專利名稱：結核分枝桿菌Wag31基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種結核分枝桿菌基因Wag31及其應用。
背景技術：
結核分枝桿菌O^cohcteriWB to力ercWosis)是人類健康的嚴重威脅。近年來， 中國結核分枝桿菌感染形式不容樂觀，有愈演愈烈的趨勢。結核分枝桿菌感染人體后，可侵入巨噬細胞并長期存活，引起肺部肉芽腫的形成，并與巨噬細胞為主的免疫細胞存在復雜的細菌-宿主相互作用。解析它們之間相互作用機理，對于理解結核分枝桿菌感染機制，提出新的控制結核分枝桿菌感染的方法意義重大。Wag31，是DivIVA同源蛋白，在結核分枝桿菌中保守存在。近期研究表明，wag31廣泛參與到結核分枝桿菌的極點生長與細胞壁合成，對菌體生長分裂和菌體形態的維持有重要影響。我們在實驗中發現，wag31可以結合淋巴細胞趨化因子)(CL2。)(CL2由巨噬細胞產生，可以趨化影響樹突狀細胞、T細胞等多種免疫細胞。進一步的研究表明，Wag31可以誘導)(CL2在巨噬細胞中的表達，這提示我們wag31可能在細菌-宿主相互作用、肺部肉芽腫的形成起到關鍵作用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種重組表達結核分枝桿菌Wag31的方法，得到含有 wag31蛋白序列的重組蛋白Wag31。本發明還提供相應的重組質粒。本發明提供一種重組蛋白Wag31，該重組蛋白是將結核分枝桿菌wag31的基因片段插入pET30a質粒中，構建表達結核分枝桿菌Wag31的重組工程菌，轉化大腸桿菌表達株 BL21 (DE3)中，表達出的含有wag31蛋白序列的重組蛋白。具體步驟為以標準毒株H37Rv 的基因組作為模板，用PCR法擴增Wag31的基因片段，并將該基因重組到表達型質粒pET30a 中，該重組質粒轉化至大腸桿菌表達株BL21 (DE3)中表達蛋白Wag31。本發明提供的重組蛋白Wag31與NCBI中NP_216661. 1蛋白序列相比，加入了表達標簽His tag和表達載體上的一小段序列。表達的Wag31蛋白攜帶6X his-tag，分子質量四.71 1，用親和純化法得到的蛋白Wag31蛋白純度好，得率高，可為進一步的生物學研究創造條件。本發明所用的宿主細胞應當與表達質粒相匹配，可使用原核細胞或者真核細胞等，例如常用的大腸桿菌(Escherichia coli)。可用于轉化的宿主細胞可以是BL21 (DE3) 菌株，本發明的一個實施例中用的是BL21 (DE3)菌株。本發明還提供一種重組質粒，該重組質粒是含有原核生物的啟動子序列和結核分枝桿菌wag31的基因片段。具體是將Wag31基因序列插入一般的商用表達質粒中。Wag31 基因的NCBI登錄號為NC_000962. 2，蛋白的NCBI登錄號為NP_216661. 1。本發明所述的“Wag31基因序列”也包括對NC_000962. 2中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與 NC_000962. 2核苷酸序列同源性低至約70%的兼并序列也能編碼出相同的氨基酸序列，該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與NC_000962. 2的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與NC_000962. 2的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳的至少80%，更佳的至少90%的核苷酸序列。本發明的重組質粒，通常將Wag31基因插入表達質粒的多克隆位點即得。重組質粒制備過程中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，然后將編碼本發明的核苷酸序列可操作的連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。本發明所采用的載體有PET3M， pET28a, pET30a等。在本發明的一個實施例中，所用的質粒是pET30a。本發明還提供在真核細胞中表達結核分枝桿菌Wag31蛋白的方法，具體步驟是以標準毒株H37Rv的基因組作為模板，用PCR法擴增Wag31的基因片段，并將該基因重組到真核表達質粒pcDNA3. Ι/HisA中，該重組質粒轉染至THP-I細胞中表達蛋白Wag31。表達的 Wag31蛋白攜帶6X his-tag。可使用His抗體，western blot法檢驗細胞中Wag31蛋白表達水平。本發明的一個方面，提供了一種新的重組質粒，即將Wag31基因序列插入一般的商用真核表達質粒中。Wag31基因的NCBI登錄號為NC_000962. 2，蛋白的NCBI登錄號為 NP_216661. 1。本發明中的“Wag31基因序列”也包括對NC_000962. 2中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與 NC_000962. 2核苷酸序列同源性低至約70%的兼并序列也能編碼出相同的氨基酸序列，該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與NC_000962. 2的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與NC_000962. 2的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳的至少80%，更佳的至少90%的核苷酸序列。本發明的重組質粒，通常將Wag31基因插入表達質粒的多克隆位點即得。本發明的重組質粒制備過程中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，然后將編碼本發明的核苷酸序列可操作的連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。本發明的另一方面，提供了一種結核分枝桿菌相關的重組蛋白，即重組蛋白是將插入Wag31基因片段的重組表達質粒轉化入宿主細胞而得到的。在本發明的實施例中，Wag31重組蛋白與NCBI中NP_216661. 1蛋白序列相比，加入了表達標簽His tag和表達載體上的一小段序列。所用的宿主細胞應當與表達質粒相匹配，可使用真核細胞等，例如常用的THP-I 細胞。本發明還提供檢驗Wag31與THPl細胞中)(CL2相互作用的方法，具體步驟如下將以上的pcDNA3. l/HisA-ffag31重組質粒轉染經PMA誘導分化的THPl細胞。在二氧化碳濃度 5%的培養箱中，37度培養，然后進行如下兩種操作1.分時間梯度裂解細胞，并抽提mRNA， 使用real-time PCR法檢測細胞中)(CL2的mRNA水平變化；2.分時間梯度裂解細胞，并使用western blot法檢測細胞中)(CL2蛋白的表達量變化。具體步驟可見實施例3。本發明還提供所述的wag31重組蛋白在構建重組BCG疫苗方面的應用，即利用結核分枝桿菌Wag31的蛋白，作為疫苗組分，構建重組BCG疫苗。在該應用中，可將wag31基因片段由H37Rv基因組中擴增得到，作為唯一 DNA片段或片段之一插入可在BCG菌株中穩定表達的質粒，并將該重組質粒轉化入感受態BCG菌體中，表達wag31蛋白，獲得過表達wag31蛋白的重組BCG疫苗。
本發明還提供一種DNA疫苗配方，即利用結核分枝桿菌Wag31的基因片段，作為 DNA疫苗基因片段的一部分，構建DNA疫苗。 在該應用中，可將wag31基因片段由H37Rv基因組中擴增得到，作為唯一 DNA片段或片段之一插入可在真核細胞中中穩定表達的質粒(如PVAX系列質粒)，并將該重組質粒轉移入實驗動物中，使其發揮免疫保護效果。本發明還提供一種亞單位疫苗配方，即利用所述表達結核分枝桿菌Wag31蛋白， 作為亞單位疫苗組分。在該應用中，可利用由上述原核細胞表達體系中獲得的wag31蛋白，作為唯一蛋白或蛋白成分之一，伴同一般商用免疫佐劑，注射如實驗動物中，使其發揮免疫保護效果。


圖1原核表達wag31蛋白電泳圖，泳道7顯示純化后的蛋白條帶。圖2顯示內源性)(CL2與wag31的免疫共沉淀實驗。圖 3 wag31 誘導 THP-I 細胞表達 XCL2。( β -actin 為內參)。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應當理解，這些實施例僅用于說明本發明，并不限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明闡述內容后，本領域技術人員對發明的各種改動或修改，同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1 原核表達結核分枝桿菌Wag31蛋白。1)大腸桿菌感受態制備
大腸桿菌Dffia接種于LB培養基中，37攝氏度，搖床轉速200rpm，培養過夜；培養結束收集菌體，12000rpm, 4攝氏度離心，IOmin0棄掉上清，輕輕振松菌塊，慢慢加入預冷的 CaCl2溶液重懸菌體，冰浴后離心，棄掉上清。重新使用CaC12溶液重懸菌體，冰浴池，4度保存。2)原核表達質粒的構建
以標準毒株H37Rv的基因組作為模板，用PCR法擴增Wag31的基因片段，并將該基因重組到表達型質粒pET30a中，轉化大腸桿菌Dffia。測序鑒定wag31片段與NCBI序列 NC_000962. 2完全相同的質粒作為表達質粒。3)表達質粒轉化大腸桿菌感受態。將鑒定好的，攜帶Wag31基因片段的重組質粒加入到1)中所述感受態細胞中，冰浴30min，之后42攝氏度水浴45s，最后冰上靜置aiiin。向熱轉化后的感受態細胞中加入無抗生素的LB培養基中，37攝氏度培養45min，涂布攜帶相應抗性的LB平板，在37攝氏度溫箱中倒置培養過夜。4 )表達并純化Wag31蛋白
從轉化的平板上挑取單菌落，接種于LB培養基中，37攝氏度培養過夜，至對數期時，加入IPTG，37攝氏度誘導4h，收集菌體破碎后，如果目的蛋白存在于上清中，16000rpm離心1 小時，收集上清。如果目的蛋白以不溶性的包涵體形式表達，菌體破碎后，離心收集包涵體， 將包涵體溶于含有尿素的緩沖液中，完全溶解后，離心收集上清。
使用鎳柱純化收集到的蛋白溶液，如果目標蛋白存在于上清中，則使用Tris緩沖液透析，如果目標蛋白以包涵體的形式存在，需要將收集到的目標蛋白在復性緩沖液中透析復性。實施例2 在THP-I細胞中真核表達結核分枝桿菌蛋白Wag31。一、細胞培養
THP-I細胞均在RPMI1640(10%胎牛血清)培養液中培養。每隔2到3天換一次新鮮培養液。T HP-I細胞為懸浮培養，鏡檢達到80%以上后，吸取部分到新的培養液中傳代。二、Wag31真核表達質粒的構建
以標準毒株H37Rv的基因組作為模板，用PCR法擴增Wag31的基因片段，并將該基因重組到表達型質粒pcDNA3. Ι/HisA中，轉化大腸桿菌Dffia。測序鑒定wag31片段與NCBI序列NC_000962.2完全相同的質粒作為真核表達質粒，該質粒表達出的wag31蛋白攜帶His tag。三、瞬時細胞轉染
細胞以廣2*105每皿(30mm)的密度接種，培養過夜。加入適量PMA，使其終濃度為ΙΟμΜ/ ml，充分混勻，37°C，5%C02培養M小時，誘導THP-I細胞貼壁。將3μ1 FuGENE放入預先置于室溫的97μ1無血清的培養液中，混勻，室溫放置 5min。將lPgpcDNA3. l/hisA-wag31融合質粒加入到FuGENE和培養液的混合液中，充分混勻，室溫靜置20分鐘。吸去THP-I貼壁細胞培養上清，用PBS洗1次，加入Iml無血清的培養液，加入上述轉染質粒混合液。37 °C，5%C02培養。四、細胞總蛋白的提取
以PBS洗滌細胞一次，以IOOu廣200ul每皿(30mm)的量加入細胞總蛋白提取液(組織裂解液TPER+蛋白酶抑制劑(終濃度為1. 2mg/ml)+PMSF終濃度為0. lmg/ml)，用細胞刮子將細胞刮下，轉移入EP管中，冰上放置15分鐘。離心(13000rpm，2分鐘)取上清，即為含有總蛋白的細胞裂解液。五、Western bloting
取適量細胞裂解液上樣于SDS-PAGE膠，80/120V電泳。電泳結束，將膠轉移至電轉緩沖液(48mM Tris, 39mM甘氨酸，0.0375% w/v SDS)中平衡15分鐘。將PVDF膜用甲醇浸濕， 去離子水沖洗，再轉移到電轉緩沖液中平衡15分鐘。電轉移使用干法，按照正極-6層濾紙-PVDF膜-電泳膠-6層濾紙-負極的順序安放，電壓23v，電轉3(Γ40分鐘。電轉結束后，將PVDF膜置于20ml封閉液中(IXPBS, 0. 05% Tween20, 5%脫脂奶粉)， 室溫封閉1小時。使用廣2ml封閉液以1:1000到1 5000稀釋一抗His抗體，使PVDF膜浸于一抗稀釋液中，室溫結合1小時。之后使用PBST (1XPBS，0. 05% Tween20)室溫洗滌5次，每次 5min。使用廣2ml封閉液以1:20000稀釋二抗，將PVDF膜浸于二抗稀釋液中，室溫結合 1小時，使用PBST，室溫洗滌5次，每次5分鐘。焚光底物(supersigna west Femto Maximun Sensitiity Substrate)按比{列混合好，加在PVDF膜上，室溫避光防止5分鐘，之后吸去熒光底物，暗室壓片適當時間，顯影在膠片上。根據顯影條帶確定wag31-his tag融合蛋白在THP-I細胞中的表達。實施例3 檢驗Wag31與THPl細胞中)(CL2相互作用的方法。l)ffag31和內源)(CL2蛋白的免疫共沉淀實驗。將pcDNA3. l/HisA_wag31轉染到THP-1細胞中。方法同實施例2中，瞬時細胞轉
^fe ο轉染后48小時，將細胞裂解。在600ul細胞裂解液加入15ul proteinA/GpLUS agarose和2ul鼠抗His的抗體(0. lmg/ml)進行免疫沉淀。同時留取50ul細胞裂解液作為對照。4°C結合過夜。離心，小心去除上清。加入200ul組織裂解液洗滌1次。離心 (5krpm，2分鐘)，小心去除上清。重復四次。在沉淀中加入30ul IX蛋白電泳上樣緩沖液。 在沸水浴中煮3分鐘。離心(13. 2krpm，l分鐘)，取上清以鼠抗人)(CL2的抗體進行western 檢測。Western blot方法同實施例2中western blot方法。(附圖2)。2) wag31 誘導 THP-1 細胞表達 XCL2。將pcDNA3. l/HisA-wag31轉染到THP-1細胞中。方法同實施例2中，瞬時細胞轉染。轉染后Muia1和Mh，分別取細胞進行裂解。取等量的各時間的細胞樣品用鼠抗人XCL2的抗體進行western檢測。Western blot方法同實施例2中western blot方法。 轉染后Mh，xCLZ蛋白的表達量明顯地提高(圖3)。
權利要求
1.一種重組蛋白，其特征是將結核分枝桿菌Wag31的基因片段插入pET30a質粒中，轉化大腸桿菌表達株BL21中，表達出的含有wag31蛋白序列的重組蛋白。
2.一種重組質粒，其特征是含有原核生物的啟動子序列和結核分枝桿菌wag31的基因片段。
3.—種在原核細胞中表達如權利要求1中所述結核分枝桿菌Wag31蛋白的方法，其特征是將基因片段Wag31插入表達質粒pET30a，表達結核分枝桿菌Wag31的重組工程菌。
4.一種在真核細胞中表達結核分枝桿菌Wag31蛋白的方法，其特征是在THPl細胞中表達的結核分枝桿菌蛋白Wag31。
5.一種在真核細胞中，檢驗結核分枝桿菌Wag31引起巨噬細胞)(CL2分泌并結合)(CL2 的方法，其特征是在轉錄水平和蛋白表達水平檢驗)(CL2的分泌，利用免疫共沉淀法檢驗 Wag31與)(CL2的結合。
6.一種融合DNA片段，其特征是含有真核生物的啟動子序列和結核分枝桿菌Wag31的基因片段。
7.如權利要求1所述的重組蛋白在構建重組BCG疫苗方面的應用，其特征是利用結核分枝桿菌Wag31的蛋白，作為疫苗組分，構建重組BCG疫苗。
8.—種DNA疫苗配方，其特征是利用結核分枝桿菌Wag31的基因片段，作為DNA疫苗基因片段的一部分，構建DNA疫苗。
9.一種亞單位疫苗配方，其特征是利用表達結核分枝桿菌Wag31蛋白，作為亞單位疫苗組分。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體涉及結核分枝桿菌Wag31基因及其用途。Wag31是結核分枝桿菌抗原，以標準毒株H37Rv的基因組DNA作為模板，用PCR法擴增Wag31的基因片段，并插入到原核表達質粒pET30a中，表達純化可獲得Wag31的高純度蛋白；用PCR法擴增Wag31的基因片段，并插入到真核表達質粒pcDNA3.1中。將重組質粒pcDNA3.1轉染至THP1細胞中，發現Wag31蛋白不但可以引起趨化因子XCL2高表達，也可以結合XCL2，這表示了Wag31可能對結核分枝桿菌，細菌-宿主相互作用起到重要作用，是一種可用于DNA疫苗，亞單位疫苗和重組BCG疫苗的候選基因。
文檔編號C12R1/32GK102558319SQ20121001216
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月16日 優先權日2012年1月16日
發明者呂紅, 張鷺, 徐文璽, 曹煒, 王洪海, 郝珂威 申請人:復旦大學