專利名稱：Saa4基因的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種SAA4基因的用途。
背景技術(shù)：
SAA4 基因(Serum amyloid A-4，血清淀粉樣蛋白 A4 基因，NM_006512)，位于 11 號(hào)染色體，是SAA家族中的成員之一。SAA是由同一簇基因編碼的一組多形性蛋白，它主要由肝細(xì)胞合成。SAA與CRP相似，也是一個(gè)急性期反應(yīng)蛋白。結(jié)構(gòu)分析表明，SAA是由104個(gè)氨基酸組成的多肽，在其天然狀態(tài)時(shí)的分子量大約12 14KD。人類SAA蛋白是一類多態(tài)性蛋白，由幾個(gè)相關(guān)的蛋白家族(SAA1 SAA4)組成。SAAl和SAA2基因基本相同，有7個(gè)Aa不同，它們編碼急性期SAA。SAA3是一個(gè)假基因，與其它的基因存在本質(zhì)上的不同。SAA4在急性期反應(yīng)中變化不大，是一個(gè)在動(dòng)態(tài)平衡中與高密度脂蛋白膽固醇一起出現(xiàn)的異性物，SAA4與高密度脂蛋白密切相關(guān)。SAA4的生理功能不清楚，它在血清中的濃度與其他幾類主要的載脂蛋白不相關(guān)。目前尚沒有關(guān)于SAA4基因作為肝癌診斷標(biāo)志物的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種SAA4基因的用途，SAA4基因可作為診斷肝癌的分子標(biāo)志物。為了解決上述技·術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種SAA4基因的用途，用于制備診斷肝癌的產(chǎn)品。優(yōu)選的，所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片檢測(cè)、或免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品。所述用半定量RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SAA4基因的引物。所述用基因芯片檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品包括:與SAA4基因的核酸序列雜交的探針。所述用免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品包括 與SAA4蛋白特異性結(jié)合的抗體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用于診斷肝癌的試劑盒，所述試劑盒包含特異性針對(duì)SAA4基因的引物或探針，或包含特異性結(jié)合SAA4蛋白的抗體。利用本發(fā)明的試劑盒，可以檢測(cè)病人SAA4基因的表達(dá)情況，從而診斷病人是否患有肝癌。在本發(fā)明中，術(shù)語“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點(diǎn)，在合適條件下誘發(fā)合成與核酸鏈互補(bǔ)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液中并在合適的溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。優(yōu)選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長(zhǎng)度取決于該引物的設(shè)計(jì)用途，但一般在15 25個(gè)核苷酸之間。在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長(zhǎng)度都可以。在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對(duì)SAA4蛋白特異的抗體。例如，將提純的人SAA4基因產(chǎn)物或它的抗原片段或人工合成的含有與SAA4蛋白有連續(xù)5個(gè)相同的氨基酸的多肽片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多抗體。同樣，表達(dá)人SAA4蛋白或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制備。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明SAA4基因在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，因此SAA4基因可作為診斷肝癌的特異標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的SAA4基因在人肝癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的半定量RT-PCR結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中， 未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍的譯.北京:科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。實(shí)施例1用半定量RT-PCR方法檢測(cè)肝癌樣本中SAA4基因的表達(dá)變化半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(SqRT-PCR)是近年來常用的一種簡(jiǎn)捷、特異的定量RNA測(cè)定方法，通過mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)定PCR產(chǎn)物的數(shù)量，可以推測(cè)樣品中特異mRNA的相對(duì)數(shù)量。以半定量RT-PCR為基礎(chǔ)建立起來的mRNA含量測(cè)定技術(shù)，較含內(nèi)標(biāo)化的RT-PCR定量測(cè)定的mRNA的方法更為簡(jiǎn)便可行。運(yùn)用半定量RT-PCR方法，檢測(cè)20對(duì)肝癌樣本中SAA4基因的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織中呈明顯的下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:1.組織分離實(shí)驗(yàn)用組織來源于HBV陽性并表達(dá)甲胎蛋白的原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人(RT-PCR證實(shí)AFP在肝癌均為陽性而癌旁為陰性)。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(-80°C)保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。2.RNA 抽提采用TAKARA公司的Trizol (D9108)對(duì)20對(duì)肝癌樣本(癌和癌旁)組織進(jìn)行抽提，并用安捷倫2100對(duì)產(chǎn)物的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)。具體操作是:將碾杵和勻漿器等器皿在200°C干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預(yù)冷，將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzoI試劑的勻漿器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4°C離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4°C離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4°C離心沉淀RNA ;用75%乙醇洗滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定(用安捷倫2100測(cè)定RNA濃度、純度和完整性)，結(jié)果見下表I。質(zhì)量鑒定好的RNA存放在-80°c冰箱待用。表120對(duì)肝癌樣本的RNA抽提質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種SAA4基因的用途，其特征在于，用于制備診斷肝癌的產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括:用半定量RT-PCR、基因芯片檢測(cè)、或免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述用半定量RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增SAA4基因的引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述用基因芯片檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品包括■ 與SAA4基因的核酸序列雜交的探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述用免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品包括 與SAA4蛋白特異性結(jié)合的抗體。
6.一種用于診斷肝癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性針對(duì)SAA4基因的引物對(duì)。
7.一種用于診斷肝癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性針對(duì)SAA4基因的探針。
8.一種用于診斷肝癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含特異性結(jié)合SAA4蛋白的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種SAA4基因的用途，用于制備診斷肝癌的產(chǎn)品。本發(fā)明還公開了一種用于診斷肝癌的試劑盒，該試劑盒包含特異性針對(duì)SAA4基因的引物或探針，或包含特異性結(jié)合SAA4蛋白的抗體。本發(fā)明的SAA4基因，可作為診斷肝癌的特異標(biāo)志基因，使肝癌診斷更加準(zhǔn)確、快速。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103194530SQ20121000228
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者黃健, 劉星 申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司