專利名稱：一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1基因的cRNA 原位雜交探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及ー種探針及其制備方法，尤其是谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I基因的CRNA原位雜交探針及其制備方法。
背景技術(shù)：
谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在體內(nèi)主要與親離子性和親代謝性兩種谷氨酸受體家族結(jié)合發(fā)揮活化作用。谷氨酸如果在細(xì)胞外濃度過高，過度興奮 谷氨酸受體可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，由于細(xì)胞外沒有能分解谷氨酸的酶，釋放的谷氨酸幾乎完全依賴神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(EAAT)的攝取來保持濃度的相對穩(wěn)定，同時(shí)EAAT也為體內(nèi)很多代謝途徑提供谷氨酸來源。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分高親合力和低親合力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩種，高親合力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都作用于依賴鈉-鉀的L-谷氨酸，L-和D-天冬氨酸，所以也稱為鈉-鉀谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Excitatory aminoacid transporter, KAAT);目前已有五種被克隆,它們是它們是谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1 (EAAT1或 GLAST, Glutamate-aspartate transporter),谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2 (EAAT2 或 GLT, glialglutamate transporter),谷氨酸轉(zhuǎn);tS 蛋 H -3 (EAAT3EAAC, excitatory amino acidCarrier),谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4(EAAT4)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-5(EAAT5)。在形態(tài)學(xué)研究方面，關(guān)于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I基因在活體動物中mRNA水平的檢測顯示尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I基因cRNA原位雜交的探針及其制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來解決的一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I基因的cRNA原位雜交的探針，該探針的序列為5 ' TCCTGCCTCTCCTCTACTTCCTGGTAACCCGGAAGAACCCCTGGGTTTTCATTGGAGGGTTGCTGCAAGCACTCATCACAGCCCTGGGGACCTCCTCAAGTTCTGCCACCCTGCCCATCACTTTCAAGTGCCTGGAAGAAAACAATGGTGTGGACAAACGCATCACCAGATTTGTGCTTCCCGTGGGGGCCACCATTAACATGGATGGGACCGCCCTCTACGAGGCTTTGGCCGCCATTTTCATCGCTCAAGTTAACAACTTTGACCTGAATTTTGGACA 3'。所述探針的制備方法(I)根據(jù)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的Gene bank序列我們設(shè)計(jì)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白_1特異的引物，并且此對引物擴(kuò)增出280bp的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I片段作為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I特異的探針序列；(2)構(gòu)建谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測序；(3)制備谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA原位雜交探針；(4)檢測谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA探針的原位雜交。
所述步驟(I)中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I特異的引物是上游引物是5' TCCTGCCTCTCCTCTACTTC 3'；下游引物是5' GTCCAAAATTCAGGTCAAAG 3'。述步驟⑵按照如下步驟進(jìn)行(a)將大鼠的cDNA用設(shè)計(jì)的弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(b)將PCR產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；(c)將回收后的產(chǎn)物于4°C與多克隆位點(diǎn)兩端具有T7，SP6啟動子的載體進(jìn)行連接; (d)將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測序。所述步驟(3)按照如下步驟進(jìn)行(a)步驟(2)得到的細(xì)菌測序正確后，經(jīng)判斷確認(rèn)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I探針序列插入載體的順序是反向的；(b)需要使用Xba I限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切；(c)將酶切產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；(d)用T7RNA聚合酶對探針進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記。所述步驟(4)按照如下步驟進(jìn)行(a)將大鼠用O. 4戍巴比妥納深麻后，經(jīng)左心室摘管至升王動脈，用O. Olmol/L的DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4 %多聚甲醛灌注固定；所述的O. Olmol/LDEPC-PBS是2. 9克磷酸氫ニ鈉，O. 29克磷酸ニ氫鈉，9. O克氯化鈉用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為O. 1%的DEPC Iml放置過夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述4%的多聚甲醛是40. O克多聚甲醛加入500. Oml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500. Oml的O. 2mol/L PB緩沖液定容至1000ml。所述O. 2mol/L PB緩沖液是用29. 01克磷酸氫ニ鈉，2. 96克磷酸ニ氫鈉加超純水定容至500ml配制而成。(b)取材后進(jìn)行腦組織的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小時(shí)；(c)將固定好的組織進(jìn)行切片將組織切成25 30 μ m組織切片，并將切好的切片保存于O. Olmol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用；(d)將切好的組織片用O. Olmol/L的DEPC-PBS清洗I次，室溫，每次5_10分鐘；(e)將上述清洗過的片子用5xSSC清洗2次，室溫，毎次5_10分鐘；所述5xSSC是由20xSSC用超純水稀釋的，20xSSC為ー種檸檬酸緩沖液。(f)將5xSSC清洗后的組織片浸入預(yù)雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育1_2小時(shí)；所述預(yù)雜交液是由5ml的去離子甲酰胺,2. 5ml的20xSSC溶液,200 μ I的50xDenhardt’ s溶液，50 μ I的濃度為200mg/ml的Heparin溶液，100 μ I的濃度為10mg/ml的tRNA溶液，100 μ I的濃度為10%的CHAPS溶液，100 μ I的濃度為10%的Tween-20溶液，100 μ I的濃度為0. 5mol/L的ρΗ8. O的EDTA溶液和I. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成。所述50xDenhardt’s為ー種常用的雜交試劑；所述200mg/ml的Heparin為200mg的Heparin粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10mg/ml的tRNA為IOmg的tRNA粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的CHAPS為Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的 Tween-20 為 100 μ I 的 Tween-20 溶于 900 μ I 的 DEPC-H20 中配制而成；所述 0. 5mol/L的ρΗ8· O的EDTA為186. Ig ニ水こニ胺四こ酸ニ鈉加入800ml的DEPC-H20中在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)pH值至8. O然后定容至IL配制而成高壓滅菌備用；所述DEPC-H2O為IL超純水加入體積百分比為O. 1%的DEPC 1ml，放置過夜并高壓滅菌處理后的水。(g)將預(yù)雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小時(shí)；所述雜交液是上述預(yù)雜交液中加入終濃度為I. Oug/ml的cRNA探針配置成的。(h)雜交后用IxSSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘；⑴用2xSSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10-15分鐘；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37。。，I 次，每次 30-40 分鐘；
(k)用2xSSC洗滌上述的組織切片，室溫，I次，毎次10分鐘；(I)用O. Olmol/L PBS洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘；所述O. Olmol/L PBS是2. 9克磷酸氫ニ鈉，0. 29克磷酸ニ氫鈉，9. O克氯化鈉用超純水定容至IL配置的磷酸緩沖液。(m)按I : 2000的抗體效價(jià),在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體,對洗滌后的組織切片進(jìn)行孵育，室溫，放置過夜；(η)將經(jīng)過上步抗體孵育的組織片用0. 01mol/L PBS洗滌，于室溫，清洗3次，毎次10-15分鐘；(ο)用TS9. 5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，毎次15-20分鐘；所述TS9. 5為是由終濃度為摩爾濃度為0. lmol/L Tris-HCl (PH 9. 5)，摩爾濃度為0. lmol/LNaCl溶液和摩爾濃度為50mmol/L MgCL2用超純水配制而成；(P)將上述切片放于NBT-BCIP反應(yīng)液中避光孵育4 6小時(shí)，在此過程中觀察切片呈色強(qiáng)度；所述NBT-BCIP是ー種Roche公司生產(chǎn)的呈色反應(yīng)液。(q)當(dāng)呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，毎次10-15分鐘；(r)將上述洗滌后切片表于載玻片上；(s)晾干切片，再經(jīng)過ニ甲苯脫色，封片，以備觀察。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明對活體動物建立模型后進(jìn)行灌注、取材、切片，通過地高辛標(biāo)記的cRNA探針與組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I基因的mRNA發(fā)生特異性的結(jié)合，從而方便、準(zhǔn)確的觀察到組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I基因mRNA水平的變化。本發(fā)明使用的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的探針序列，對谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I基因mRNA的顯示有明確的特異性，實(shí)現(xiàn)了對谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I基因mRNA水平的顯示作用。


圖I為本發(fā)明的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I在海馬的分布X4倍圖；圖2為本發(fā)明的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I在海馬的分布X40倍圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)ー步詳細(xì)描述參見圖I和圖2，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I基因cRNA原位雜交探針的制備方法，按照如下步驟(I)根據(jù)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的Gene bank序列我們設(shè)計(jì)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白_1特異的引物，并且此對引物擴(kuò)增出280bp的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I片段作為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I特異的探針序列；(2)構(gòu)建谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測序；(3)制備谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA原位雜交探針；(4)檢測谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA探針的原位雜交。探針的設(shè)計(jì)根據(jù)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的Gene bank序列我們設(shè)計(jì)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I特異的引物，并且此對引物擴(kuò)增出280bp的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I片段作為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I特異的探針序列。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I特異的引物如下 上游引物5' TCCTGCCTCTCCTCTACTTC 3'；下游引物5' GTCCAAAATTCAGGTCAAAG 3'。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I特異的探針序列5 ' TCCTGCCTCTCCTCTACTTCCTGGTAACCCGGAAGAACCCCTGGGTTTTCATTGGAGGGTTGCTGCAAGCACTCATCACAGCCCTGGGGACCTCCTCAAGTTCTGCCACCCTGCCCATCACTTTCAAGTGCCTGGAAGAAAACAATGGTGTGGACAAACGCATCACCAGATTTGTGCTTCCCGTGGGGGCCACCATTAACATGGATGGGACCGCCCTCTACGAGGCTTTGGCCGCCATTTTCATCGCTCAAGTTAACAACTTTGACCTGAATTTTGGACA 3'谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒的構(gòu)建I.將大鼠的cDNA用設(shè)計(jì)的弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2.將PCR產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。3.將回收后的產(chǎn)物于4°C與多克隆位點(diǎn)兩端具有T7，SP6啟動子的載體進(jìn)行連接。4.將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，搖菌培養(yǎng)送金斯瑞公司進(jìn)行測序。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA原位雜交探針的制備I.測序正確后，經(jīng)判斷確認(rèn)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I探針序列插入載體的順序是反向的。2.需要使用Xba I限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切，3.將酶切產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。4.用T7RNA聚合酶對探針進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記，體外轉(zhuǎn)錄的試劑盒(AmbionMEGAscript)是Ambion公司的產(chǎn)品。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA探針的原位雜交檢測I.將大鼠用O. 4%戊巴比妥鈉深麻后，經(jīng)左心室插管至升主動脈，用O. Olmol/L的DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定。2.取材后進(jìn)行腦組織的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小時(shí)。3.將固定好的組織進(jìn)行切片將組織切成25 30 μ m組織切片，并將切好的切片保存于O. Olmol/L DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用。4.將切好的組織片用O. Olmol/L DEPC-PBS清洗I次，室溫，每次5分鐘。5.將上述清洗過的片子用5xSSC清洗2次，室溫，毎次5分鐘。6.將5xSSC清洗后的組織片浸入預(yù)雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育I小吋。7.將預(yù)雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小時(shí)。8.雜交后用IxSSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘。9.用2xSSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘。10.用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37°C，I 次，每次 30 分鐘。11.用2xSSC洗滌上述的組織切片，室溫，I次，毎次10分鐘。12.用O. Olmol/L PBS洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘。13.按 I : 2000 的抗體效價(jià)，在O. Olmol/L PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體，對洗滌后的組織切片進(jìn)行孵育，室溫，放置過夜。
14.將經(jīng)過上步抗體孵育的組織片用0. Olmol/L PBS的洗滌，于室溫，清洗3次，每次10分鐘。15.用TS9. 5洗滌上述0. 01mol/L PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15分鐘。16.將上述切片放于NBT-BCIP反應(yīng)液中避光孵育4 6小時(shí)，在此過程中觀察切
片呈色強(qiáng)度。17.當(dāng)呈色完成后，將切片用0. 01mol/L PBS清洗3次，室溫，每次10分鐘。18.將上述洗滌后切片表于載玻片上。19.晾干切片，再經(jīng)過ニ甲苯脫色，封片，以備觀察。所用試劑TIANGEN膠回收試劑盒公司天根貨號DP214-02兩端具有T7，SP6啟動子的載體公司invitrogen貨號K466001Xba I限制性內(nèi)切酶公司=Takara 貨號D1093AT7 RNA聚合酶試劑盒公司Ambion 貨號AM133320xSSC公司invitrogen 貨號AM976350xDenhardt’ s公司invitrogen 貨號750018Heperine公司sigma 貨號H3393tRNA公司sigma 貨號R8759CHAPS公司sigma 貨號C9426Tween-20公司sigma 貨號P9416Anti-Digoxigenin-AP公司Roche 貨號11093274910以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述掲示的方法及技術(shù)內(nèi)容作出些許的更動或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1基因的CRNA原位雜交的探針，其特征在干，該探針的序列為5' TCCTGCCTCTCCTCTACTTCCTGGTAACCCGGAAGAACCCCTGGGTTTTCATTGGAGGGTTGCTGCAAGCACTCATCACAGCCCTGGGGACCTCCTCAAGTTCTGCCACCCTGCCCATCACTTTCAAGTGCCTGGAAGAAAACAATGGTGTGGACAAACGCATCACCAGATTTGTGCTTCCCGTGGGGGCCACCATTAACATGGATGGGACCGCCCTCTACGAGGCTTTGGCCGCCATTTTCATCGCTCAAGTTAACAACTTTGACCTGAATTTTGGACA 3'。
2.如權(quán)利要求I所述探針的制備方法，其特征在干 (1)根據(jù)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的Genebank序列我們設(shè)計(jì)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I特異的引物，并且此對引物擴(kuò)增出280bp的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I片段作為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I特異的探針序列； (2)構(gòu)建谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測序； (3)制備谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA原位雜交探針； (4)檢測谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I的cRNA探針的原位雜交。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1特異的引物是 上游引物是 5' TCCTGCCTCTCCTCTACTTC 3'； 下游引物是 5' GTCCAAAATTCAGGTCAAAG 3'。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)按照如下步驟進(jìn)行 (a)將大鼠的cDNA用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (b)將PCR產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收； (c)將回收后的產(chǎn)物于4°C與多克隆位點(diǎn)兩端具有T7，SP6啟動子的載體進(jìn)行連接； (d)將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測序。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)按照如下步驟進(jìn)行 (a)步驟(2)得到的細(xì)菌測序正確后，經(jīng)判斷確認(rèn)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-I探針序列插入載體的順序是反向的； (b)需要使用XbaI限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切； (c)將酶切產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收； (d)用T7RNA聚合酶對探針進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)按照如下步驟進(jìn)行 (a)將大鼠用O.4%戍巴比妥納深麻后，經(jīng)左心室摘管至升王動脈，用O. Olmol/L的DEPC-PBS的快速沖洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的O. Olmol/L DEPC-PBS是2. 9克磷酸氫ニ鈉，O. 29克磷酸ニ氫鈉，9. O克氯化鈉用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為O. 1%的DEPC Iml放置過夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述4%的多聚甲醛是40. O克多聚甲醛加入500. Oml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500. Oml的O. 2mol/L PB緩沖液定容至IOOOml ;所述O. 2mol/L PB緩沖液是用29. 01克磷酸氫ニ鈉，2.96克磷酸ニ氫鈉加超純水定容至500ml配制而成； (b)取材后進(jìn)行腦組織的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定24小時(shí)； (c)將固定好的組織進(jìn)行切片將組織切成25 30μ m組織切片，并將切好的切片保存于O. Olmol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用； (d)將切好的組織片用O.Olmol/L的DEPC-PBS清洗I次，室溫，每次5_10分鐘； (e)將上述清洗過的片子用5xSSC清洗2次，室溫，每次5-10分鐘；所述5xSSC是由20xSSC用超純水稀釋的，20xSSC為ー種檸檬酸緩沖液； (f)將5xSSC清洗后的組織片浸入預(yù)雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育1-2小時(shí)； 所述預(yù)雜交液是由5ml的去離子甲酰胺，2. 5ml的20xSSC溶液，200 μ I的50xDenhardt’ s 溶液，50 μ I 的濃度為 200mg/ml 的 Heparin 溶液，100 μ I 的濃度為 IOmg/ml的tRNA溶液，100 μ I的濃度為10%的CHAPS溶液，100 μ I的濃度為10%的Tween-20溶 液，100 μ I的濃度為O. 5mol/L的ρΗ8· O的EDTA溶液和I. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成；所述50xDenhardt’ s為一種常用的雜交試劑； 所述200mg/ml的Heparin為200mg的Heparin粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10mg/ml的tRNA為IOmg的tRNA粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的CHAPS為Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成； 所述10%的Tween-20為100 μ I的Tween-20溶于900 μ I的DEPC-H20中配制而成；所述0. 5mol/L的pH8. O的EDTA為186. Ig ニ水こニ胺四こ酸ニ鈉加入800ml的DEPC-H20中在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)pH值至8. O然后定容至IL配制而成高壓滅菌備用；所述DEPC-H2O為IL超純水加入體積百分比為0. 1%的DEPC 1ml，放置過夜并高壓滅菌處理后的水； (g)將預(yù)雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小時(shí)；所述雜交液是上述預(yù)雜交液中加入終濃度為I. 0ug/ml的cRNA探針配置成的； (h)雜交后用IxSSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘； (i)用2xSSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10-15分鐘；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37°C，I 次，毎次 30-40 分鐘； (k)用2xSSC洗滌上述的組織切片，室溫，I次，毎次10分鐘； (I)用O. 01mol/L PBS洗滌上述的組織切片，室溫，I次，每次10分鐘；所述O. 01mol/LPBS是2. 9克磷酸氫ニ鈉，0. 29克磷酸ニ氫鈉，9. O克氯化鈉用超純水定容至IL配置的磷酸緩沖液； (m)按I : 2000的抗體效價(jià),在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體,對洗漆后的組織切片進(jìn)行孵育，室溫，放置過夜； (η)將經(jīng)過上步抗體孵育的組織片用0. Olmol/L PBS洗滌，于室溫，清洗3次，毎次10-15分鐘； (ο)用TS9. 5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15-20分鐘；所述TS9. 5為是由終濃度為摩爾濃度為0. lmol/L Tris-HCl (PH 9. 5)，摩爾濃度為0. lmol/LNaCl溶液和摩爾濃度為50mmol/LMgCL2用超純水配制而成； (P)將上述切片放于NBT-BCIP反應(yīng)液中避光孵育4 6小時(shí)，在此過程中觀察切片呈色強(qiáng)度；所述NBT-BCIP是ー種Roche公司生產(chǎn)的呈色反應(yīng)液； (q)當(dāng)呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10-15分鐘； (r)將上述洗滌后切片表于載玻片上； (S)晾干切片，再經(jīng)過ニ甲苯脫色，封片，以備觀察。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1基因的cRNA原位雜交探針及其制備方法，按照如下步驟(1)根據(jù)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1的Genebank序列我們設(shè)計(jì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1特異的引物，并且此對引物擴(kuò)增出280bp的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1片段作為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1特異的探針序列；(2)構(gòu)建谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測序；(3)制備谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1的cRNA原位雜交探針；(4)檢測谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1的cRNA探針的原位雜交。
文檔編號C12Q1/68GK102643897SQ20121002200
公開日2012年8月22日 申請日期2012年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月1日
發(fā)明者李云慶, 武勝昔, 王文, 陳晶, 魏燕燕, 黃靜 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)