專利名稱：一種hpv18l1多核苷酸序列及其表達載體、宿主細胞和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，尤其是涉及一種HPV18L1多核苷酸序列，還包括一種表達載體和宿主細胞及其多核苷酸序列、表達載體和宿主細胞在制藥和制劑方面的應用。
背景技術：
在多種物種包括綿羊，狗，兔子，猴子，牛和人中已發現乳頭瘤病毒的感染。人乳頭瘤病毒(簡稱HPV)已分出上百個型別，如果LI基因與以前鑒定的型別的LI序列的同一性低于90%，那么這種型別可確定為新的型別，如果LI氨基酸序列同一性是在90到98%之間則為亞型，同一性在98%以上為變體[與原型(親代類型)相比]。
人乳頭瘤病毒是一類具有嚴格宿主范圍和組織特異性的DNA病毒，目前已發現100多種亞型。致病HPV的類型主要有6，11，16，18等。依據HPV能否致癌可將其分為致癌的高危型和不致癌的低危型兩類。低危型HPV主要包括6，11，13，32，42，43，44等。高危型HPV 主要包括 16，18，45，52，56，58 等。世界衛生組織的統計資料表明，宮頸癌在全球婦女癌癥死亡率中位居第二，在一些發展中國家甚至居于首位；每年全球大約有50萬例新發宮頸癌病例，約20萬人死于宮頸癌，其中，80%的死亡發生在發展中國家。據不完全統計，我國現有宮頸癌病人約13. 8萬，每年約有5萬人死于宮頸癌。大量研究資料證明，生殖道的人乳頭瘤病毒(HPV)感染與宮頸癌有著十分密切的關系-約80%的宮頸癌與4種類型(16、18、31型和45型)的HPV感染有關，其中，50%的宮頸癌與HPV16感染相關。目前，對中晚期宮頸癌的化療和手術治療效果也不理想。宮頸癌的復發率較高且治療費用也高。2005年，美國約有I萬例新確診的宮頸癌患者，約有3700例患者死亡。在大多數人中，人乳頭瘤病毒可于感染后自行消失。然而，少數情況下，某些高危類型的人乳頭瘤病毒如果未被檢出和治療，可以導致宮頸癌。此夕卜，某些低危類型的人乳頭瘤病毒可以導致尖銳濕疣。在美國，每年用于宮頸癌篩查和治療的費用約為5. 7億美元，每年約有100萬例尖銳濕疣，約有470萬女性由于巴氏涂片檢查(Pap)結果異常需要進行隨訪，其中，至少有300萬例此類異常結果是由某些人乳頭瘤病毒導致的。HPV是一種小的DNA病毒，直徑45_55nm，衣殼呈二十面體立體對稱，沒有囊膜，完整的病毒顆粒氯化銫中浮密度為I. 34g/mL，在密度梯度離心時易與無DNA的空殼(密度1.29g/mL)分開。HPV基因組是一閉環雙股DNA，分子量5*106道爾頓。按功能可分為早期(E區)，晚期(L區)和非編碼區(NCR)三個區域，E區分為E1-E7開放閱讀框架，主要編碼與病毒復制、轉錄、調控和細胞轉化有關的蛋白。例如El蛋白是一種DNA解旋酶，參與病毒DNA復制過程的起始，E2是一種調控蛋白，控制病毒基因的表達和DNA的復制。E2通過其既結合El又結合病毒復制起點的作用，使El在所述起點局部聚集，從而，刺激病毒DNA的復制起始。E4蛋白具有多種沒確定的功能，但結合宿主細胞骨架屬于上述功能，E5延遲體內的酸化，導致細胞表面的EGF受體表達增加，已知E6和E7各自都能結合細胞蛋白p53和pRB。E6和E7蛋白形成與宮頸癌有關的HPV型別，是已知的致癌基因。NCR是E區與L區間-6. 4-1. Okp的DNA片段，可負責轉錄和復制的調控。L區分LI和L2，分別編碼主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白。已經鑒定LI和L2基因是好的免疫預防靶，對于綿尾兔乳頭狀瘤病毒(CRPV)和牛乳頭狀瘤病毒(BPV)系統的研究表明，用細菌中表達的LI和L2蛋白或使用疫苗載體的免疫方法能保護動物不受病毒感染。在桿狀病毒表達系統中表達人乳頭狀瘤病毒LI基因或使用疫苗載體導致組裝成病毒樣顆粒(VLP)，該病毒樣顆粒已經用于誘導與保護免受病毒侵襲有關的高效價病毒中和抗體應答。大量研究已表明，VLPs具有良好的免疫原性和反應性，高誘導機體產生高滴度的中和抗體，以此為基礎來研制疫苗顯得很有前途。LI基因編碼的主要衣殼蛋白能刺激機體產生保護性抗體，可避免機體再受同型別HPV的感染。疫苗在歷史上一直被視為預防病原體感染的一種方式，如果發生感染，疫苗可激發免疫系統，以識別并中和病原體。疫苗包含一種或多種來自病原體的抗原，通常是已滅活的或減毒的完整生物體，或者是來自所述生物體的特定抗原肽，當將免疫系統暴露于抗原時，產生使個體終生保持對所述抗原免疫記憶的細胞。再次接觸相同抗原包括感染所述病原體時刺激特異性免疫應答，從而清除感染的病原體或使感染的病原體失活。有關HPV的基礎研究的高峰期已經過去，應用時代包括診斷和疫苗的臨床應用正 在走來，特別是高危型如HPV16U8的預防性疫苗產品即將得到越來越廣泛的臨床使用甚至是廣泛普及。截至目前，世界上開發成功的宮頸癌疫苗主要是兩種預防性疫苗一種是Merck(默克)藥廠研制的四價疫苗，主要針對引起宮頸癌的兩個HPV高危型16、18和引起生殖道尖銳濕疣的兩個HPV低危型6、11 ;另一種是GSK (葛蘭素)藥廠研制針對HPV高危型16、18的二價疫苗，2006年6月先后獲得歐洲與美國FDA的批準上市。默克公司應用啤酒酵母和葛蘭素史克公司應用昆蟲細胞-桿狀病毒研發的人乳頭瘤病毒疫苗都已上市，主要在歐洲免疫接種，一人份的費用是350美元，這個價格在我國顯然太高，不能被普通大眾接受。對于基因工程蛋白疫苗的研制，除了目的基因的選擇之外，重組蛋白表達系統的選擇也同樣重要。對于整合表達系統所表達的LI蛋白，可自我組裝成VLPs。目前國際上研究較多，適合工業化生產的是酵母表達系統，它不僅具有原核表達系統快捷、方便、費用低等優點，并且兼有真核表達系統的翻譯后加工、修飾等特點，使表達的LI蛋白能自我組裝成VLPs，具有良好的抗原性。本發明中使用的表達系統中宿主細胞為漢遜酵母(Hansenula polymorpha),甲醇酵母是近幾年逐漸發展起來的一類作為細胞工廠表達外源基因特別是真核生物基因的理想宿主，其中多形漢遜酵母是當前國際上公認的最為理想的外源基因表達系統，適于大規模工業化生產外源蛋白，漢遜酵母的技術優勢和產業化應用價值可歸納為(I)最適生長溫度高(37 43°C，畢赤酵母與釀酒酵母為28°C)，生長速率快，利于大規模發酵生產，可以高效表達許多在其它系統中難以高效表達的基因。(2)外源基因整合于細胞染色體中，重組菌株有絲分裂遺傳穩定性高。(3)能利用廉價的化學合成培養基進行細胞高密度發酵，不需要添加價格昂貴的天然組分(如酵母粉、蛋白胨)，進一步降低了生產成本并提高了外源基因的表達水平。易于培養，能夠在廉價培養基中高密度培養，菌體密度高達100 130g/L干重。(4)具有自主復制序列(HARS)，重組的頻率高，重組質?？梢愿呖截愓系饺旧w上，易獲得高拷貝整合的轉化子。漢遜酵母能夠按一定的基因劑量比分步整合多個基因，重組菌可按最佳的比例表達所需基因，對進行多基因改造提供了有利條件。(5)多形漢遜酵母具有遺傳操作簡單、外源基因拷貝數高、外源蛋白產量高等優點，是一個已得到廣泛關注的外源基因表達系統。(6)在分泌型表達中，外源蛋白通過分泌途徑可完成蛋白水解成熟、糖基化修飾和二硫鍵形成等翻譯后加工過程 ，使所表達的蛋白更接近具有生物學活性的天然蛋白形式。(7)與釀酒酵母相比，多形漢遜酵母在表達糖蛋白方面具有顯著優勢，其本身的甘露糖鏈總長度比較短，糖基化修飾比較簡單，易于進行糖基化改造。(8)可利用甲醇氧化酶基因(MOX)啟動子和甲醛脫氫酶基因(FMD)啟動子等強啟動子，高效地啟動外源基因的表達。蛋白的表達通常在過氧化物酶體內進行，可使其免受細胞內蛋白酶的降解，并降低了對細胞的毒害作用。(9)耐高溫，最適生長溫度為37_43°C，生長速率快，大規模發酵的培養時間短。發酵中以甘油或甲醇為唯一碳源和能源，能利用甘油的微生物不多，能利用甲醇的微生物更少，發酵染菌率低。

發明內容
本發明的目的是提供了一種HPV18L1多核苷酸序列，該序列編碼HPV18L1氨基酸序列，從而使利用漢遜酵母表達系統工業生產HPV18L1衣殼蛋白成為現實，相對于目前采用的其他真核表達系統具有產率更高、成本低等優點。本發明的另一目的是提供一種對應的表達載體。本發明的另一目的是提供一種宿主細胞。本發明的又一目的是提出所述HPV18L1多核苷酸序列和對應的表達載體、宿主細胞在制藥和制劑方面的應用。本發明是技術方案如下首先，提供了一種HPV18L1多核苷酸序列，如SEQID NO. 2所示，該序列如下ATGGCCCTGTGGAGACCATCCGACAACACCGTCTACCTGCCACCACCATCCGTCGCCAGAGTCGTCAACACCGATGACTACGTCACCAGAACCTCCATCTTCTACCACGCTGGCTCCTCCAGACTGCTGACCGTCGGCAACCCATACTTCAGAGTCCCAGCGGGCGGTGGCAACAAGCAGGACATTCCAAAGGTCTCCGCTTACCAGTACAGAGTCTTCAGAGTCCAACTGCCAGACCCAAACAAGTTCGGCCTCCCAGACACCTCCATCTACAACCCAGAGACCCAGAGACTGGTGTGGGCTTGCGCTGGCGTCGAGATCGGCAGAGGACAGCCACTGGGCGTTGGCCTGTCGGGCCACCCATTCTACAACAAGCTTGACGACACCGAGTCCTCCCACGCCGCCACCTCCAACGTCTCCGAGGATGTCAGAGACAACGTCTCCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGCCCCAGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCGCTTGCAAGTCCAGACCACTGTCCCAGGGCGACTGCCCACCACTGGAGCTGAAAAACACCGTCCTGGAAGACGGCGACATGGTCGACACCGGCTACGGCGCCATGGATTTCTCTACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTCCCACTCGACATCTGCCAGTCCATCTGCAAGTACCCAGACTACCTCCAAATGTCCGCCGACCCATACGGCGACTCCATGTTCTTTTGCCTGAGAAGAGAGCAGCTGTTCGCCAGACACTTCTGGAATAGAGCCGGCACCATGGGCGACACCGTCCCACAGTCCCTGTACATCAAGGGCACCGGCATGAGAGCCTCCCCTGGCTCCTGCGTCTACTCCCCATCCCCATCGGGCTCCATCGTCACCTCCGACTCCCAGCTGTTCAACAAGCCATACTGGCTGCACAAGGCCCAAGGCCACAACAACGGCGTCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTCACCGTCGTCGACACCACCAGATCCACCAACCTGACCATCTGCGCCTCCACCCAGTCCCCAGTCCCAGGTCAGTACGACGCTACCAAGTTCAAGCAGTACTCCAGACACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGACGTCATGTCCTACATCCACTCCATGAACTCCTCCATTCTTGAGGATTGGAACTTTGGCGTCCCA
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TTGACCAGTACCCACTGGGCAGAAAGTTCCTGGTGCAGGCAGGACTGAGAAGAAAGCCAACCATCGGCCCAAGAAAG
AGATCCGCCCCATCCGCCACCACCTCCTCCAAGCCAGCCAAGAGAGTCAGAGTCAGAGCTAGAAAGTAA該多核苷酸序 列的密碼子使用通過表達宿主菌株漢遜酵母基因的密碼子偏愛方式優化。本發明提供的編碼HPV18L1多核苷酸序列，密碼子使用方式參照高表達的漢遜酵母基因的密碼子偏愛模式人工設計得到。人工設計時期望所述多核苷酸序列的密碼子使用與高表達的漢遜酵母基因的密碼子使用方式更加接近。所述多核苷酸序列是雙鏈DNA序列，所述優選多核苷酸序列編碼人乳頭瘤病毒18型LI，因此，本發明提供了一種合成基因，該基因包含開放閱讀框編碼HPV18L1氨基酸序列，其中通過選擇使可能用于編碼所述氨基酸序列的密碼子類似漢遜酵母的優化密碼子，以使在合成基因中密碼子的使用頻率極類似于高表達的漢遜酵母基因，而不是人乳頭瘤病毒基因。所述密碼子使用與高表達的漢遜酵母基因使用系數最大或次大的密碼子。將HPV18L1氨基酸序列全長508氨基酸，轉換為漢遜酵母偏愛密碼子模式的核苷酸序列，首選兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一位的密碼子，主要使用兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一第二位的密碼子，少數情況使用第三位的密碼子完成局部調整，利用DNAMAN軟件避免過長互補序列、重復序列，通過RNA結構預測，避免過長復雜的發卡結構，排除強二級結構，增加特異性的分子內部穩定性?；虻暮塑账嵝蛄兄羞€避免出現可能對基因轉錄、轉譯效率帶來不利影響的序列，如內含子剪接序列、轉錄終止序列、內部啟動子序列(TATA)和核糖體結合位點(GGAGG)等。轉錄終止序列主要有ATTATTTTAT、TTTTTATA、TAG(富含 T)TA(G)GT、(富含 AT) TTT 等。本發明提供了序列2的多核苷酸序列，對應附圖2所示氨基酸序列，保持了漢遜酵母基因的密碼子偏愛性。還提供了一種多肽，它包含所述的HPV18L1多核苷酸序列。該多肽包含一種或多種點突變，從而使該多肽的一種或多種天然的生物功能表達物利于純化工藝和后續疫苗制備。進一步，所述多肽包含HPV18晚期基因產物的全部或一部分。進一步，上述的多核苷酸序列，以高表達的漢遜酵母基因的偏愛密碼子使用系數為參照，首選兼并密碼子中漢遜酵母使用系數最大的密碼子，主要使用兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一第二位的密碼子，少數情況使用第三位的密碼子。同時，上述多核苷酸序列為保持了漢遜酵母密碼子偏愛使用方式的片段或類似物。本發明還提供了一種表達載體，它包含上述的多核苷酸序列，該多核苷酸序列與載體調控序列可操作連接，所述調控序列能使宿主細胞表達該多核苷酸序列。所述的表達載體，它能使所述多核苷酸序列在漢遜酵母宿主細胞中表達。本發明所提供的表達載體，其包含本發明的多核苷酸序列并能夠引導該多核苷酸序列的表達，該多核苷酸序列編碼HPV18L1氨基酸序列，所述表達載體是PMPT-HPV18L1，其構建方法如附圖5所示。所述表達載體還包括的漢遜酵母甲醇氧化酶基因(MOX)啟動子、甲醇氧化酶基因(MOX)終止子、I. Okb的自主復制序列HARS、脲嘧啶基因ScURA3及pBluescrip II質?；驇讉€元件?？梢詫⒏鞣N方法用于上述元件中HPV18L1基因的分子克隆、突變與鑒定。這些方法包括，但不限于，在合成HPV18L1人工序列后所構建含HPV18L1基因的細菌(如JM109、DH5a等)的cDNA或基因組DNA文庫，在適當的表達載體系統中可直接完成HPV18L1基因的功能表達。另一個方法包括用編碼HPV18L1的部分DNA篩選質粒穿梭載體在細菌或漢遜酵母中構建的含HPV18L1的cDNA或基因組DNA文庫。這一部分DNA是根據上述漢遜酵母優選HPV18L1核苷酸序列的設計的寡核苷酸引物，通過特異聚合酶鏈式反應(PCR)來擴增HPV18L1的DNA片段得到的。另一個方法是從產生HPV18L1的細胞分離RNA并通過體外或體內翻譯系統將RNA翻譯成蛋白質。將RNA翻譯成肽或蛋白質將導致產生至少一部分的HPV18L1蛋白，這部分HPV18L1蛋白可以通過與抗HPV18L1抗體的免疫反應性得到鑒定。在這一方法中可以分析從產生HPV18L1細胞分離的RNA庫中至少編碼一部分HPV18L1的RNA的存在,可以進一步分級分離RNA庫以便從中純化HPV18L1RNA，分析這一方法產生的肽或蛋白質，以提供氨基酸序列，這些氨基酸序列用于提供生產HPVlSLlcDNA的引物，或可以分 析用于翻譯的RNA，它提供編碼HPV18L1的核苷酸序列并產生用于篩選HPV18LlcDNA文庫的探針。這些方法是本領域已知的并能在例如《分子克隆》(實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，1989)中找到。通過分子克隆方法得到的克隆HPV18L1DNA或其突變體片段，要插入所述表達載體，該載體含有適當的(MOX)啟動子和其它適當的轉錄調節元件如(MOX)終止子、自主復制序列HARS、尿嘧啶基因URA3及pBluescrip II質粒基因。所述表達載體按照分子生物學領域的常規來構建，例如，可使用質粒DNA和適當的起始密碼子，啟動子，增強子以及其它元件，例如必要的聚腺苷酸化信號，將它們以正確的方向連接后具有調控功能，以便實現蛋白的表達。適當的載體對本領域技術人員來說是已知的。本發明還提供了一種宿主細胞，該宿主細胞包含上述的多核苷酸序列或表達載體。所述宿主為一種零回復突變的尿嘧啶營養缺陷型多型漢遜酵母受體菌株，應用基因敲除技術建立的URA3-營養缺陷型宿主細胞株HU-II。所述的宿主細胞具有表達載體能夠補償用于轉化子篩選的URA3營養缺陷。本發明還提出了上述的多核苷酸序列對應產物在治療或預防HPV感染制劑方面應用。本發明還提出了上述多核苷酸序列或多肽或表達載體或宿主細胞在治療或預防皮疣，非典型鱗狀細胞，宮頸發育異常，頸上皮內瘤形成或宮頸癌藥物方面的應用。本發明進一步涉及漢遜酵母表達HPV18L1多肽、多肽片段或其類病毒顆粒在制備宮頸癌疫苗中的用途。有多種適用的漢遜酵母表達HPV18L1多肽、多肽片段或其類病毒顆粒純化方法。包括但不限于鹽分級分離，離子交換層析，分子篩層析，羥磷灰石吸附層析、疏水作用層析和親和層析(通過使用特異于全長HPV18L1、HPV18L1的多肽片段的單克隆或多克隆抗體制成的免疫親和柱，或融合特異蛋白標簽的全長新生HPV18L1、HPV18L1的多肽片段使用特異于標簽的親和柱)的各種組合或分別應用，從細胞溶胞物和提取液中純化漢遜酵母重組HPV18L1 蛋白。
DNA代碼有4種(A、T、C和G)，其中每三個字母組成的密碼子代表生物體的基因所編碼的蛋白的氨基酸。沿DNA分子線性排列的密碼子被翻譯成所述基因所編碼的蛋白質中氨基酸的線性序列。密碼子有高度的簡并性，61種密碼子編碼20種天然氨基酸。因此，大部分氨基酸由一種以上的密碼子編碼-實際上數種氨基酸由4種或更多種不同的密碼子編碼。由于遺傳密碼是簡并的，一個以上的密碼子可用于編碼特定的氨基酸，所以，氨基酸序列可以被任何一組類似的DNA寡核苷酸編碼。當有一種以上的密碼子編碼一種特定的氨基酸時，不同物種在密碼子的選擇方面顯示不同的偏愛性，且密碼子的使用在物種的高水平表達和低水平表達的基因之間也有顯著的不同。例如，在細菌、酵母或哺乳動物細胞中表達的病毒基因具有對于有效的表達來說不適當的密碼子分布。已發現數例將宿主中罕見的密碼子更改為宿主優選的密碼子提高了異源表達水平的情況。如果異源DNA序列中存在宿主中罕見的密碼子，那么異源基因在所述宿主中的低水平異源表達可能性很大。有效的酵母表達系統包括兩個主要元件啟動外源基因高效表達的載體系統和具有特定篩選標記的宿主細胞。由于多形漢遜酵母同源重組的頻率較低，只有當兩側的同源序列大于Ikb時才可能利用類似于釀酒酵母的基因破壞法獲得基因阻斷突變株，因此目前使用的營養缺陷型菌株多是通過化學誘變得到的，它們突出的缺點是遺傳穩定性較低，難于獲得理想的轉化子，而且可能存在多重突變效應，使細胞的生理生化特性與野生型細胞存在明顯差異，為大規模工業生產帶來不便。我們構建了一種零回復突變的尿嘧啶營養缺陷型多型漢遜酵母受體菌株，應用基因敲除技術建立的URA3-營養缺陷型宿主細胞株HU-Il (CGMCC No. 1218)已申請的發明專利為CN1651570A。所構建的遺傳穩定、尿嘧啶營養缺陷型的重組多形漢遜酵母宿主菌株，特別是多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha)HU-Il CGMCC No. 1218，該菌株比目前國內外所用的營養缺陷型宿主菌遺傳穩定性高，回復突變率低，便于進行遺傳轉化和重組菌株的篩選，并保持了野生型菌株的生理生化特性，有利于重組菌株的培養和外源蛋白的高效表達，具有較高的工業應用價值?？梢酝ㄟ^許多技術包括但不限于轉化，轉染，脂質轉染，原生質體融化，和電穿孔將表達載體導入到宿主細胞中?？寺》敝澈斜磉_載體的細胞并各個分析以確定它們是否轉入上述人工設計合成HPV18L1基因或其突變體(片段或融合標簽的片段或全長)，是否 產生重組HPV18L1多肽或多肽片段，甚至是否形成該多肽的多聚物?？梢酝ㄟ^幾條途徑對HPV18L1表達宿主細胞克隆進行鑒定，這些途徑包括但不限于，與抗HPV18L1抗體的免疫反應性?？梢曰厥誋PV18L1蛋白以提供純化形式的HPV18L1進一步完成對目標蛋白的鑒定，包括但不限于電鏡檢查、分子量測定、質譜、等電點測定、動態光光散射的方法。本發明具有的優點和積極效果是本發明通過對HPV18L1野生型病毒基因核苷酸序列的改造，使得重組HPV18L1衣殼蛋白在漢遜酵母系統中高效表達，而且通過電鏡檢查證明表達得到的是與天然HPV18L1的VLP具有相同免疫原性和抗原性的50nm左右的類病毒顆粒。本發明使得利用漢遜酵母表達系統工業生產HPV18L1衣殼蛋白成為現實，相對于目前采用的其他真核表達系統具有產率更高、成本低等的優點。


圖I是病毒編碼的HPV18L1核苷酸序列及編碼的氨基酸序列；圖2是本發明合成的HPV16L1核苷酸序列及編碼的氨基酸序列；
圖3是序列2所示的DNA序列同病毒碼及漢遜酵母偏愛密碼子模式分布比較情況表;圖4是HPV18截短LI合成編碼基因對應氨基酸序列；圖5是表達載體構建不意圖；圖6是瓊脂糖凝膠電泳圖譜；圖7是west-blot (蛋白印跡)圖；圖8是HPV18L1類病毒顆粒(VLPs)電鏡照片。
具體實施方式
實施例I :HPV18L1基因序列優化將HPV18L1氨基酸序列全長508氨基酸，轉換為漢遜酵母偏愛密碼子模式的核苷酸序列，首選兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一位的密碼子，主要使用兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一第二位的密碼子，少數情況使用第三位的密碼子完成局部調整，利用DNAMAN軟件避免過長互補序列、重復序列，通過RNA結構預測，避免過長復雜的發卡結構，排除強二級結構，增加特異性的分子內部穩定性?；虻暮塑账嵝蛄兄羞€避免出現可能對基因轉錄、轉譯效率帶來不利影響的序列，如內含子剪接序列、轉錄終止序列、內部啟動子序列(TATA)和核糖體結合位點(GGAGG)等。轉錄終止序列主要有ATTATTTTAT、TTTTTATA、TAG (富含 T) TA (G) GT、(富含 AT) TTT 等。最終確定由1524個堿基組成的整個序列，如序列表中序列2所示，編碼的氨基酸序列如附圖2，同序列表中病毒碼序列I編碼的如附圖I的氨基酸序列相比一致，利用全人工合成方法合成序列表中序列2所示的DNA序列，該漢遜酵母偏愛的核苷酸序列密碼子同病毒碼及漢遜酵母偏愛密碼子模式分布比較情況如附圖3所示。實施例2 HPV18L1基因及HPV18L1突變基因表達載體構建利用全人工合成方法合成序列表中序列2所示的DNA序列，序列兩端加上限制性內切酶EcoR I和BamH I的識別位點。用EcoR I和BamH I酶切合成的DNA序列，電泳回收酶切后的片段，_20°C保存備用。以多形漢遜酵母CGMCC 2. 2497基因組DNA為模板，克隆I. 5kb的甲醇氧化酶基因(MOX)啟動子、350bp的甲醇氧化酶基因(MOX)終止子、I. Okb的自主復制序列HARS ；并從YIp5 (GeneBank Acession NO. L09157)質粒中克隆出I. Ikb的釀酒酵母脲嘧啶基因ScURA3 ;將上述4部分連接后，插入pBluescrip II質粒的多克隆位點，構建成穿梭載體pMPT-02。用EcoR I和BamH I酶切載體pMPT_02，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的大片段，T4-DNA連接酶的作用下，與同樣雙酶切的合成的DNA序列連接，連接反應16 °C隔夜，反應液轉化天根生化科技(北京)有限公司TOPlO感受態細胞，用帶氨芐青霉素抗性的平皿篩選轉化子，對平皿上長出的大腸桿菌轉化子使用引物primer fd 5 ‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-’3 和 primer :5 ‘-GCACGGTGGTGACATCAATCTAAAG-’3 通過PCR擴增篩選含載體PMPT-HPV16L1的轉化子，篩選得到的轉化子擴大培養，用寶生物工程大連有限公司的質?；厥赵噭┖?TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0)提純得到表達載體PMPT-HPV18L1，載體構建示意圖見附圖5。
使用引物primer fd :5 ‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-’ 3 和引物 pl8J2 :5 ^-CGGGATCCAGATCTTCATTACAGTCCTGCCTGCACCAG-’3，以 pMPT-HPV 18L1 模板 PCR 擴增，得到序列 3所示的DNA序列，為HPV18截短LI合成編碼基因序列，其對應的氨基酸序列如附圖4所示。序列3用上述同樣的雙酶切、回收、連接、轉化、篩選和提純得到相應的表達載體。實施例3 :表達載體電轉化漢遜酵母感受態宿主細胞用Sac I酶切載體pMPT_HPV18Ll，使載體線性化。線性化的載體通過電轉化法(天津理工大學生產的LN-101型基因脈沖導入儀，I. 5kV，50 μ F，200 Ω，3_5mSec)轉化多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha) CGMCC NO. 1218。在含有 I. 34g/100ml YNB (酵母氣源基礎培養基)，2g/100ml葡萄糖的培養基平板上篩選轉化子。實施例4 目的基因多拷貝轉化子的篩選、基因測序及拷貝數檢測 I.細胞破碎取約ImLlOOD酵母菌體至I. 5mL離心管,6000rpm離心5min后去上清,加入與沉淀菌體體積相同的酸洗玻璃珠，100 μ L細胞破碎液，置于振蕩器上振蕩5min lOmin。2. DNA 抽提細胞破碎完成后，在離心管中加入100 μ L無菌水，再加100 μ L酚/氯仿抽提液，混勻后4°C放置十分鐘，IOOOOrpm離心5min,取上清I μ L用于擴增反應。3. PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測使用弓丨物primer fd 5 ‘-TCAAAAGCGGTATGTCCTTCCACGT-，3 和 primer rs 5 ‘ -GCACGGTGGTGACATCAATCTAAAG- ’ 3對以上制備的DNA模板PCR擴增，以上引物可同時擴增漢遜酵母單拷貝的MOX基因和通過載體轉化整合到漢遜酵母中的目的基因即HPV16L1基因。所擴增HPV16L1片段長度為1500bp，擴增的MOX片段長度為2061bp，在I. O %瓊脂糖凝膠加樣孔中上樣5 μ L，電泳完畢取出凝膠攝像，電泳照片見附圖6，其中1500bp左右條帶為HPV16L1基因條帶，2000bp左右條帶為MOX基因條帶。其中，2、3、5、6、7道是高拷貝轉化子；4、9道是較高拷貝轉化子；8道是地拷貝轉化子；1道是宿主菌(陰性對照)；10道是DL2000Marker，從上至下依次為 2000bp、IOOObp、750bp。4.多拷貝株目標基因測序以上擴增的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后用DNA純化試劑盒抽提1500bp的DNA片段進行基因測序，與設計基因比對結果一致。5.多拷貝轉化子實時定量PCR檢測拷貝數已知MOX基因為漢遜酵母的單拷貝基因，以MOX基因為內標，設計引物對同一樣品同時擴增MOX基因片段和HPV18L1基因片段并用熒光定量PCR儀檢測，通過相對比較而確定單個細胞包含的HPV18L1基因拷貝數?；蛲ㄟ^質粒載體轉化到受體菌并穩定整合后才能高效表達，其拷貝數一定程度上反映高效表達的工程菌株表達目的蛋白的特性。由于MOX基因在漢遜酵母基因組中是單拷貝，故HPV18L1片段的量/MOX片段的量即為每個細胞的HPV18L1基因的拷貝數。設HPV18L1片段擴增到達閾值時的DNA分子數為Xnh,原樣品即PCR反應模板的DNA分子數為Xtlh ；Μ0Χ片段擴增到達閾值時的DNA分子數為Xnm,原樣品即PCR反應模板的DNA分子數為Xtlm ；HPV18L1和MOX片段擴增到達閾值時的臨界循環數分別為Cth和Ctm ;熒光閾值為Rt ；HPV18L1和MOX擴增片段結合的熒光染料熒光強度系數分別為Kh和Km。Em為MOX片段的擴增效率；Eh為HPV18L1片段的擴增效率。
則有Χ = Xoh(l+Eh)cth.........· ·⑴Mnm = M0m(l+Em)cth...........(2)達到閾值時Rt= Kh · Xnh = Km · Xnm............ (3)由于擴增時兩種片段都采用SYBR Green I作為熒光指示劑，故Kh = Km則有XQh(l+Eh)cth= M0ffl(1+Effl)cth............ (4)每個細胞含有的HPV18L1基因拷貝數的計算公式為N = X0h/M0m = (I +Em)ctm/ (I +Eh)cth、
當不考慮MOX基因和HBsAg基因擴增效率不一致即E111 = Eh = E時，HPV18L1基因拷貝數的計算公式為N = X0h/M0m = (1+E)似其中 Λ Ct = Ctffl-Cth兩對引物均使用在線軟件Primer3 (http://cbr-cnrc. gc. ca/cgi-bin/Primer3)設計，由大連寶生物工程有限公司代理合成。引物序列HPV18L1 primer forward(SpI) :5 ‘-CCTCCATCTTCTACCACGCT-， 3HPV18L1 primer reverse (Asl) :5 ‘-GGAATGTCCTGCTTGTTGC-，3MOX primer forward(Sp2) :5 ‘-GCCACCTTCTACTCGTCCAG-， 3MOX primer reverse (As2) :5 ‘-ACTCCCAGTCGTCGTAGTCG-，3其中，所擴增HPV18L1片段長度為97bp，擴增的MOX片段長度為145bp模板DNA制備同上述DNA抽提方法，其稀釋如下標準品稀釋，取某一樣品抽提得到的DNA溶液先稀釋20倍，然后進行系列稀釋，每次稀釋10倍，稀釋4次，此稀釋要求精確。樣品稀釋，取其他樣品用抽提得到的DNA溶液先稀釋20倍，然后進行系列稀釋，每次稀釋10倍，稀釋2次，此稀釋不要求精確。實時定量PCR反應體系總體積20yL，其中正反向引物(IOmM)各O. 5 μ L，EX Premix Taq (含 4mM Mg2+、0. 4mM dNTP、0. 5MExTaq) 10 μ L, SYBR 0· 5 μ L 模板 5 μ L。實時定量PCR檢測使用澳大利亞Corbett Research公司的熒光定量PCR儀(型號Rotor-Gene3000)。實時定量PCR反應熱循環參數預變性94°C 5min，變性94°C 15secs，退火及延伸60°C 50secs, 35個循環。熔解檢驗反應特異性從60°C緩慢升溫到94°C，每5秒升溫一次，每次升溫O. 5°C,每升高一次進行信號米集。利用Rotor-Gene 5. O. 28 (CorbettResearch)軟件分析樣品拷貝數。實施例5 :細胞培養誘導表達操作將凍存菌種從_70°C冰箱取出迅速溶解，用O. 2mL吸管將菌懸液吹打/攪拌均勻后，接40 μ L菌懸液到裝有IOmL MD培養基的三角瓶中，每個樣品接2只以上的三角瓶。接種后搖床培養24小時左右，培養溫度31±2°C，搖床轉速160rpm。用吸管接培養得到的菌懸液O. ImL到裝有IOmL MD培養基的三角瓶中培養24小時左右，培養溫度31 ±2°C，搖床轉速160rpm。將得到的菌懸液轉入滅過菌的IOmL離心管，在臺式離心機上3000rpm離心10分鐘，棄上清液。加無菌水IOmL左右,充分混勻后,在臺式離心機上3000rpm離心10分鐘,棄上清液。用IOmL無碳源培養基將洗滌后的菌體震蕩混勻，轉入三角瓶中。在以上培養得到的細胞懸液中加O. 5% (50 μ L)的甲醇，將三角瓶置培養搖床上，開啟搖床并調整溫度至31±2°C，調整轉速至160rpm，震蕩培養。次日起每天上午、下午各加甲醇一次，兩次甲醇流加之間盡量間隔時間長一些。誘導培養24小時后，補加ImL無碳源培養基，加O. 5% (55 μ L)的甲醇，將三角瓶置培養搖床上，開啟搖床并調整溫度至31 ±2°C，調整轉速至160rpm，震蕩培養。誘導培養共72小時后取樣檢測，菌懸液稀釋30倍，用分光光度計測OD6tltl值，計算誘導培養后菌懸液的OD6tltl值，取相當lmL200D細胞進行表達水平的檢測。實施例6 :漢遜酵母重組疫苗工程菌三時相中試發酵工藝將菌株構建中篩選的高拷貝高表達菌株制備為原代種子、主代種子、工作種子三級種子庫，放在-70°C冰柜中凍存，工作種子用于發酵工藝開發及疫苗發酵生產。培養基的配制種子培養基2g/100ml葡萄糖、I. 34g/100ml YNB ;一級種子培養基200mL，二級種子培養基1600mL，高壓滅菌。從_70°C冰柜中取一支(lmL、0D6(IQ ^ 100)接 入200mL 一級種子培養基，31°C培養24小時轉接1600mL 二級種子培養基擴大培養，31°C培養22小時細胞0D600達到10以上，作為發酵種子。2.發酵過程補料培養基NH4H2PO4 87g溶于540mL水中，高壓滅菌；另取260g甘油，高壓滅菌。去阻遏培養基共計3L，NH4H2PO4 27g、MgSO4 · 7H20 6g、KCl 6. 8g、NaCl 0. 7g，以上原料溶于660mL水中，高壓滅菌；另取I. 8L甘油，高壓滅菌。誘導培養基甘油400mL，高壓滅菌，滅菌后加O. 6L甲醇。發酵培養基發酵起始體積12L ；NH4H2PO4 175g、MgSO4 · 7H20 40g、KCl 44g、NaCl
4.4g、甘油520g,另加4mL消泡劑，罐內110_115°C高壓滅菌30分鐘。發酵工藝用日本丸菱理化裝置研究所生產的30L發酵罐(型號MSJ_J2)進行發酵工藝，對發酵罐中發酵培養基進行在線滅菌，華東理工大學生物工程學院的FC-280型溶解氧監控儀進行溶氧的監測和控制。將ISOOmL二級種子接入裝有12L發酵培養基滅菌的發酵罐中開始發酵，發酵工藝主要包含三個時相，即生長時相、去阻遏時相和誘導表達時相。生長時相發酵罐pH值控制設定在5. 4-5. 5 ;發酵溫度控制30°C;罐壓O. 5Kg/cm2。發酵罐內溶氧會緩慢下降，當下降至60%左右時(發酵約16小時)，連接好補料管路，用蠕動泵勻速打入約SOOmL補料培養基。當發酵罐溶氧水平降至40%以下時，將空氣流量調至15L/min，攪拌轉速調至700rpm。生長時相后期(發酵約22小時左右)，若細胞生長狀態良好，發酵罐溶氧水平可下降至20%以下；細胞OD6tltl達到80以上。去阻遏時相溶氧回升前將蠕動泵電源插頭與溶解氧監控儀信號輸出電源連接；監控儀溶氧控制40，死區為2，高端打開；蠕動泵電源開關關閉。當觀察到發酵罐溶氧由最低點回升到60%以上時，進入去阻遏時相；此時打開蠕動泵電源開關，設定泵速22rpm，開始流加去阻遏培養基。去阻遏后期，若細胞生長良好，OD6tltl可達到300以上。誘導時相去阻遏時相持續24小時左右，進入誘導時相，開始補加誘導培養基，通過甲醇電極控制甲醇濃度O. 3% (V/V)，整個發酵時間大約96小時。該發酵工藝使得通過實施例1-5獲得的工程菌株獲得高效表達。發酵細胞懸液10L,加3mL的Tween80,攪拌均勻2小時，用Sigma 6K-15離心機8000rpm離心25min,棄上清液，細胞加洗液[200mMPH6. 2磷酸鹽緩沖液，O. 5M NaCl，4mMEDTA,0. 03% Tween80]攪拌重懸，_72°C凍存備用。實施例7:LI蛋白純化樣品預處理-72°C凍存細胞4°C融解，加200mM PMSF至終濃度4mM，懸液混勻后，用高壓均質機在1300BAR條件下將細胞破碎兩遍。用Sigma 6K-15離心機8000rpm離心25min,取上清液，用賽多利斯Sartocon 2Plus切向流系統IOKDa膜超濾，濃縮3倍，用8倍緩沖液A[25mMpH7. 2磷酸鹽緩沖液，O. IM NaCl，4mM EDTA，0. 03% Tween80]充分置換，去除小分子雜質。強陽離子交換層析應用QXL強陰離子-交換層析樹脂填充層析柱(26mmIDX IOOmm),該柱在使用前用0.5M NaOH清潔消毒。在室溫下用緩沖液A平衡層析柱。室溫超濾樣品，以15毫升/分鐘的速度泵上柱，用8個柱體積HPV室溫bufferA以15毫升/分鐘流洗，100% bufferA到100% bufferB[25mMpH7. 2 磷酸鹽緩沖液，2M NaCl, 4mM EDTA,0. 03% Tween80]的線性梯度洗脫層析柱，總的線性梯度是10個柱體積，收集具有吸收峰的流分。梯度洗脫后，用5個柱體積室溫bufferB以15毫升/分鐘沖洗柱，10個柱體積IN的NaOH沖洗柱，用bufferA以15毫升/分鐘沖洗柱，平衡。羥基磷灰石柱層析以平衡液[50mM M0PS,pH7. 2,0. 7M氯化鈉]用IOKDa膜超濾充分置換QXL強陰離
子交換層析洗脫有效流分，用于羥基磷灰石柱層析上樣樣品。40g羥基磷灰石用200mM，pH7. O磷酸鹽緩沖液充分溶漲后裝填(16mmIDX 360mm)層析柱。流速3mL/min (約90cm/h線速度)，6個柱體積的平衡液。樣品為平衡液超濾濃縮、恒濾,取50mL用平衡液3倍稀釋，流速3mL/min上樣。4個柱體積的平衡液，2個柱體積的洗脫液I [50mM M0PS，ρΗ7· 2，O. 7Μ氯化鈉，5mM磷酸鈉]，流速3mL/min流洗。用8個柱體積100%洗脫液I到100%洗脫液II[50mM MOPS, ρΗ7· 2,0. 7Μ氯化鈉，200mM磷酸鈉]梯度洗脫，收集洗脫峰。用I. 5個柱體積100%洗脫液III[50mM M0PS，pH7. 2,0. 7M氯化鈉，500mM磷酸鈉]洗脫，收集洗脫峰。用Bradford法(Iowry法)、SDS-PAGE電泳、west-blot分析各洗脫峰含量純度。實施例8 目標蛋白west-blot檢測I.實施例5獲得的細胞使用Novagen的酵母專用蛋白抽提試劑(YeastBuster)提取工程菌搖瓶誘導表達或實施例6發酵表達細胞總蛋白，離心去掉細胞碎片，上清液用2Xloading Buffer [IOOmM Tris-Cl,pH6. 8,20% (w/v)甘油，2% (w/v) SDS,0. 2M DTT，少許溴酚藍]I I混合后沸水浴10分鐘。2.經SDS-PAGE電泳，應用《分子克隆》第二版蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，將電泳條帶轉到PVDF膜上,通過預染蛋白Marker指示轉膜效果。3.使用 BSA 包被，HPV16L1 (CAMVIR-I) :sc_47699 單克隆抗體作為一抗，Goatanti Mouse IgG-AP作為二抗，檢測目標蛋白特異性，用BCIP/NBT顯色試劑盒顯色。轉化子west-blot方法篩選結果見附圖7。其中，1、4為蛋白Marker,從上至下依次為170、130、100、70、55、40、35、25KDa。2道為HPV18全長LI表達轉化子，3道為HPV18截短LI表達轉
化子。、
實施例9:電鏡檢查每個樣品(粗始澄清液、純化的樣品或經過重組裝的VLPs樣品)取一滴置于200目碳覆蓋的銅網上。一滴2%的PH7. O的磷鎢酸(PTA)置于銅絲上20-60秒。銅網氣干后進行透射電鏡檢查，所有的顯微鏡以IOOkv的遞增電壓用JEOL 100CE透視電子顯微鏡(JEOLUSA LAC)完成。產生的顯微圖片最終放大為100，000X。其中實施例7中HPV18L1超濾樣品電鏡檢查結果如附圖8。實施例10 :動物免疫試驗小鼠的免疫測定HPV18L1 VLP疫苗的ED50 :使用60只6 8周齡的SPF級NIH或Balb/c小鼠，分為6組，每組10只小鼠。每只小鼠各免疫ImL HPV18 VLP疫苗稀釋液，濃度分別為原倍、I 5倍稀釋液、I 20倍稀釋液、I 80倍稀釋液、I 160倍稀釋液、I 320倍稀釋液。采用腹腔注射，免疫后六周處死采血，血清分離不少于O. 5mL，存放 于_20°C備用。HPV18抗原免疫小鼠ELISA方法檢測ED50 (Reed-Muench法)計算的疫苗ED50 值為 O. 088 μ go大白兔的免疫用含完全弗式佐劑的HPV18 VLP顆?？乖庖?只大耳白兔。免疫劑量為160 μ g,免疫后4周和10周各加強一次。免疫后每二周采血一次,將采集的血液置37°C中2h，再移入4°C過夜，4000g離心lOmin，吸取上清，獲得的多抗血清存放于_20°C備用。第10周處死采血,血清分離不少于50mL,存放于-20°C備用?？寡錏LISA檢測用純化得到的HPV18VLP顆?？乖?6孔酶標板過夜；用1% BSA封閉各孔沒有結合HPV18VLP顆粒抗原的位點；加小鼠或大耳白兔的抗血清，與孔中HPV18VLP顆粒抗原結合；加結合有辣根過氧化物酶的小鼠或大耳白兔酶標二抗；加入辣根過氧化物酶的顯色底物3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺；2N H2SOj*止顯色后用酶標儀在405nm處檢測各反應孔的吸光度值。HPV18抗原免疫兔ELISA方法檢測抗體滴度結果，最終取抗血清時，大白兔的抗血清的滴度大于I : 10240。序列表<110>天津超然生物技術有限公司〈120〉一種HPV18L1多核苷酸序列及其表達載體、宿主細胞和應用〈130〉<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1〈211>1524<212>DNA<213>HPV18L1病毒編碼基因<400>1atggctttgt ggcggcctag tgacaatacc gtatatcttc cacctccttc tgtggcaaga 60gttgtaaata ccgatgatta tgtgactcgc acaagcatat tttatcatgc tggcagctct 120agattattaa ctgttggtaa tccatatttt agggttcctg caggtggtgg caataagcag 180gatattccta aggtttctgc ataccaatat agagtattta gggtgcagtt acctgaccca 240aataaatttg gtttacctga tactagtatt tataatcctg aaacacaacg tttagtgtgg 300
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權利要求
1.一種HPV18L1多核苷酸序列，其特征在于其多核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
2.一種多肽，其特征在于它包含權利要求I所述的多核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的多肽，其特征在于所述多肽包含HPV18晚期基因產物的全部或一部分。
4.上述權利要求中任一項所述的多核苷酸序列，以高表達的漢遜酵母基因的偏愛密碼子使用系數為參照，首選兼并密碼子中漢遜酵母使用系數最大的密碼子，主要使用兼并密碼子中漢遜酵母偏愛性處于第一第二位的密碼子，少數情況使用第三位的密碼子。
5.上述權利要求1-3任一項的多核苷酸序列為保持了漢遜酵母密碼子偏愛使用方式的片段或類似物。
6.—種表達載體,它包含上述權利要求1-3任一項的多核苷酸序列，該多核苷酸序列與載體調控序列可操作連接，所述調控序列能使宿主細胞表達該多核苷酸序列。
7.一種宿主細胞，該細胞包含權利要求I所述的多核苷酸序列或權利要求6所述的表達載體。
8.依照權利要求7所述的宿主細胞，該宿主細胞具有表達載體能夠補償用于轉化子篩選的URA3營養缺陷。
9.權利要求1-4任一項所述的多核苷酸序列對應產物在治療或預防HPV感染制劑方面的應用。
10.權利要求1-8任一項在治療或預防皮疣，非典型鱗狀細胞，宮頸發育異常，頸上皮內瘤形成或宮頸癌藥物方面的應用。
全文摘要
本發明涉及一種HPV18L1多核苷酸序列及其表達載體、宿主細胞和應用，包括重組人乳頭瘤病毒L1衣殼蛋白的氨基酸序列，編碼該氨基酸序列的合成核苷酸序列，和包含該核苷酸序列的重組表達載體和漢遜酵母表達宿主菌株。本發明還涉及由該氨基酸序列及其衍生物所組成的HPV18L1蛋白在制備疫苗中的應用。本發明通過對HPV18L1野生型病毒基因核苷酸序列的改造，使得重組HPV18L1衣殼蛋白在漢遜酵母系統中高效表達，使得利用漢遜酵母表達系統工業生產HPV18L1衣殼蛋白成為現實，相對于目前采用的其他真核表達系統具有產率更高、成本低等優點。
文檔編號C12N15/37GK102719453SQ20121001323
公開日2012年10月10日 申請日期2012年1月16日 優先權日2012年1月16日
發明者孫長海, 宋立娜, 張濤, 李建, 楊珺, 汪和睦, 汪志良, 王昌華, 王玉香, 王艷俠, 齊懷豐 申請人:天津超然生物技術有限公司