專利名稱：放線菌制劑及其在防治植物寄生性線蟲方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物發酵制品，尤其涉及一種放線菌制劑及其在殺滅或抑制植物寄生性線蟲方面的應用以及利用該放線菌制劑為活性成分制備的殺蟲劑，屬于生物農藥技術領域。
背景技術：
農用殺蟲制劑要求具有較低毒性及低殘留性質。農用抗生素低毒低殘留，能夠抑制病原微生物的生長和繁殖，或者能改變病原菌的形態而達到保護作物的效果。放線菌的突出特性就是能產生大量的、種類繁多的抗生素，是產抗生素最多的一類微生物。抗生素的生物學作用廣泛，多數抗生素都能不同程度的表現出抗菌活性，少數種類還具有抗病毒、抗其它病原體、抗腫瘤活性。如申請號為200610122277. 7的中國發明專利，公開了一種土壤放線菌發酵液的提取物及其制備方法和應用。提取物的制備方法如下將高氏一號培養基制成試管斜面或茄子瓶斜面，接菌株孢子涂斜面，28°C培養7 10天；將斜面中成熟菌株制成孢子懸浮液，接入液體發酵培養基中進行液體發酵培養，接種量為8 16%，通氣量為 1 0. 6 1. 2 V/Vmin,發酵溫度為沈 32°C，發酵培養周期為72 108小時，得到發酵液； 將發酵液離心分離，棄去上清液，保留菌絲，用體積百分比為60 80%丙酮浸泡菌絲8 M 小時，離心除去菌絲體，保留濾液；用大孔吸附樹脂對濾液進行吸附，用丙酮洗脫，對洗脫液進行減壓濃縮，得到棕色油狀物，即為土壤放線菌發酵液的提取物；所述菌株為土壤放線菌 ⑶PPRA 3704，在中國典型培養物保藏中心保藏，菌種保藏號為CCTCC No: M 2060670。小菜蛾和中華鰻對該提取物較敏感，較低濃度已具有殺滅作用，可望制成生物農藥，具有較高的經濟和社會效益。然而，據申請人了解，關于放線菌制劑防治植物寄生性線蟲方面報道很少，而有明顯防治效果的更是鮮見。

發明內容
本發明的目的是為解決上述技術問題，提供一種能夠殺滅或抑制植物寄生性線蟲的放線菌制劑。本發明所述的放線菌，拉丁學名為Micromonospora humi。本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的
放線菌制劑，它是由以下方法制備的①對土壤樣本進行放線菌的分離操作，獲得放線菌菌種；②對所述放線菌菌種進行發酵培養，具體為將所述菌種接種至培養基，在20 30°C溫度下，200rpm震蕩培養5 10d，得發酵液；③發酵完成后，加入多于發酵液體積的甲醇，然后攪拌、離心分離、取上清液，然后對上清液進行蒸發濃縮以除去所述甲醇。作為上述技術方案的優選，所述土壤是紅樹林中的土壤。該土壤的選取方法如下，在離目標樹種2 m內的范圍內，選擇表土下5 20厘米深度的土壤。作為上述技術方案的優選，所述培養基為，以重量百分比計，可溶性淀粉1 5%，葡萄糖0. 5 3%，酵母膏0. 1 0. 2%,酪蛋白0. 15 0. 4%,牛肉膏0. 1 0. 2%,碳酸鈣 0. 1 0. 3%，余下為水。作為上述技術方案的優選，所述甲醇的加入量為所述發酵液體積的小于等于2 倍，對上清液進行蒸發濃縮時，將上清液濃縮至所述發酵液體積的1/4 1/3。加入甲醇的目的，一是把發酵液中的某些成分溶解出來，包括存在于放線菌菌體內的能夠殺滅或者抑制植物寄生性線蟲的物質，二是使發酵液各成分更穩定；在隨后的蒸發過程會把甲醇除去，然后獲得較為純凈的制劑。作為上述技術方案的優選，在所述發酵液中加入甲醇后，用磁力攪拌器攪拌過夜。作為上述技術方案的優選，在離心分離時，轉速3500 4500rpm，時間8 12min。作為上述技術方案的優選，所述甲醇的加入量為所述發酵液體積的小于等于2 倍，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后離心分離，得上清液，然后對上清液進行蒸發濃縮的操作以除去甲醇，濃縮至所述發酵液體積的1/4 1/3。本發明的另一個目的是提供用拉丁學名為Micromonospora humi的放線菌制成的制劑在防治植物寄生性線蟲方面的應用。本發明的再一個目的是提供上述任一放線菌制劑的在防治植物寄生性線蟲方面的應用。本發明的還有一個目的是提供一種由上述任一放線菌制劑為活性成分的殺線蟲制劑。本發明具有以下有益效果
本發明提供的一種放線菌制劑在處理植物寄生性線蟲時具有有效的殺滅或抑制作用。
具體實施例方式本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其并不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書后可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的權利要求范圍內都受到專利法的保護。實施例一 (一)菌種的制備 1 土壤樣品
于2008年6月，在海南省文昌清瀾港紅樹林保護區采集紅樹林植物的土壤。2培養基
麥芽汁一酵母膏瓊脂(YE)、淀粉酪素瓊脂(SC)、葡萄糖天冬氨酸瓊脂(GA ) 3采樣方法
土壤樣品是在離目的樹種1 2 m的范圍內，選擇表土下5 20厘米深度的土壤，將土壤裝入滅菌的紙帶里，編號注明采土時間，地點，地表植被等。樣品采集后放入無菌塑料封口袋內，冷藏，迅速運回實驗室并立即進行樣品處理。4 步驟
1)稱取2g樣品到含有1. 5%苯酚或0. 05% SDS、6%酵母膏的20mL無菌海水中，30°C、 200r/min 下振蕩 30min ；
2)然后取1 ml按梯度稀釋法稀釋至10_3、10_4和10_5，各取0. 2 ml分別涂平板，平板培養基分別為麥芽汁一酵母膏瓊脂(YE)、淀粉酪素瓊脂(SC)、葡萄糖天冬氨酸瓊脂(GA )；
3)培養7 10d，挑菌；
4)待平板長菌落出后，菌株用光電顯微鏡(型號XS-212-202)，在油鏡下觀察菌落形態；
5)挑菌落待平板長出菌落后，鑒定微生物類群，并根據鏡檢結果，判斷是否已分離到了純菌種；對于已經提純的菌種，轉至斜面培養基，用牛皮紙包好，置-20°C冰箱中保存。(二)發酵培養
對所述放線菌菌種進行發酵培養，具體為將所述菌種接種至培養基，在20°C溫度下， 200rpm震蕩培養5d，得發酵液；發酵完成后在發酵液中加入1倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后3500rpm，8min離心分離，取上清液，然后用旋轉蒸發儀對上清液進行蒸發濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發酵液體積的1/4，制得放線菌制劑。所述培養基配方為以重量百分比計，可溶性淀粉1%，葡萄糖0. 5%，酵母膏0. 1%， 酪蛋白0. 15%，牛肉膏0. 1%，碳酸鈣0. 1%，余下為水，pH 7.0 9.0。實施例二
(一)菌種的制備
采用實施例一所得的菌種
(二)發酵培養
對所述放線菌菌種進行發酵培養，具體為將所述菌種接種至培養基，在22°C溫度下， 200rpm震蕩培養6d，得發酵液；發酵完成后在發酵液中加入1倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后4000rpm，9min離心分離，取上清液，然后用旋轉蒸發儀對上清液進行蒸發濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發酵液體積的1/4，制得放線菌制劑。所述培養基配方為以重量百分比計，可溶性淀粉洲，葡萄糖1%，酵母膏0. 1%，酪蛋白0. 2%，牛肉膏0. 1%，碳酸鈣0. 1%，余下為水，pH 7. 0 9. 0。實施例三
(一)菌種的制備
采用實施例一所得的菌種
(二)發酵培養
對所述放線菌菌種進行發酵培養，具體為將所述菌種接種至培養基，在溫度下， 200rpm震蕩培養7d,得發酵液；發酵完成后在發酵液中加入1. 5倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后4000rpm，IOmin離心分離，取上清液，然后用旋轉蒸發儀對上清液進行蒸發濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發酵液體積的1/4，制得放線菌制劑。所述培養基配方為以重量百分比計，可溶性淀粉3%，葡萄糖洲，酵母膏0. 15%，酪蛋白0. 3%，牛肉膏0. 1%，碳酸鈣0. 2%，余下為水，pH 7. 0 9. 0。實施例四
(一)菌種的制備
采用實施例一所得的菌種
(二)發酵培養
對所述放線菌菌種進行發酵培養，具體為將所述菌種接種至培養基，在26°C溫度下，200rpm震蕩培養8d，得發酵液；發酵完成后在發酵液中加入2倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后4000rpm，IOmin離心分離，取上清液，然后用旋轉蒸發儀對上清液進行蒸發濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發酵液體積的1/3，制得放線菌制劑。所述培養基配方為以重量百分比計，可溶性淀粉4%，葡萄糖2%，酵母膏0. 2%，酪蛋白0. 3%，牛肉膏0. 2%，碳酸鈣0. 2%，余下為水，pH 7. 0 9. 0。實施例五
(一)菌種的制備
采用實施例一所得的菌種
(二)發酵培養
對所述放線菌菌種進行發酵培養，具體為將所述菌種接種至培養基，在溫度下， 200rpm震蕩培養9d，得發酵液；發酵完成后在發酵液中加入2倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后4000rpm，Ilmin離心分離，取上清液，然后用旋轉蒸發儀對上清液進行蒸發濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發酵液體積的1/3，制得放線菌制劑。所述培養基配方為以重量百分比計，可溶性淀粉4%，葡萄糖3%，酵母膏0. 2%，酪蛋白0. 3%，牛肉膏0. 2%，碳酸鈣0. 2%，余下為水，pH 7. 0 9. 0。實施例六
(一)菌種的制備
采用實施例一所得的菌種
(二)發酵培養
對所述放線菌菌種進行發酵培養，具體為將所述菌種接種至培養基，在30°C溫度下， 200rpm震蕩培養10d，得發酵液；發酵完成后在發酵液中加入2倍體積的甲醇，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后4500rpm，12min離心分離，取上清液，然后用旋轉蒸發儀對上清液進行蒸發濃縮以除去所述甲醇，濃縮至所述發酵液體積的1/3，制得放線菌制劑。所述培養基配方為以重量百分比計，可溶性淀粉5%，葡萄糖3%，酵母膏0. 2%，酪蛋白0. 4%，牛肉膏0. 2%，碳酸鈣0. 3%，余下為水，pH 7. 0 9. 0。實施例二放線菌制劑殺根結線蟲活性測定 1.方法
①將土和沙按一定比例均與攪拌，裝入盆中；
②移栽10天的黃瓜苗一株；
③打入300ul的待試藥品；
④處理一天；
⑤打入3000個根結線蟲蟲卵；
⑥40天后觀察黃瓜苗根部情況。2.根結線蟲發病等級判定標準 數字0 10個；
M級10 20個； 3.實驗結果
權利要求
1.放線菌制劑，它是由以下方法制備的①對土壤樣本進行放線菌的分離操作，獲得放線菌菌種；②對所述放線菌菌種進行發酵培養，具體為將所述菌種接種至培養基，在 20 30°C溫度下，200rpm震蕩培養5 10d，得發酵液；③發酵完成后，加入多于發酵液體積的甲醇，然后攪拌、離心分離、取上清液，然后對上清液進行蒸發濃縮以除去所述甲醇。
2.根據權利要求1所述的一種放線菌制劑，其特征在于所述土壤是紅樹林中的土壤。
3.根據權利要求1或2所述的一種放線菌制劑，其特征在于所述培養基為，以重量百分比計，可溶性淀粉1 5%，葡萄糖0. 5 3%，酵母膏0. 1 0. 2%，酪蛋白0. 15 0. 4%，牛肉膏0. 1 0. 2%，碳酸鈣0. 1 0. 3%，余下為水。
4.根據權利要求1或2所述的一種放線菌制劑，其特征在于所述甲醇的加入量為所述發酵液體積的小于等于2倍，用旋轉蒸發儀對上清液進行蒸發濃縮時，將上清液濃縮至所述發酵液體積的1/4 1/3。
5.根據權利要求1或2所述的一種放線菌制劑，其特征在于在所述發酵液中加入甲醇后，用磁力攪拌器攪拌過夜。
6.根據權利要求1或2所述的一種放線菌制劑，其特征在于在離心分離轉速3500 4500rpm，時間 8 12min。
7.根據權利要求3所述的一種放線菌制劑，其特征在于所述甲醇的加入量為所述發酵液體積的小于等于2倍，然后用磁力攪拌器攪拌過夜，然后離心分離，得上清液，然后對上清液進行旋轉蒸發濃縮的操作以除去甲醇，濃縮至所述發酵液體積的1/4 1/3。
8.用拉丁學名為Micromonosporahumi的放線菌制成的制劑在防治植物寄生性線蟲方面的應用。
9.權利要求1-7任一所述的放線菌制劑在防治植物寄生性線蟲方面的應用。
10.一種殺線蟲制劑，其特征在于，它是由權利要求1-7任一所述的放線菌制劑為活性成分制備的。
全文摘要
本發明涉及放線菌制劑及其在防治植物寄生性線蟲方面的應用。屬于生物農藥技術領域。本發明公開了用拉丁學名為Micromonosporahumi的放線菌制成的制劑在防治植物寄生性線蟲方面的應用，公開了一種放線菌制劑，公開了所述的放線菌制劑在防治植物寄生性線蟲方面的應用，也公開了由所述的放線菌制劑為活性成分制備的殺線蟲劑。本發明提供的一種放線菌制劑在處理植物寄生性線蟲時具有有效的殺滅或抑制作用。
文檔編號C12P1/06GK102533869SQ201210009989
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者張海風, 張莉, 張鵬, 徐玲娜, 洪葵, 高丙利 申請人:高丙利