任選地，所述氫化裝置中設置有10% Pd/C,以便催化所述氫化反應， 任選地，所述氫化裝 置為耐高溫高壓的反應容器。
全文摘要
本發明公開了烴類化合物的制備方法。其中，用于制備烴類化合物的微生物包括第一核酸序列，其中，所述第一核酸序列編碼聚酮合酶基因sgcE或其功能等同體。利用該微生物能夠有效地生產烴類化合物。
文檔編號C12N7/01GK103194418SQ20121000101
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月4日 優先權日2012年1月4日
發明者劉天罡, 吳凱悅 申請人:武漢臻智生物科技有限公司