專利名稱：小鼠醛氧化酶轉錄水平定量用pcr引物組合及pcr方法
技術領域：
本發明涉及一種小鼠含鑰酶醛氧化酶轉錄水平進行定量用PCR引物組合，同時還涉及ー種使用該引物的實時熒光定量PCR方法，屬于生物檢測技木。
背景技術：
醒氧化酶(aldehyde oxidases. Α0Χ)是ー類催化醒類氧化成相應的羧酸并釋放出活性氧的蛋白酶，主要存在于肝臟和紅血球中。它屬于鑰-黃素酶(molybdo.flavorenzyme. MFE)家族的亞家族,是新陳代謝不可缺少的酶類。它參與多種生理調節,可以將體內形成的有毒醛氧化為無毒酸，以緩解醛類對機體的毒害作用，也參與細胞內電子傳遞，在與代謝和繁殖相關的生理活動中起著非常重要的作用。其轉錄水平的高低反映了機體代謝的狀態。以往的對醛氧化酶的研究主要集中在該酶的序列、結構和功能上，其中RalfR.Mendel 在 Biochimica et Biophysica Acta 1763 (2006) 621-635 發表論文 Cell biologyof molybdenum就醒氧化酶的結構和功能等做了綜述,而對于醒氧化酶轉錄水平研究上缺乏有效的工具。而實時熒光定量PCR的基因擴增法已被廣泛應用于基因轉錄水平的定量。實時熒光定量PCR可以對極微量的DNA模板進行準確定量，因其精度高，時間短而被廣泛的應用。目前國內外還未見對醛氧化酶轉錄水平定量方法的研究。為了研究小鼠體內醛氧化酶的轉錄水平，需要建立一種能夠精確對醛氧化酶mRNA定量的方法，進而為研究醛氧化酶功能及其影響因素打下基礎。

發明內容
本發明的目的提供了一種醛氧化酶轉錄水平定量用PCR引物組合在轉錄水平上對醛氧化酶進行定量。同時，本發明的目的還在于提供了一種能夠實時突光定量的PCR方法。為了實現上述目的，本發明的技術方案采用了 ー種小鼠醛氧化酶轉錄水平定量PCR引物，其核苷酸序列為正向5，-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3，反向5，-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3，。本發明的技術方案還采用了一種醛氧化酶轉錄水平定量實時熒光定量PCR方法，該方法以樣品總RNA反轉錄成的cDNA為模板，利用引物組合進行實時熒光定量PCR擴增，根據反應體系中熒光的變化情況定量醛氧化酶轉錄水平。fj 增ノ予列為actgcgtgggccatcttgtctgtgctgtgattgcagattctgagacacgggcaaagcaagcggcgaagcaagtgaaggtggtctaccaagacttggcgcctctgatcctaacgattgaggaagctatacaacacaagtccttcttcaagtcagaacggaagctggagtgtgggaatgttgacgaagcatttaaaatcgttgatcaaattcttgaaggtgaaatacacataggcggccagga。
所述的實時熒光定量PCR擴增體系為25 μ L體系2XSYBR Mix 12. 5 μ L，10 μ mol/L正向；反向引物各 O. 5 μ L, cDNA模板2 μ L, 9. 35 μ L去離子水,TaqDNAPolymeraseO. 15 μ L，三步法對樣品進行擴增，在熒光定量PCR儀上獲取CT值。所述的三步法為95°C 3min,95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 31sec，40 個循環。本發明通過分析小鼠醛氧化酶基因序列，設計特異引物，能夠快速、精確的對醛氧化酶轉錄水平定量。本發明的引物可以通過利用本領域技術人員公知的化學合成方法來進行的DNA合成技術來獲得。引物序列是在充分分析醛氧化酶基因序列的基礎上，因此對材料中非目的基因沒有擴增信號。通過使用本發明的引物，對小鼠的醛氧化酶轉錄水平實施定量，方法簡單，精確。并且，本發明的引物特異性強，不會受到其他基因的干擾，為研究小鼠醛氧化酶功能以及其他因素對其影響提供了有效工具。實時熒光定量PCR25y L 體系(2XSYBR Mix 12. 5 μ L，10 μ mol/L 正向、反向弓I物各 O. 5 μ L，cDNA 模板 2 μ L，9. 35 μ L 去離子水，TaqDNA Polymerase O. 15 μ L)，三步法 (95°C 3min,95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 31sec，40個循環)對樣品進行擴增，在熒光定量PCR儀上獲取CT值。擴增結果可以通過與看家基因(如3-磷酸甘油醛脫氫酶基因等)比較，從而確定醛氧化酶的轉錄水平。計算公式如下醛氧化酶基因轉錄水平=2_'ctΔ CT = (CT. Target-CT. Actin) Time χ- (CT. Target-CT. Actin) Time 0.注CT. Target為醛氧化酶基因CT值CT. Actin為看家基因CT值Time O為初始時間點數據Time χ為后期時間點數據使用本發明的引物以及方法進行醛氧化酶轉錄水平定量樣品主要為肝臟，但其他組織也可使用。


圖I為熒光定量PCR特異性檢測AOX目的片段的溶解曲線；圖2為熒光定量PCR特異性檢測AOX目的片段PCR擴增結果；圖I、圖2是熒光定量PCR特異性檢測；圖I中每條曲線代表不同小鼠的肝臟樣品，圖2中2-7，分別代表不同小鼠的肝臟樣品。
具體實施例方式本實施例的小鼠醛氧化酶轉錄水平定量PCR引物，其核苷酸序列為正向5，-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3，反向5，-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3，。下面是小鼠黃嘌呤氧化酶轉錄水平定量用PCR引物組合及PCR方法的具體實施例鑰對小鼠醛氧化酶轉錄水平的影響I實驗動物I. I. I實驗動物的選擇二月齡的清潔級ICR小白鼠60只。
I. I. 2實驗動物的分組健康的雌性小白鼠40只和雄性小白鼠20只，適應5天后，隨機分成4組，每組10只雌性和5只雄性小白鼠，雌雄分開飼養，自由采食，基礎日糧相同，飲水中加入不同劑量的鑰(以Na2MoO4 ·2Η20形式)，分別是空白對照組、低鑰組(IOOmg ·じ1)、中鑰組(200mg·じ1)、高鑰組(400mg·じ1)，4周后雌雄合籠飼養。產仔后從每組仔鼠中隨機雌性小白鼠30只和15只雄性小白鼠按原分組給予不同劑量的鑰，8周后，再從每組中隨機選取雌性小白鼠10只和5只雄性小白鼠合籠飼養。待其產仔。如此往復，使小鼠繁殖四代。每組取第三第四代二月齡小鼠各5只，眼球采血處死后，取肝臟組織置于樣品保護劑中(Sampleprotector, TAKARA公司)用于醒氧化酶轉錄水平的檢測。I. 2實驗方法 1.2. I小鼠肝臟的采集小鼠眼球采血處死后，剪開腹腔，分離并摘取肝臟組織置于樣品保護劑中(Sampleprotector, TAKARA公司)用于醒氧化酶轉錄水平的檢測。I. 2. 2目的基因的擴增、克隆、鑒定及測序I. 2. 2. 2總RNA的提取，參照說明書，步驟如下勻漿取約50 IOOmg新鮮小鼠肝臟組織，用DEPC處理過液氮預冷的研缽勻漿后，轉移入I. 5mL的EP管中，加入ImL TRIPURE試劑，振搖片刻。RNA的分離孵育勻漿樣品5min，使核酸充分裂解游離出來，每毫升TRIPURE試劑添加O. 2mL氯仿，蓋上瓶蓋，用手用力地搖晃EP管15sec，15 30°C下放置2 3min，1200g離心15min(2°C 8°C )分層下層為酚-氯仿，上層為水相，RNA存在于水相中。水相體積應為總體積的60%。RNA的沉淀吸取上層水相到一新I. 5mL的EP管內，留下有機相。用異丙醇沉淀RNA，與最開始加入TRIPURE量的比為2 1，15 30°C放置lOmin，1200g離心IOmin (2°C 8。。)。RNA在離心前是肉眼看不到的，離心后可在管底或側壁上形成類似凝膠的滴狀物。RNA漂洗去上清，用75%的こ醇漂洗RNA沉淀，與最開始加入TRIPURE量的比為I I。震蕩混勻樣品，2°C 8°C 7500g離心5min。干燥RNA :空氣干燥或真空干燥5 IOmin。重溶RNA :將RNA溶解在20 μ I無RNA酶的DEPC水中，吹打幾下，置于55 600C lOmin，使其盡量溶解，貯于_70°C冰箱待用。I. 2. 2. 3瓊脂糖凝膠電泳稱取適量瓊脂糖，用無菌TAE緩沖液配成I. 25%左右濃度，微波爐加熱融化后，冷卻并凝固，在用TAE緩沖液處理過的膠槽中電泳。電壓為100V左右，在點樣孔加入5μ L RNA樣品后進行電泳。當溴酚藍跑到凝膠長度的2/3時停止電泳，將凝膠移至紫外燈上觀察其完整性并拍照。用pharmacia biotech公司的核酸濃度測定儀測定RNA的濃度,初步估計提取RNA的質量，以確定反轉錄時所需要添加量。I. 2. 2. 4cDNA合成按試劑盒說明操作。在用DEPC處理過的無Rnase的200 μ LPCR管中進行目的基因cDNA的合成。I. 2. 2. 5目的基因引物的設計根據GenBank中收錄的AOX和3_磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)的基因序列。利用引物設計軟件Primer Express〗.O分別進行引物設計。其中GAPDH片段作為內參照。目的基因引物的設計如下(表I)表IPCR 引物
引物名稱引物序列
AOX 上游 5，ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG3，AOX 下游 5，TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC3’
GAPDH 上游 5，-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3 ’
GAPDH 下游 _5，-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3，_ I. 2. 3目的基因熒光定量PCR反應體系的確定用RNA提取試劑盒提取RNA后，測定總RNA及逆轉錄的cDNA的濃度，對目的基因進行最佳PCR反應條件的確定。采用SYBR Green I染料法，在ABI7000熒光定量PCR儀上進行擴增和數據分析。根據SYBR Green I Real Time PCR Kit推薦的反應體系，調整為25 μ L體系(2XSYBRMix 12. 5 μ L，10 μ mol/L 上、下游引物各 0.5 μ L，模板 2 μ L，9. 35 μ L 去離子水，Taq DNAPolymerase O. 15μ L),三步法(％で 3min, 95°C 30sec,60°C 30sec, 72°C 31sec,40 個循環)對樣品進行擴増。2. 2. 4基因的相對表達差異分析本實驗采用2-ACT方法分析基因的相對表達差異。計算公式如下amount of target = 2_Δετ Δ CT = (CT. Target-CT. Actin) Time χ- (CT. Target-CT. Actin) Time 0.2 結果2. I小鼠AOX基因熒光定量PCR反應的溶解曲線由圖1、2可見，在AOX基因的擴增過程中熒光定量PCR反應的溶解曲線僅見単獨的峰，反應結束后的電泳的結果僅見一條特異條帯。表明擴增的目的片段特異性良好。2. 2鑰對小鼠肝臟AOXmRNA水平的影響通過實時熒光定量PCR的方法可知，實驗組的AOXmRNA水平普遍高于對照組。結果見表2表2鑰對小鼠肝臟AOXmRNA水平的影響
m3] aoxTST"
對照組I a低鑰組 0.31±0.22a
中鑰組11.77±2.28b
高鑰組 42.56±1.56c序列表〈110〉河南科技大學<120>小鼠醛氧化酶轉錄水平定量用PCR引物組合及PCR方法<170>patentin version 3. 3<210>1
<212>DNA〈213〉人工合成〈223〉引物 Fl<400>1ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG22
<210>2<212>DNA〈213〉人工合成〈223〉引物 F2<400>2TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC24<210>3<212>DNA〈213〉人工合成<400>3actgcgtgggccatcttgtctgtgptgt^ttgca^ttct^^cacgggcaaagcaagcggc^agcaagt^aggtggtctacca 88a^cttggcgcctct^,tcctaac^,tt^g^agptatacaacacaagtccttcttcaagtca^acg^agptg^gtgtgg^at 176gtt^c^agcatttaaaatcgtt^tcaaattctt^aggt^aatacacataggcggccag^a24權利要求
1.一種小鼠醛氧化酶轉錄水平定量PCR引物組合，其特征在于其核苷酸序列為 正向5，-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3， 反向5，-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3，。
2.一種醛氧化酶轉錄水平定量實時熒光定量PCR方法，其特征在于以樣品總RNA反轉錄成的cDNA為模板，利用引物組合進行實時熒光定量PCR擴增，根據反應體系中熒光的變化情況定量醛氧化酶轉錄水平。
3.根據權利要求2所述的醛氧化酶轉錄水平定量實時熒光定量PCR方法，其特征在于fj -曾序列為actgcgtgggccatcttgtctgtgctgtgattgcagattctgagacacgggcaaagcaagcggcgaagcaagtgaaggtggtctaccaagacttggcgcctctgatcctaacgattgaggaagctatacaacacaagtccttcttcaagtcagaacggaagctggagtgtgggaatgttgacgaagcatttaaaatcgttgatcaaattcttgaaggtgaaatacacataggcggccagga。
4.根據權利要求2所述的醛氧化酶轉錄水平定量實時熒光定量PCR方法，其特征在于所述的實時熒光定量PCR擴增體系為25 μ L體系2 X SYBR Mix 12. 5 μ L，10 μ mol/L正向；反向引物各 O. 5μ L, cDNA 模板 2μ L，9. 35 μ L 去離子水，TaqDNAPolymerase O. 15 μ L，三步法對樣品進行擴增，在熒光定量PCR儀上獲取CT值。
5.根據權利要求4所述的醛氧化酶轉錄水平定量實時熒光定量PCR方法，其特征在于所述的三步法為 95°C 3min,95°C 30sec,60°C 30sec，72°C 31sec，40 個循環。
全文摘要
本發明涉及一種小鼠醛氧化酶轉錄水平定量PCR引物組合及PCR方法，PCR引物組合核苷酸序列為正向5’-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3’反向5’-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3’。通過使用本發明的引物，對小鼠的醛氧化酶轉錄水平實施定量，方法簡單，精確。并且，本發明的引物特異性強，不會受到其他基因的干擾，為研究小鼠醛氧化酶功能以及其他因素對其影響提供了有效工具。
文檔編號C12Q1/68GK102690882SQ201210004660
公開日2012年9月26日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者尚澤松, 張才, 朱重偉, 楊自軍, 汪紀倉, 王亞壘, 王臣, 王雪瑩 申請人:河南科技大學