專利名稱：清酒假絲酵母及其發酵方法
技術領域：
本發明涉及清酒假絲酵母(Candida sake)及其發酵生產長鏈二元酸的方法。
背景技術：
長鏈二元酸(LCDA也稱為長鏈二羧酸和長鏈二酸)包括化學式HOOC (CH2) nC00H的二元酸，其中η > 7。LCDA是一系列特種合成材料的基礎單體原料。長鏈二元酸及其衍生單體可以用于生產特種尼龍、聚碳酸酯、粉末涂料、香料、熱熔膠、特種潤滑劑等，是合成香料、工程塑料、耐寒增塑劑、高級潤滑油和聚酰胺熱熔膠、粉末涂料等產品的重要原料。本領域存在多種長鏈二元酸的化學合成方法，但使用方法不容易且大部分得到的是長鏈二元酸與短鏈二元酸的混合物。因此，用這些方法生產長鏈二元酸時需要進一步純化步驟。本領域熟知可利用微生物轉化烷烴、脂肪酸或其酯生產長鏈二元酸。由于現有生物方法的限制，化學合成仍然是生產長鏈二元酸的優選途徑。本領域一般使用幾種酵母菌株進行發酵生產長鏈二元酸，當使用烷烴或脂肪酸作為碳源培養時，長鏈二元酸作為副產物產生。酵母對烷烴和脂肪酸進行新陳代謝時有三個生物化學過程:燒烴至脂肪酸的alpha-氧化,脂肪酸至alpha-, omega- 二羧酸的omega氧化以及脂肪酸至CO2和水的降解型beta-氧化。相對于非生物轉化方法，生產二元酸的生物轉化方法具有多種潛在優勢。其中主要在于使用可再生的原料作為起始材料以及生產二元酸過程中不產生有害化學副產物的能力。使用生物方法的另一重要優勢在于這種方法可容易地調節以利用相同生物催化劑和相同設備生產多種二元酸。因為現有有機化學合成僅適于生產單種二元酸，幾種不同二元酸合成將需要各二元酸的新的合成方案的開發。另一方面，酵母生物催化劑可以利用相同設備、培養基和步驟生產各種長度的二元酸，不同之處僅在于給酵母提供不同碳原子長度的底物。雖然可以利用各種技術來提高現有的酵母例如熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)發酵二元酸的產量，但還可以通過提供新的假絲酵母菌株以生產更高產量的長鏈二元酸，包括十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸和十六烷二酸。因此本發明的一個目的是提供新的菌株和利用這些菌株生產一種或多種長鏈二元酸的方法。使用該假絲酵母來生產長鏈二元酸可以完全取代化學合成法，而且具有產量高，低能耗，節約原材料的優點。

發明內容
在本發明一個實施方案中，提供了清酒假絲酵母CAT H4013 CCTCC M 2011486。所述菌種于2011年12月29日保藏于中國典型培養物保藏中心(中國武漢武漢大學)，保藏編號為:CCTCC M 2011486。在本發明另一實施方案中，提供了利用所述清酒假絲酵母CATH4013 CCTCC M2011486生產二元酸的方法，所述方法包括以下步驟:a.在含至少一種氮源和至少一種有機底物的培養基中培 養清酒假絲酵母CAT H4013;和b.回收從a步中培養的二元酸。
在本發明又一實施方案中，提供了利用所述清酒假絲酵母CAT H4013 CCTCC M2011486生產二元酸的方法，所述方法包括以下步驟:a.在含至少一種氮源和至少一種有機底物的培養基中培養清酒假絲酵母CATH4013，其中所述至少一種有機底物選自具有12至16個碳原子的烷烴或者12至16個碳原子的正烷烴；和b.回收從a步中培養的二元酸。在上述實施方案中，所述二元酸為十二碳至十六碳二元酸中至少一種或者正十二碳至十六碳二元酸中至少一種。在本發明又一實施方案中，提供了利用所述清酒假絲酵母CAT H4013 CCTCC M2011486生產二元酸的方法，所述方法包括以下步驟:a.在含至少一種氮源和正十三烷烴的培養基中培養清酒假絲酵母CAT H4013;和b.回收從a步中培養的正十三烷二酸。在上述實施方案中，本領域技術人員熟知可以使用的氮源。可使用各種有機氮和無機氮。有機氮源包括但不限于酵母膏、玉米漿、牛肉膏、豆柏水解液、蛋白胨、尿素、各種氨基酸及肽等，優選的氮源為尿素。無機氮源包括但不限于硝酸鹽、氨水、液氨、銨鹽、亞硝酸鹽等。清酒假絲酵母CAT H4013 CCTCC M 2011486的用途，其主要用于生產長鏈二元酸的應用。


圖1所示為CAT H4013的P0X5基因的蛋白序列對比圖。圖2所示為CAT H4013的P0X5基因DNA序列對比圖。圖3所示為CAT H4013的P0X4基因的蛋白序列對比圖。圖4所示為CAT H4013的P0X4基因DNA序列對比圖。

圖5所示為CAT H4013的CYTb5基因的蛋白序列對比圖。圖6所示為CAT H4013的CYTb5基因DNA序列對比圖。圖7所示為CAT H4013的CYP52D2基因的蛋白序列對比圖。圖8所示為CAT H4013的CYP52D2基因DNA序列對比圖。圖9所示為CAT H4013的CYP52A12基因的蛋白序列對比圖。圖10所示為CAT H4013的CYP52A12基因DNA序列對比圖。圖11所示為CAT H4013的CYP52A15基因的蛋白序列對比圖。圖12所示為CAT H4013的CYP52A15基因DNA序列對比圖。
具體實施方案通過閱讀下述詳細說明，本領域技術人員將更易理解本發明的這些和其它實施方案、要素和優點。應理解，提供以下實施例以證明并進一步解釋本發明的一些優選的實施方式和方面，不應被解釋為限制其范圍。盡管與本文描述相似或相當的方法和材料可用于本公開的實踐或試驗，但本文描述了合適的方法和材料。除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語與本公開所屬領域技術人員通常理解的含義相同。如果有沖突，以本說明的定義為準。當數量、濃度、或者其它值或參數以范圍或者高低值列表給出時，應理解為特定公開任一對任意高低范圍界限組成的所有范圍，無論范圍是否單獨公開。當本文列舉數值的范圍，除非另外說明，該范圍意在包括其端點，以及該范圍內所有整數和分數。當定義范圍時，無意將本發明的范圍限于列舉的特定值。當用于本文時，術語“包含”、“包括”、“具有”或其任何其它變體，意在涉及非排他包含。例如，包含一系列要素的工藝、方法、物體、或裝置并不必要地限于僅僅那些要素，而是可包括未特別列出的或此類工藝、方法、物體、或裝置固有的其它要素。本文中“一個”或“一種”用于描述多種要素和成分時僅為方便并提供本公開的一般含義。該描述應理解為包括一個或至少一個且單數也包括復數，除非明顯其意在其它。本文的材料、方法、和示例僅作說明用，除非特別說明，無意作為限制。實施例本文對部分術語定義如下:活化培養基采用稱為“YPD培養基·”的一種水溶液培養基，其包含如下成分:20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取液，和20g/L蛋白胨。所述的“YPD培養基”含有培養基重量2%的瓊脂，使培養基在室溫下成凝膠狀。所述YPD培養基通過水與IN氫氧化鈉溶液將pH調節至7.0-7.5制備。將該培養基在121°C下滅菌20min。搖瓶種子培養基另一適于培養本發明菌株的培養基為“種子培養基"，其是一種水溶液培養基，包含如下成分:10-30g/L蔗糖，1.5-10g/L玉米漿液，l-10g/L酵母提取液，4_12g/L KH2PO4,0.5-5g/L脲，和0-50ml/L重蠟。所述培養基用水制備，并在121°C下滅菌20min。尿素單獨滅菌，110°C下滅菌15分鐘，冷卻后與滅過菌的其他成分混合，作為種子培養基使用。搖瓶發酵培養基另一適于培養本發明菌株的培養基為“發酵培養基”，其是一種水溶液培養基，包含如下成分:l_10g/L玉米漿液，l-10g/L酵母提取液，5-12g/LKH2P04，0-3g/L氯化鈉，4-12g/L硝酸鉀，10-40g/L蔗糖，0.5_3g/L脲，和200_300mL/L單一烷烴或者混合烷烴，Ο-lg/L丙烯酸，0-0.5g/L吐溫80。所述通過水與IN氫氧化鈉溶液將pH調節至7.5-7.8。將該培養基在121°C下滅菌20min。尿素單獨滅菌，110°C下滅菌15分鐘，冷卻后與滅過菌的其他成分混合，作為發酵培養基使用。根據本發明，菌株可用于各種發酵工藝中，包括500ml發酵搖瓶工藝，其包括如下:用接種環將細胞在試管斜面中的滅菌的YPD培養基上均勻鋪展開。將該斜面在穩定為29-30°C下培養2天。然后將該斜面培養物的三分之一接種裝在500ml搖瓶中的30ml的滅菌種子培養基中并在溫度為29-30°C下培養36-48小時，搖瓶速度為200_250rpm，搖動的幅度為2.5-3.5cm。然后將種子發酵的肉湯接種至裝在500ml發酵瓶中的滅菌的發酵培養基。該培養物在溫度為29-30°C下培養90-120小時，搖瓶速度為200_240rpm，搖動的幅度為2.5-3.5cm，并通過監測和用IN氫氧化鈉溶液調節將pH維持在7.0-8.0之間。該發酵肉湯中的二羧酸濃度可在此步之后測定。實施例1清酒假絲酵母的鑒定從油田篩選了清酒假絲酵母(Candida sake)，經過化學誘變處理得到高產正十三碳二元酸的菌株。
清酒假絲酵母(Candida sake)的鑒定:1.樣品采集:山東省濱州市郊區勝利油田采集，為黑褐色原油污染土樣。2.采集標本的菌種分離:將采集到的所有土樣分別制成稀釋度為10_3、10_4、10_5、
10_6的稀釋液分別在YPD平板上進行涂布。培養條件:30°C，48小時。經多次分離培養，獲得油田酵母菌的純化單菌落。3.鑒定與《酵母菌的分類學研究》(The Yeasts:A Taxonomic Study)第90章假絲酵母屬
(Candida Berkhout) 90.241清酒假絲酵母(Candida sake)比對(P1209),確定是清酒假絲酵母。3.1碳源和氮源的利用在公知的微生物鑒定下進行營養物利用實驗。在特定培養基中加入下列氮源或碳
源，菌體培養2天或3天后，是否生長為判斷條件，判斷陰性與陽性，結果如下:
權利要求
1.清酒假絲酵母(Candidasake) CAT H4013 保藏號為 CCTCC M2011486。
2.制備二元酸的方法，所述方法包括以下步驟:a.在含至少一種氮源和至少一種有機底物的培養基中培養清酒假絲酵母CAT H4013;和b.回收從a步中培養的二元酸。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述至少一種有機底物選自具有12至16個碳原子的烷烴。
4.如權利要求2所述的方法，其中所述至少一種有機底物選自具有12至16個碳原子的正烷烴。
5.如權利要求2所述的方法，其中所述至少一種有機底物為正十三烷烴。
6.如權利要求2所述的方法，其中所述二元酸為十二碳至十六碳二元酸中至少一種或者正十二碳至十六碳二元酸中至少一種。
7.如權利要求2-6中任一項所述的方法，其中所述氮源為有機氮源或者無機氮源。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述的有機氮源為酵母膏、玉米漿、牛肉膏、豆柏水解液、蛋白胨、尿素、各種氨基酸及肽中的一種或多種。
9.如權利要求7所述的方法，其中所述的無機氮源為硝酸鹽、氨水、液氨、銨鹽、亞硝酸鹽中的一種或多種。
10.如權利要求1所述清酒假絲 酵母在生產長鏈二元酸的應用。
全文摘要
本發明涉及清酒假絲酵母新菌株及其發酵生產長鏈二元酸的方法。
文檔編號C12N1/16GK103243035SQ20121003037
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者劉馳, 廖錦繡, 汪江林, 秦海斌, 李乃強 申請人:上海凱賽生物技術研發中心有限公司, 山東凱賽生物科技材料有限公司, 上海凱賽生物科技有限公司, 凱賽生物產業有限公司