專利名稱：一種生產l-乳酸的方法及其專用芽孢桿菌屬菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種生產L-乳酸的方法及其專用芽孢桿菌屬菌株。
背景技術：
乳酸(Lactic acid)又名二羥基丙酸，是世界三大有機酸之一。作為一種傳統的多用途精細化學品，乳酸可作為酸味劑、芳香劑、防腐劑、植物生長調節劑、生物可降解性材料、藥物和農藥等，應用于食品、制藥、釀造、制革、紡織、環保和農業中。乳酸是一種手性分子，可分為L-乳酸、D-乳酸和DL-乳酸。L-乳酸是生產聚L-乳酸的原料。利用L-乳酸聚合產生的聚L-乳酸，以其良好的生物可降解性和優良的使用特性，被公認為是取代傳統塑料的理想的生物可降解塑料之一。L-乳酸的光學純度對于聚L-乳酸的合成至關重要，聚DL-乳酸是以一種無定形態存在而不能得到工業應用。微生物發酵法生產乳酸，生產成本低，產品安全性高，而且能專一性的得到光學純乳酸，是大規模生產乳酸的主要方法。目前主要應用的發酵菌株為乳酸細菌以及一些真菌。乳酸發酵過程中，由于不斷生產產物而使發酵液的酸度逐漸上升，導致菌體生長和產酸都受到嚴重的抑制，為此要加入碳酸鈣等中和劑進行中和。在乳酸的提取和純化過程中，要加入硫酸對乳酸鈣進行酸化，從而生成乳酸和不溶性的硫酸鈣。目前，每生產一頓乳酸就會產生一頓的乳酸鈣廢棄物。碳酸鈣作為中和劑的發酵工藝增加了分離提取的困難，而且影響產品質量，并且造成嚴重的環境問題和經濟浪費。在離子交換技術與膜技術基礎上發展起來的電滲析法是一種乳酸提取純化新工藝。該工藝降低了勞動強度，更重要的是避免了碳酸鈣的生成，減少了環境污染。在下游的乳酸提取純化過程中，商業化的雙極性電滲析膜可以使水電離出的H+和0H_分別與乳酸根和金屬陽離子結合，生成乳酸和堿，堿可被重復利用。但是，這種雙極性的膜對二價離子如Ca2+和Mg2+不耐受，因為二價離子會形成不可溶的堿從而破壞電滲析膜結構。為了利用這種環保節能的新技術，乳酸發酵過程中需要用一價離子的堿性物質作為中和劑，而NaOH就是這樣一種理想的中和劑。事實上，電滲析技術研究過程中，都是以NaOH與乳酸中和的產物乳酸鈉作為研究對象的。但是鑒于Na+對菌株的毒性，目前國內外利用NaOH作為中和劑進行的L-乳酸發酵都未能達到理想的效果。嗜堿微生物是一類最適pH在9.0以上的微生物類群。嗜堿菌除了能適應堿性環境外，對鹽環境尤其是一價鹽離子環境具有很好的耐受性。這樣的生理性質可以降低乳酸發酵過程中的污染機率。更重要的是，對于嗜堿乳酸菌來說，NaOH可以代替CaCOJt為中和劑來維持發酵過程中的pH，從而 避免產生不溶性鈣鹽。鑒于在乳酸發酵方面的這些優勢，嗜堿菌被認為是乳酸發酵方面的優秀潛力菌株。目前，中國專利中沒有涉及以嗜堿菌作為L-乳酸發酵菌株的報道。國外只有一篇利用嗜堿菌發酵生產乳酸的報道(Calabia et al., Biotechnol.Lett.,2011,33:1429-1433)，但是該報道中，L-乳酸產量、轉化率和光學純度分別只有65.8克/升，83%和98.8%，達不到工業化要求。申請號為200510119041.3的中國專利公開了一種采用中性菌干釀乳桿菌改組菌株(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)_Lc_F34 發酵生產 L-乳酸的方法，該菌株以葡萄糖和酵母抽提物為發酵基質，搖瓶補料分批發酵生產乳酸，產生177.6克/升的乳酸；以玉米漿和葡萄糖為發酵基質，30升發酵罐分批補料發酵生產乳酸，產生154.6克/升的L-乳酸。L-乳酸的生產成本是制約L-乳酸應用的關鍵因素之一。因此，尋找能夠低成本生產L-乳酸的技術成為研究的熱點。

發明內容
本發明的一個目的是提供芽孢桿菌屬菌株(Bacillus Sp.)WL_S20。本發明提供的芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.) WL-S20，其保藏號為CGMCCN0.5634。上述的芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCC N0.5634在制備L-乳酸中的應用也是本發明保護的范圍。本發明的另一個目的是提供一種生產L-乳酸的方法。本發明提供的方法，是發酵芽孢桿菌屬菌株(BaciIIus sp.) WL-S20 CGMCCN0.5634，收集發酵產物，即得到L-乳酸。在上述方法中，所述發酵用的發酵培養基按照如下方法制備:將碳源、氮源、MgSO4.7H20、K2HPO4.3H20、CH3COONa、MnSO4.H2O 和水混合，得到發酵培養基；所述碳源在所述發酵培養基中的濃度為60克/升-150克/升，所述氮源在所述發酵培養基中的濃度為10克/升-50克/升，所述MgSO4.7H20在所述發酵培養基中的濃度為O克/升-0.4克/升，K2HPO4.3H20在所述發酵培養基中的濃度為O克/升-4克/升，CH3COONa在所述發酵培養基中的濃度為O克/升-5克/升，MnSO4 -H2O在所述發酵培養基中的濃度為O克/升-0.06g克/升；所述MgSO4.7H20、所述K2HPO4.3H20、所述CH3C00Na、所述MnSO4.H2O在所述發酵培養基中的濃度均不為O克/升。在上述方法中，所述碳源在所述發酵培養基中的濃度為80克/升-130克/升；所述氮源在所述發酵培養基中的濃度為20克/升；所述碳源具體為葡萄糖(初糖)，所述氮源具體為花生柏。在上述方法中，在所述發酵前還包括將所述發酵培養基進行如下處理的步驟:向所述發酵培養基加入終濃度為0.10克/升-0.30克/升的中性蛋白酶在pH7.0、45°C條件下預處理6小時-10小時。在上述方法中，所述發酵的pH為9.0-10.0，所述調節發酵pH的中和劑為IOM的NaOH水溶液；所述發酵的溫度為35°C _45°C，所述發酵的時間為112小時-216小時。在上述方法中，所述發酵的通氣條件為前12小時以0.5升/分鐘通氣，然后停止通氣直到發酵結束。在上述方法中，所述發酵采用的攪拌轉速為200轉/分鐘，旋轉半徑為48mm。在上述方法中， 所述發酵采用補加葡萄糖水溶液的方式保持發酵的體系中葡萄糖濃度不低于20-50克/升；所述葡萄糖水溶液的濃度為800-1000克/升。
上述補加葡萄糖水溶液的補料方式:可采用多次脈沖補料方式，也可采用單次脈沖補料方式。多次脈沖補料方式具體為，初始葡萄糖濃度為60-100克/升，當發酵液中葡萄糖的濃度低于20克/升時，則一次加入800-1000克/升葡萄糖溶液40-60ml，在整個發酵過程中，需要多次補料操作。單次脈沖補料方式具體為，發酵培養基葡萄糖初始濃度為100-150克/升，在發酵過程中，當葡萄糖濃度低于50克/升時，一次性加入800-1000克/升葡萄糖溶液100-130ml，只需一次補料操作。因此上述菌株WL-S20為芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)，已于2011年12月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN0.5634，其分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp.。本發明的實驗證明，本發明提供了一株芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC N0.5634，其可以用來生產L-乳酸，以葡萄糖為底物，在45 °C條件下以98.6% -99.3%的轉化率高效發酵生產光學純度將近100%的L-乳酸，其中L-乳酸濃度最高可達225克/升。另外，本發明利用芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCCN0.5634生產L-乳酸，以花生柏為氮源，降低了發酵成本，以NaOH作為中和劑，可以簡化后期處理過程且減少環境污染。


圖1為芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.) WL-S20 CGMCC N0.5634發酵生產L-乳酸發酵過程曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL_S20的分離、鑒定1、WL-S20 的分離篩選培養基(克/升):葡萄糖10.0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，Κ2ΗΡ04.3Η20 1.0,MgSO4.7Η20 0.2，NaCl 50，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌20分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/v) Na2CO3 100ml。固體培養基則還需加入0.1-0.2克/升瓊脂。從內蒙古鄂爾多斯鹽堿湖湖邊取得泥樣。稱取5g泥樣于250ml三角瓶中，加入IOOml篩選培養基，充分混勻后用篩選培養基稀釋10，000倍涂布于固體篩選培養基，37°C培養3天，將長出的單菌落接種入裝有4ml篩選培養基的試管，在37°C條件下靜置培養24小時。培養結束時，取發酵液，6，000轉/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液。測定上清液中葡萄糖濃度、L-乳酸濃度和L-乳酸的光學純度。得到一株L-乳酸產量較高、L-乳酸光學純度接近100%、轉化率在95%以上的菌株，即WL-S20。檢測方法如下:葡萄糖的測定方法為將上述上清液用去離子水稀釋100-500倍，采用生物傳感分析儀SBA-40E(山東省科學院生物研究所)測定。

L-乳酸濃度的測定方法為，將上述I得到的上清液用去離子水稀釋100-500倍，采用生物傳感分析儀SBA-40E(山東省科學院生物研究所)測定。
生物傳感分析儀SBA-40E是以固定化酶為傳感器的分析儀器，L-乳酸與氧氣、水在L-乳酸氧化酶的催化下生成丙酮酸和雙氧水，葡萄糖與氧氣、水在葡萄糖氧化酶的催化下生成葡萄糖酸和雙氧水。反應放出的雙氧水與白金一銀電極接觸，并產生電流信號，該電流信號與葡萄糖或L-乳酸濃度成線性比例關系，通過測定電流信號強度可得出葡萄糖或L-乳酸濃度。L-乳酸純度采用Agillent 1100液相色譜分析儀(安捷倫科技有限公司)測定，MCI GEL CRSlOW手性分析柱，二極管陣列檢測器，檢測波長254nm，流動相5mM CuSO4，流速
0.5ml/分鐘，柱溫25°C，進樣量10μ I。L-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產品，貨號為L1750。D-乳酸標準品為Sigma-Aldrich公司產品，貨號為貨號為L0625。L-乳酸光學純度計算方法:L-乳酸光學純度(％) =L-乳酸濃度(克/升)/[L-乳酸濃度(克/升)+D-乳酸濃度(克/升)]X 100%轉化率計算方法:轉化率(％ ) = L-乳酸濃度(克/升)/葡萄糖消耗量(克/升)X 100%2、WL_S20的生理生化鑒定將WL-S20菌株在上述I中所述的固體篩選培養基上培養1-2天，觀察菌落形態，并用相差顯微鏡(ZESSI)觀察菌體形態。分別以20克/升葡萄糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和淀粉為碳源，培養基其他成分相同，為I克/升酵母粉、3克/升多聚蛋白胨、I 克 / 升 K2HPO4.3Η20、0.2 克 / 升 MgSO4.7Η20、0.005 克 / 升 MnSO4.H20,5 克/升CH3COONa和50克/升NaCl，以10%體積比的接種量接種于裝有IOOml上述培養基的250ml三角瓶中，在45°C條件下靜置培養12h。培養結束時，取發酵液，6，000轉/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液，測定L-乳酸的濃度。測定方法與上述I中相同。結果如下:WL_S20菌落形態無規則，邊緣不齊，表面干燥。細胞為桿狀，產內生芽孢。WL-S20菌株可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、蔗糖和麥芽糖為碳源產生乳酸，產量分別為18.3克/升、13.7克/升、14.7克/升、8.0克/升、8.7克/升、18.0克/升和9克/升，WL-S20菌株不能利用乳糖和淀粉作為碳源產生乳酸。上述菌株WL-S20初步鑒定為芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)，已于2011年12月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN0.5634，其分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp.。實施例2、芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCC N0.5634的應用方法一:1、發酵該實施例 中所用的培養基的組成如下:種子培養基(克/升):葡萄糖10.0，酵母粉5.0，聚蛋白胨5.0，Κ2ΗΡ04.3Η20 1.0,MgSO4.7Η20 0.2，NaCl 50，蒸餾水900ml，115°C高溫滅菌20分鐘后加入高溫滅菌的10%(w/V) Na2CO3IOOml。發酵培養基(克/升):葡萄糖80，花生柏(北京康明威培養基技術有限責任公司)20, MgSO4.7H20 0.35，K2HPO4.3H20 2，CH3COONa 1，MnSO4.H2O 0.03。115°C條件下滅菌20分鐘。
本發明發酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟:I)、活化培養:將保存的芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC N0.5634甘油菌液以體積比為4%接種量接種入裝液量為4ml的試管往復式搖床，200轉/分鐘，溫度37°C，培養12小時；2)、種子培養:將步驟I)的液體培養物，在無菌條件下接種于裝有IOOml種子培養基的250ml三角瓶中，40°C靜置培養8小時，制得種子培養液；3)、發酵培養:瑞士 Infors HT公司Multifors 1.4升發酵罐中加入700ml發酵培養基，以0.15克/升的終濃度加入過濾滅菌的中性蛋白酶(EC 3.4.24.28)，在pH7.0，45°C條件下處理花生柏8h。以10% (體積比)接種量接入上述種子液，發酵過程中，當發酵液葡萄糖濃度低于20克/升時，補加50ml 800克/升的葡萄糖一次，整個過程共補加4次。前12小時通氣0.5升/分鐘，然后停止通氣直到發酵結束，轉速為200轉/分鐘，旋轉半徑為48mm。利用IOM NaOH維持恒定pH9.0，45°C培養216小時結束發酵。每 隔4小時取一次發酵液，6，000轉/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液。2、檢測檢測方法與實施例1中所述相同。實驗共設3次重復，結果取平均值。結果如圖1A所示，上述I最終得到的發酵液中葡萄糖的濃度為O克/升，L-乳酸濃度225克/升，轉化率99.3%, L-乳酸光學純度100% (未檢測出D-乳酸)。方法二、1、發酵該實施例中所用的培養基的組成如下:種子培養基同方法一。發酵培養基(克/ 升):葡萄糖 130，花生柏 20，MgSO4.7H20 0.35，K2HPO4.3H202，CH3COONa I, MnSO4.H2O 0.03。115°C條件下滅菌 20 分鐘。本發明發酵法生產L-乳酸的方法包括以下步驟:I)活化培養:同方法一；2)種子培養:同方法一；3)發酵培養:瑞士 Infors HT公司Multifors 1.4升發酵罐中加入700ml發酵培養基，以0.15克/升的終濃度加入過濾滅菌的中性蛋白酶(EC 3.4.24.28)，在pH7.0，45°C條件下處理花生柏8h。以10% (體積比)接種量接入上述種子液，發酵過程中，當發酵液葡萄糖濃度低于50克/升時，補加IOOml 800克/升的葡萄糖一次，整個過程只補加I次。前12小時通氣0.5升/分鐘，然后停止通氣直到發酵結束，轉速為200轉/分鐘。利用IOMNaOH維持恒定pH9.0，45°C培養112小時結束發酵。每隔4小時取一次發酵液，6，000轉/分鐘，離心半徑為36mm，離心5分鐘，取上清液。2、檢測檢測方法與實施例1中所述相同。實驗共設3次重復，結果取平均值。結果如圖1B所示，上述I最終得到的發酵液中葡萄糖的濃度為O克/升，L-乳酸濃度180克/升，轉化率98.6%, L-乳酸光學純度100% (未檢測出D-乳酸)。
權利要求
1.芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)WL_S20，其保藏號為CGMCC N0.5634
2.權利要求1所述的芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)WL_S20 CGMCC N.5634在制備L-乳酸中的應用。
3.一種生產L-乳酸的方法，是發酵芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL_S20 CGMCCN0.5634，收集發酵產物，即得到L-乳酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于: 所述發酵用的發酵培養基按照如下方法制備:將碳源、氮源、MgSO4.7Η20、K2HPO4.3Η20、CH3COONa、MnSO4.H2O和水混合，得到發酵培養基； 所述碳源在所述發酵培養基中的濃度為60克/升-150克/升，所述氮源在所述發酵培養基中的濃度為10克/升-50克/升，所述MgSO4.7Η20在所述發酵培養基中的濃度為O克/升-0.4克/升，K2HPO4.3Η20在所述發酵培養基中的濃度為O克/升-4克/升，CH3COONa在所述發酵培養基中的濃度為O克/升-5克/升，MnSO4 -H2O在所述發酵培養基中的濃度為O克/升-0.06g克/升；所述MgSO4.7H20、所述K2HPO4.3H20、所述CH3C00Na、所述MnSO4.H2O在所述發 酵培養基中的濃度均不為O克/升。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于: 所述碳源在所述發酵培養基中的濃度為80克/升-130克/升； 所述氮源在所述發酵培養基中的濃度為20克/升； 所述碳源具體為葡萄糖，所述氮源具體為花生柏。
6.根據權利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于: 在所述發酵前還包括將所述發酵培養基進行如下處理的步驟:向所述發酵培養基加入終濃度為0.10克/升-0.30克/升的中性蛋白酶在pH7.0、45°C條件下預處理6小時-10小時。
7.根據權利要求3-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述發酵的PH為9.0-10.0，所述調節發酵pH的中和劑為IOM的NaOH水溶液； 所述發酵的溫度為35°C _45°C，所述發酵的時間為112小時-216小時。
所述發酵的通氣條件為前12小時以0.5升/分鐘通氣，然后停止通氣直到發酵結束。
8.根據權利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于:所述發酵采用的攪拌轉速為200轉/分鐘，所述發酵的旋轉半徑為48mm。
9.根據權利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于: 所述發酵采用補加葡萄糖水溶液的方式保持發酵的體系中葡萄糖濃度不低于20-50克/升； 所述葡萄糖水溶液的濃度為800-1000克/升。
全文摘要
本發明公開了一種生產L-乳酸的方法及其專用芽孢桿菌屬菌株。本發明所提供的芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL-S20，其保藏號為CGMCC NO.5634。上述的芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC NO.5634在制備L-乳酸中的應用。本發明的實驗證明，本發明提供了一株芽孢桿菌屬菌株(Bacillus sp.)WL-S20 CGMCC NO.5634，其可以用來生產L-乳酸，以葡萄糖為底物，在45℃條件下以98.6％-99.3％的轉化率高效發酵生產光學純度將近100％的L-乳酸，其中L-乳酸濃度最高可達225克/升。
文檔編號C12P7/56GK103194402SQ201210004678
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者馬延和, 孟瑩, 薛燕芬, 于波 申請人:中國科學院微生物研究所