專利名稱：一株產β-半乳糖苷酶的菌株和用該酶生產低聚半乳糖的方法
技術領域：
本發明涉及能夠生產β -半乳糖苷酶的一種微生物菌株及其培養發酵生產β -半乳糖苷酶，并將該酶用于生物制備低聚半乳糖的方法，屬于食品生物技術領域。更具體的說，本發明涉及來源于土壤的弗氏志賀氏菌flexneri) 22. 001，保藏編號為 CCTCC NO =M 2011463。它能夠產生β-半乳糖苷酶，并利用該β _半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖(Galactoo ligosacchar ides)。
背景技術：
近年來，功能食品成為廣大消費者關注的熱點，更是廣大食品從業者研發的焦點。 糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低齡化，使得低熱量、具有更多功能營養特性的功能性甜味劑成為關注的熱點。低聚半乳糖是由半乳糖基和葡萄糖基構成的聚合度為2 8的低聚糖，具有低分子量水溶性膳食纖維的特點，黏度低，水溶性好，不結合礦物質，口感清爽，熱值較低，甜度為蔗糖的20%-40%;對酸和熱都很穩定，在180°C或pH 3. O條件下不分解。低聚半乳糖還具有非致齲齒性、非消化性、促進腸道雙岐桿菌增殖等生理功能。因此，低聚半乳糖作為一種功能性食品添加劑廣泛應用于乳制品、糖果、罐頭等食
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ΡΠ O酶法合成是工業化生產低聚半乳糖的主要途徑。β -半乳糖苷酶屬于水解酶類，同時具有轉移酶類性質。一方面，β-半乳糖苷酶可以催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖，另一方面，還可以催化半乳糖基轉移至乳糖等受體上的轉移反應。酶法合成低聚半乳糖的產率受多種因素影響，酶的來源直接影響酶法合成的低聚半乳糖的結構和產率。迄今為止，已發現多種微生物可以產生此酶，其中主要集中在米曲霉 (A. orj^ae)、黑曲霉認fli^r)和乳酸克魯維酵母Of. Iactis).本發明人深入調查和研究了現有技術并對各種高收率生產低聚半乳糖的方法進行了研究，最終我們篩選到一株能產生半乳糖苷酶的新微生物，證明了通過此酶與高濃度的乳糖反應能得到高轉化率的低聚半乳糖，并通過濃縮干燥等手段得到低聚半乳糖的糖漿或粉末。基于上述發現提出了本發明。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的微生物，它能夠生產高酶活的β -半乳糖苷酶。本發明的另一個目的是提供一種該β -半乳糖苷酶與高濃度乳糖溶液反應的方法，以得到高轉化率的低聚半乳糖。本發明的再一個目的是提供一種低聚半乳糖提純與精制的方法，以得到高濃度的低聚半乳糖糖漿或粉末。為了實現上述目的，本發明提供一種來源于土壤的弗氏志賀氏菌flexneri^\ 22. 001，其為能夠產生β -半乳糖苷酶的菌株，并利用該β -半乳糖苷酶轉化乳糖生成低聚半乳糖。本發明的技術方案一株產半乳糖苷酶的菌株，其分類命名為弗氏志賀氏菌 (.Shigella fIexneri)^ 22. 001，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2011463。用所述的微生物弗氏志賀氏菌CCTCC NO =M 2011463，發酵生產β -半乳糖苷酶的方法，步驟為
(1)種子培養
種子培養基乳糖l_20g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l-10g/L，pH7. 0，去離子水配制； 種子培養條件=CCTCC NO =M 2011463菌株于30-37°C、100-250rpm的振蕩速度下在種子培養基中培養10-20h活化該菌株；
(2)發酵培養
發酵培養基乳糖l_30g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，氯化鈣0. llg/L，硫酸錳 0.001 g/L，硫酸鎂0. 3 g/L，磷酸二氫鉀0.05 g/L，硫酸鐵0.03 g/L，pH7. 0，去離子水配制； 發酵條件在30-37°C、攪拌速度100-700rpm、空氣流量0. 1-1. Ovvm的條件下在發酵培養基中發酵10_30h生產β -半乳糖苷酶；
(3)發酵后處理
發酵液經冷凍離心后收集濕菌體，用ΡΗ7. 0的0. lmol/L磷酸鹽緩沖液制成菌懸液，然后菌體細胞破壁提取出β-半乳糖苷酶；冷凍離心后，收集的上清液即為粗酶液，經檢測酶活達到 1-100 U/mL ；
或β -半乳糖苷酶粗酶液進一步超濾濃縮，或用硫酸銨沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到半乳糖苷酶的粗酶粉。用制備的β -半乳糖苷酶轉化乳糖生產低聚半乳糖的方法，向底物乳糖溶液中添加半乳糖苷酶進行催化轉化，轉化反應條件為乳糖溶液的乳糖質量濃度為5%-65%，酶對底物用量為0. l-100U/g乳糖干基計，pH5. 0-8. 0，轉化反應溫度為40_55°C，轉化反應時間4-36h，轉化率可達40%以上，得到含有低聚半乳糖的酶反應液，進一步加工處理制備低聚半乳糖糖漿或低聚半乳糖粉末。低聚半乳糖糖漿的制備方法，步驟為
(1)脫色
在含有低聚半乳糖的酶反應液中添加酶反應液固形物質量含量ο. 2%-2. 0%的活性炭， 在50-80°C下溫育10-60min，然后進行硅藻土過濾，取脫色液；
(2)濃縮
將脫色液真空蒸發濃縮至固形物含量為20%-80%，即得低聚半乳糖糖漿。低聚半乳糖粉末的制備方法，步驟為
(1)脫色
同制備低聚半乳糖糖漿所述的脫色步驟；
(2)濃縮
將脫色液真空蒸發濃縮至固形物含量為20%-80%的濃縮液；
(3)噴霧干燥將麥芽糊精與以固形物含量干基計的低聚半乳糖濃縮液按照重量比1:1-1:5的比例混合，控制進風溫度170-180°C、出風溫度70-80°C，噴霧干燥，得到含麥芽糊精的低聚半乳糖粉末。本發明的有益效果本發明涉及一株從土壤中篩選而來的弗氏志賀氏菌 (.Shigella flexneri) SK 22. 001，保藏編號為 CCTCC NO :M 2011463。以此菌為發酵菌株， 以乳糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源及無機鹽等組成發酵培養基，發酵生產半乳糖苷酶，發酵后經檢測，在發酵液中酶活達到1-100 U/mL。將β-半乳糖苷酶添加到5%-65% 乳糖溶液中催化合成低聚半乳糖，轉化4-36 h，轉化率達40%以上。本發明方法生產的低聚半乳糖產品安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性甜味劑。生物材料樣品保藏一株用于微生物轉化發酵生產β -半乳糖苷酶的菌株，其分類命名為弗氏志賀氏菌fIexneri^ 22. 001，已保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 2011463，保藏日期2011 年12月12日。


圖1實施例2中制備所得低聚半乳糖的高效液相色譜圖。
具體實施例方式以下是弗氏志賀氏菌SK 22. 001進行發酵生產β-半乳糖苷酶及酶法轉化生產低聚半乳糖的實施例，但本發明并不限于所列出的幾個實例。實施例1微生物發酵產酶
用SK 22. 001進行培養發酵，按說明書所述的發酵條件，通過對不同發酵時間產酶的檢測，發現發酵21h時酶活達到最高值，故確定發酵時間為21h左右。發酵時間對產β-半乳糖苷酶的影響如表1所示。酶活力定義為ImL酶液Imin催化鄰硝基酚β -D-半乳糖苷 (ONPG)水解生成1 μ mol鄰硝基酚(ONP)為一個酶活力單位。表1發酵時間對產β -D-半乳糖苷酶的影響
權利要求
1.一株產β-半乳糖苷酶的菌株，其分類命名為弗氏志賀氏菌flexneri) SK 22. 001，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2011463。
2.用權利要求1所述的CCTCCNO =M 2011463菌株發酵生產β -半乳糖苷酶的方法， 其特征在于步驟為(1)種子培養種子培養基乳糖l_20g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l-10g/L，pH7. 0，去離子水配制；種子培養條件=CCTCC NO =M 2011463菌株于30-37°C、100-250rpm的振蕩速度下在種子培養基中培養10-20h活化該菌株；(2)發酵培養發酵培養基乳糖l_30g/L，酵母膏l_20g/L，蛋白胨l_20g/L，氯化鈣0. llg/L，硫酸錳 0.001 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.05 g/L，硫酸鐵0.03 g/L，pH7. 0，去離子水配制;發酵條件接種量1%_10%，在30-37°C、攪拌速度100-700rpm、空氣流量0. 1-1. Ovvm的條件下在發酵培養基中發酵10-30h生產β -半乳糖苷酶；(3)發酵后處理發酵液經冷凍離心后收集濕菌體，用ΡΗ7. 0的0. lmol/L磷酸鹽緩沖液制成菌懸液，然后菌體細胞破壁提取出β-半乳糖苷酶；冷凍離心后，收集的上清液即為粗酶液，經檢測酶活達到 1-100 U/mL ；或β -半乳糖苷酶粗酶液進一步超濾濃縮，或用硫酸銨沉淀蛋白質，離心和冷凍干燥得到半乳糖苷酶的粗酶粉。
3.用權利要求2所述方法制備的半乳糖苷酶轉化乳糖生產低聚半乳糖的方法，其特征在于向底物乳糖溶液中添加半乳糖苷酶進行催化轉化，轉化反應條件為乳糖溶液的乳糖質量濃度為5%-65%，酶對底物用量為0. l-100U/g乳糖干基計，pH5. 0-8. 0，轉化反應溫度為40-55°C，轉化反應時間4-36h，轉化率達40%以上，得到含有低聚半乳糖的酶反應液， 進一步加工處理制備低聚半乳糖糖漿或低聚半乳糖粉末。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于低聚半乳糖糖漿的制備方法，步驟為(1)脫色在含有低聚半乳糖的酶反應液中添加酶反應液固形物質量含量0. 2%-2. 0%的活性炭， 在50-80°C下溫育10-60min，然后進行硅藻土過濾，取脫色液；(2)濃縮將脫色液真空蒸發濃縮至固形物質量含量為20%-80%，即得低聚半乳糖糖漿。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于低聚半乳糖粉末的制備方法，步驟為(1)脫色同制備低聚半乳糖糖漿所述的脫色步驟；(2)濃縮將脫色液真空蒸發濃縮至固形物質量含量為20%-80%的濃縮液；(3)噴霧干燥將麥芽糊精與以固形物含量干基計的低聚半乳糖濃縮液按照重量比1:1-1:5的比例混合，控制進風溫度170-180°C、出風溫度70-80°C，噴霧干燥，得到含麥芽糊精的低聚半乳糖粉末。
全文摘要
一株產β-半乳糖苷酶的菌株和用該酶生產低聚半乳糖的方法，屬于食品生物技術領域。本發明涉及一株從土壤中篩選而來的弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)SK22.001，保藏編號為CCTCCNOM2011463。以該菌株為發酵菌株，以乳糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為氮源及無機鹽組成發酵培養基，發酵生產β-半乳糖苷酶，發酵后經檢測，在發酵液中酶活達到1-100U/mL。將β-半乳糖苷酶添加到5%-65%乳糖溶液中催化合成低聚半乳糖，轉化4-36h，轉化率達40%以上。本發明方法生產的低聚半乳糖產品安全可靠，是一種很有市場潛力的功能性甜味劑。
文檔編號C12R1/01GK102433291SQ201210012040
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月16日 優先權日2012年1月16日
發明者張濤, 江波, 沐萬孟, 繆銘, 陳真真 申請人:江南大學