專利名稱：抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的單克隆抗體、產生該抗體的雜交瘤細胞株及其表位的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種phiX174噬菌體裂解蛋白E的單克隆抗體、產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株及與單克隆抗體特異性結合的裂解蛋白E的一個表位多肽。本發明屬于生物技術領域。
背景技術：
菌蛻(bacterial ghost, BG)是一種具有佐劑性質且能攜帶外源物質的新型疫苗遞送體系。其實質是菌體空殼，其胞漿及核酸等內容物在內外滲透壓的作用下通過WiiX174 噬菌體的裂解蛋白E在細菌細胞壁上形成的損傷流出胞外，這也是菌蛻與常規疫苗相比的一個突出優勢。首先，表面抗原結構沒有被破壞，本身就具有的佐劑性質可以使其加強免疫反應。其次，菌蛻可以將特異性抗原成分有效地遞呈給抗原遞呈細胞，激活Thl型免疫應答。特別適合作為黏膜免疫的疫苗。另外，菌蛻又是完美的載體，可以接收大量的外源物質。重組蛋白可通過特定的膜錨定結構插入細胞膜，或填充于胞周間隙和細胞空腔中，以獲得重組菌蛻多價苗和多聯苗。而且由于菌蛻保留有菌毛、纖毛，具有生物親和性，能夠進行特異的細胞和組織定位，可用作核酸和藥物的親和性載體，在疾病的預防和治療方面具有廣闊前景。菌蛻生產簡單，發酵后可用離心重懸的方法進行收集，并可以凍干的形式保存于室溫，無需像蛋白疫苗那樣復雜的純化工作。理想的菌蛻不含胞漿、核酸等內容物，因此不存在毒力增強的問題，使用安全，對環境無污染。作為一種新型的疫苗及佐劑形式，菌蛻系統已經受到國內外研究者的廣泛關注。 自phiX174的E基因被鑒定為裂解基因以來已有40多年，但其介導的溶菌機制研究進展緩慢，爭論不斷。由于E蛋白為大腸桿菌噬菌體蛋白，所制備的多克隆抗體與環境中大腸桿菌存在嚴重的交叉反應，導致長期以來始終缺乏有效工具用于E蛋白的研究。本發明能應用于E蛋白在細菌裂解過程中的表達定位研究，為尋找與確證E蛋白的互作蛋白提供有力手段，為從根本上闡明E蛋白的溶菌機制奠定基礎。E蛋白介導的裂解與抗生素盤尼西林引起的裂解較為相似，其靶分子MraY也是衣霉素、胞質霉素A和脂賽霉素B的作用位點，所以， 鑒于E蛋白的獨特性，制備其單抗進而闡明溶菌的分子機制對“蛋白抗生素”的開發利用亦具有重大意義。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的單克隆抗體。本發明的一種抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No. 5430的雜交瘤細胞株分泌產生。其中，所述的單克隆抗體為IgG2b型，輕鏈屬于κ型。其中，所述的單克隆抗體能夠特異性結合phiX174噬菌體裂解蛋白E的B細胞抗原表位多肽，所述的表位多肽的氨基酸序列為VRLKPLNCSR。本發明的目的之二是提供一種產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發明的一種雜交瘤細胞株，為小鼠的脾細胞與SP2/0細胞經過細胞融合產生的雜交瘤細胞株，命名為E-A5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC No. 5430，保藏日期為2011年11月16日。本發明的目的之三是提供一種與抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的單克隆抗體特異性結合的E蛋白的一個表位多肽。本發明的一種phiX174噬菌體裂解蛋白E的B細胞抗原表位多肽，其特征在于所述的表位多肽與以上任一項所述的單克隆抗體特異性結合，所述的表位多肽(Epep)的氨基酸序列為VRLKPLNCSR。本發明還提供了編碼所述的B細胞抗原表位多肽的核苷酸序列。在本發明的具體實施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。進一步的，本發明還提供了所述的單克隆抗體在制備檢測phiX174噬菌體裂解蛋白E的試劑中的應用。所述的檢測，包括對phiX174噬菌體裂解蛋白E表達水平的檢測，也可包括對phiX174噬菌體裂解蛋白E的定位檢測。將所述單克隆抗體應用于E蛋白在細菌裂解過程中的定位研究，為尋找與確證E蛋白的互作蛋白提供了有力手段，也為揭示E蛋白的溶菌機制奠定了基礎。更進一步的，本發明還提供了所述的雜交瘤細胞株在制備抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的單克隆抗體中的應用。本發明還提供了所述的表位多肽在制備檢測抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的抗體的試劑中的應用。所述多肽Epep能競爭抑制單抗E-A5與E蛋白分子結合，也能用于E蛋白功能的研究。及所述的核苷酸序列在制備檢測抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的抗體的試劑中的應用。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案本發明關鍵在于通過噬菌體隨機十二肽庫技術篩選到單克隆抗體所識別phiX174 噬菌體裂解蛋白E的特異性多肽，其多肽氨基酸序列為Ep印VRLKPLNCSR。本發明通過雜交瘤細胞技術篩選得到了一株能夠穩定分泌所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其制備方法包括用His-ΔΕ融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合，用GST-E、GST-△ E融合蛋白篩選出能夠穩定分泌所述單克隆抗體的雜交瘤細胞，從雜交瘤細胞上清液中或從注射雜交瘤細胞的動物腹水中，獲得所述單克隆抗體。其中GST-E融合蛋白中，E蛋白的氨基酸序列及核苷酸序列如SEQID NO. 2所示，His-ΔΕ及 GST-ΔE融合蛋白中，ΔE蛋白的氨基酸序列及核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本發明單克隆抗體特識別phiX174噬菌體裂解蛋白E特異性多肽的鑒定方法，利用噬菌體隨機十二肽庫鑒定所述單克隆抗體特異性結合phiX174噬菌體裂解蛋白E的表位多肽，通過三輪淘洗，進行滴度測定，選取陽性噬菌體克隆，進行測序分析，結果顯示所述單克隆抗體對SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的第160-189位核苷酸編碼的多肽具有特異性， 其多肽是Ep印VRLKPLNCSR。所述融合蛋白由以下方法獲得將含有phiX174噬菌體裂解基因E相關核苷酸序列的將pETj8a- Δ E、pGEX-6p- Δ E和pGEX_6p-E質粒載體轉化大腸桿菌，IPTG誘導下獲得包涵體，對包涵體進行純化，得到所述的His- Δ Ε、GST- Δ E和GST-E融合蛋白，本發明所指的 IPTG (Isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside，異丙基-β _D硫代半乳糖苷)可以誘導蛋白表達，能對乳糖操縱子產生極強的誘導效應，是強誘導物。具體的，所述單克隆抗體由如下方法制備得到(1)免疫原的準備將pETj8a-AE、pGEX_6p-AE和pGEX_6p-E重組載體轉化 BL21 (DE3)大腸桿菌，在IPTG誘導下，分子量分別約14ku、34ku和36ku的His- Δ Ε,GST- Δ E 和GST-E均以包涵體形式存在。在本發明的一個優選實驗方案中，以簡便的方法對上述包涵體進行了純化，并以純化過的蛋白作為抗原免疫小鼠。(2)動物免疫用上述純化過的His-ΔΕ融合蛋白免疫BALB/c小鼠，以期產生針對E蛋白的特異性單克隆抗體。每只小鼠以IOOyg的量進行背部皮下注射，每兩周一次共三次，第四次加強免疫一次，3天后待融合，獲得免疫小鼠。(3)雜交瘤細胞系的建立取免疫小鼠的脾臟細胞作為能夠產生抗體的漿細胞， 與同系動物的骨髓瘤細胞(SP2/0)以聚乙二醇(PEG3500)介導進行融合。融合后細胞經HAT 培養基選擇性培養，以GST-ΔΕ和GST-E為包被抗原，采用間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 篩選陽性克隆。用有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆化培養直至克隆化細胞抗體陽性率為100%。將雜交瘤細胞經體外連續傳代和反復凍存、復蘇，直到細胞系能穩定分泌單克隆抗體。(4)單克隆抗體的制備與純化將建系的雜交瘤細胞注射到經石蠟油預處理的小鼠腹腔，誘生腹水。誘生的腹水用親和層析法獲得純化的單克隆抗體。本發明還涉及所述的單克隆抗體所針對phiX174噬菌體裂解蛋白E的特異性肽段的篩選。利用隨機十二肽庫的噬菌體展示技術，利用間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對單克隆抗體的表位進行3輪淘選，滴度測定，陽性噬菌體克隆測序和競爭抑制試驗，證明 Epep :VRLKPLNCSR是針對所述的單克隆抗體的特異性肽段。本發明的有益效果主要體現在本發明提供了抗phiX174噬菌體裂解蛋白E單克隆抗體，以及產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并對其表位進行了鑒定，為進一步明確 phiX174噬菌體裂解蛋白E在菌影形成中的作用提供了基礎，為菌影疫苗的深入研究奠定基礎，對“蛋白抗生素”的開發利用亦具有重大意義。


圖1為融合蛋白誘導表達的SDS-PAGE圖； 1為誘導pGEX-6p-l裂解菌體對照；2為純化GST對照；3為誘導pGEX_6p-E裂解菌體；4為純化GST-E ；5為誘導pGEX-6p- Δ E裂解菌體；6為純化GST- Δ E ;7為誘導pET_28a 裂解菌體對照；8為誘導pET48a- Δ E裂解菌體；9為純化His- Δ E圖2為抗phiX174噬菌體裂解蛋白E單抗E-A5純化后SDS-PAGE ；圖3為E-A5單克隆抗體亞型鑒定；圖4為免疫印跡雜交檢測E-A5單克隆抗體特異性的結果；1 為 GST- Δ E ;2 為 GST-E ；3 為 GST ；圖5為噬菌體陽性克隆測序分析；
圖6為合成肽Ep印與單抗結合的ELISA檢測；圖7為合成肽Ep印的競爭抑制試驗。
具體實施例方式下面通過實驗并結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。實施例1 :E蛋白原核表達載體的構建以phiX174噬菌體基因組DNA (購自i^rmentas公司)為模板，采用PCR方法擴增出276bp的E基因(SEQ ID NO. 2所示)及201bp的Δ E片段(SEQ ID NO. 3所示)，經限制性內切酶酶(Bam H I和Sal I)切后，分別與pGEX_6P_l (購自Amersham公司)和pET_28a 載體(購自Merck公司)連接，轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)(購自Merck公司)中，并經酶切和PCR鑒定后獲得重組質粒pGEX-6P-E、pGEX_6p-ΔE和pET48a-ΔΕ。實施例2融合蛋白的表達與純化(1)重組蛋白的誘導挑取含有質粒的單克隆菌落，分別接種于5ml含有相應抗生素的LB培養基(pGEX-6P-E和pGEX-6p- ΔΕ為氨芐青霉素抗性；pET-28a- △ E為卡那霉素抗性)， 37°C 220rpm振蕩過夜。次日，以1 100稀釋到含有相應抗生素的500ml LB培養基中， 37°C培養至OD6tltl約為0. 6，加入IPTG使其濃度為lmM，37°C誘導4小時，離心收集沉淀。(2)尿素變形提取包涵體1)按％il/100ml菌液(該菌液體積為IPTG誘導時的菌液體積)比例用12mL重懸液QOmM Tis 150mM NaCl)將沉淀懸起；2)超聲30分鐘，每超聲5秒，間隔15秒，振幅30 %，冰上操作；3) 4°C 12000 Xg 離心 20 分鐘，收集沉淀用 12mL 洗滌液 QOmM Tris 150mMNaCl 2M 尿素0. 5% NP40)洗滌沉淀；4)重復步驟3)，收集沉淀用12ml 8M尿素溶解并超聲至溶液清亮；5)40C 12000Xg離心20分鐘，收集上清蛋白樣品，_80°C凍存。(3) Hi S-Δ E融合蛋白純化1)將 anl Ni-NTA HIS-Binding Resin (Novagen 公司)與 IOml 蛋白樣品混合，4°C 振蕩2小時使之充分混合；2)將上述混合液裝入層析柱(Bio-RAD公司)；3)用5個柱體積緩沖液1平衡鎳柱；4)用5個柱體積50mM咪唑洗滌液洗脫雜蛋白；5)用5個柱體積400mM咪唑洗脫液洗脫目的蛋白，收集流出液500 μ 1/管；6)用10個柱體積超純水清洗層析柱；7)用20%乙醇過柱清洗，并于4°C保存。SDS-PAGE鑒定蛋白純度，并用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。(4)GST- AE與GST-E融合蛋白純化1)配制SDS-PAGE濃縮膠和分離膠，不插樣品梳上樣，按常規方法電泳；2)電泳結束后將膠放4mol/L NaAc溶液中在脫色搖床上搖1小時，目的蛋白可呈現一條白色的條帶；3)將目的蛋白切割下來放在蒸餾水中在脫色搖床上搖20分鐘脫去NaAc ；4)然后將切下來的膠放在密封的透析袋內(透析袋內也裝滿電泳液)；5)再將透析袋放在水平電泳槽內，在120V的電壓下作用30分鐘可使目的蛋白游離出來；6)將透析袋直接放入盛有PBS溶液的燒杯中，4°C透析過夜；7)用PEG20000將透析袋包埋，濃縮至合適體積，吸出蛋白液。SDS-PAGE鑒定蛋白純度，并用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。實施例3抗血清的制備將純化的His-ΔΕ融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑(購自Sigma公司)混合并乳化后，皮下多點免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠(購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心)，注射劑量為IOOyg/只；共免疫三次，后兩次用等體積的弗氏不完全佐劑 (購自Sigma公司)，免疫劑量也為100 μ g/只。第三次免疫后7天，尾部靜脈采血，分離血清作為陽性血清。以間接ELISA法測定效價，當達到10_4后準備融合。融合前三天用不加佐劑的蛋白腹腔注射進行加強免疫，劑量也為IOOyg/只。實施例4單克隆抗體的制備(1)飼養細胞鋪板在融合前一天，取一只無免疫的BALB/c小鼠，脫頸處死，并將其完全浸泡于75% 的酒精中約5分鐘。用剪刀小心剪開腹部皮膚，但不要剪開腹膜。酒精棉球對腹膜進行消毒，20ml的注射器吸取5ml HAT篩選培養基，小心推入小鼠腹腔，取飼養細胞，然后注入到培養皿中。再加入約36ml完全培養基混勻，用排槍加入四塊96孔培養板中，100 μ 1/孔。 觀察生長，防止污染。(2)免疫后的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合無菌條件下取出加強免疫的BALB/c小鼠脾臟，在基礎培養液中洗掉結締組織。再將脾臟移入另一盛有基礎培養基中進行二次清洗，然后過100目鋼絲網，將其搗碎，將懸液轉入離心管中，IOOOXg離心10分鐘，用基礎培養液懸起脾細胞，進行計數。收集將生長狀態良好并處于對數生長期的SP2/0細胞(購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所技術服務中心)，進行計數。按比例為1 10的脾細胞和骨髓瘤細胞進行融合，IOOOXg離心7分鐘，棄盡上清。輕輕震動離心管，使細胞輕微的懸浮起來，便于融合劑滲入細胞之間。將離心管放入37°C水中，緩慢加入Iml PEG3350，并邊滴邊搖晃離心管。靜置1分鐘，然后按Iml/ 分鐘、3mL/分鐘，6ml/分鐘速度分步滴加培養基，最后再慢慢滴加到45ml，起到徹底終止作用。IOOOXg離心10分鐘，吸盡上清，用37°C預熱準備好的含有20%胎牛血清的HAT選擇培養基，輕輕懸起沉淀細胞，并定容到40ml，然后轉移到滅菌平皿中，按每孔100 μ 1的量加入96孔細胞培養板中，放入細胞培養箱進行培養。HT培養基的配制方法將100倍濃縮的HT液體(Iml)放入含有20%胎牛血清的 DMEM 99ml液體培養基中。HAT培養基的配制方法將100倍濃縮的HAT液體(Iml)放入含有20%胎牛血清的DMEM99ml液體培養基中。(3)雜交瘤細胞的篩選
用顯微鏡觀察融合后細胞的生長情況，及時用固體NaOH顆粒清除污染的細胞。每 3天更換培養基一次，所用培養基根據換液時間而有所不同，在融合后的第3、6天用HAT培養基進行半換液，第9天改用HT培養基進行半換液，第12天用HT培養基進行全換液。當在15天時融合的細胞形成小集落，大約達到板底面積的1/4時，可取上清100 μ 1，利用間接 ELISA方法，對細胞分泌抗體的水平進行檢測。用移液器小心吹打陽性孔，使細胞混勻懸浮。 然后取100 μ 1放入2ml的DMEM的基礎培養液中，充分混勻，進行計數。取約100個細胞的混合液，放入IOml HT培養液中，并用100 μ 1的排槍吸到鋪有飼養層細胞的96孔板中。經常觀察細胞生長狀態，培養液變黃進行換液。以GST-ΔΕ和GST-E為包被抗原(包被濃度 5 μ g/ml，每孔50 μ 1)，進行間接ELISA，測OD45tl值，篩選陽性單一雜交瘤細胞群。再用相同方法進行陽性雜交瘤細胞的克隆，直至所得到細胞株能穩定分泌單克隆抗體。最終獲得一株雜交瘤細胞株，命名為Ε-Α5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC No. Μ30，保藏日期為2011年11月16日。實施例5單克隆抗體的腹水的制備及純化取8-10周齡的BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟0. 5ml/只，一周后接種生長狀態良好的單克隆雜交瘤細胞E-A5，大約0. 5 X IO6個細胞，待一周左右小鼠腹部膨大，抽取腹水，3000 Xg離心10分鐘，取上清，分裝入1. 5ml離心管，_20°C備用。用飽和硫酸銨沉淀法將腹水進行初步提純，之后用ftOteinA親和層析法將其進一步純化，單克隆抗體純化后的 SDS-PAGE見圖2。該圖顯示了單克隆抗體的輕鏈和重鏈聚合體，證明單抗的純度很高。實施例6抗phiX174噬菌體裂解蛋白E單克隆抗體E_A5效價及亞型鑒定用間接ELISA方法，檢測純化后單抗E-A5的效價為10萬以上，見表1。采用 Southern Biotech抗體亞類試劑盒對獲得的單抗E-A5進行抗體亞類進行鑒定，結果單抗 E-A5重鏈為IgG^，輕鏈是κ鏈，見圖3。表1為純化后的E-A5單克隆抗體ELISA方法檢測效價結果
權利要求
1.一種抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體由保藏編號為CGMCC No. 5430的雜交瘤細胞株分泌產生。
2.如權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體為IgG2b型，輕鏈屬于κ型。
3.如權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體特異性結合 phiX174噬菌體裂解蛋白E的B細胞抗原表位多肽，所述的表位多肽的氨基酸序列為 VRLKPLNCSR。
4.一種產生權利要求1-3任一項所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為E-A5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC No. M30。
5.一種phiX174噬菌體裂解蛋白E的B細胞抗原表位多肽，其特征在于所述的表位多肽與權利要求1-3任一項所述的單克隆抗體特異性結合，所述的表位多肽的氨基酸序列為 VRLKPLNCSR。
6.編碼權利要求5所述的B細胞抗原表位多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
7.權利要求1-3任一項所述的單克隆抗體在制備檢測phiX174噬菌體裂解蛋白E的試劑中的應用。
8.權利要求4所述的雜交瘤細胞株在制備抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的單克隆抗體中的應用。
9.權利要求5所述的表位多肽在制備檢測抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的抗體試劑中的應用。
10.權利要求6所述的核苷酸序列在制備檢測抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的抗體試劑中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種抗phiX174噬菌體裂解蛋白E的單克隆抗體和產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以及與該單克隆抗體特異性結合的E蛋白的表位多肽。所述單克隆抗體是由命名為E-A5的雜交瘤細胞產生，并對SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第160-189位核苷酸編碼的多肽具有特異性，多肽為VRLKPLNCSR。本發明的有益效果主要體現在本發明提供了抗phiX174噬菌體裂解蛋白E單克隆抗體，以及產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并對其表位進行了鑒定，為進一步明確phiX174噬菌體裂解蛋白E在菌影形成中的作用提供了基礎，為菌影疫苗的深入研究奠定基礎，對“蛋白抗生素”的開發利用亦具有重大意義。
文檔編號C12R1/91GK102558346SQ201210001050
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月4日 優先權日2012年1月4日
發明者于申業, 劉思國 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所