專利名稱：一種產生慶大霉素C1a的工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明屬于抗生素制藥領域，涉及一種主要產生慶大霉素Cla組分的工程菌及其構建方法與應用，可以應用于抗生素制藥領域，應用空間較大。具體涉及一種產生慶大霉素 Cla的工程菌及其構建方法。
背景技術：
小單孢菌是一屬能產生多種具有臨床價值抗生素的微生物，在先后報道的60種小單孢菌中，就有40多種產生抗生素，其中包括大環內酯類、氨基糖苷類、安莎類和蒽環類等等。小單孢菌不僅可以產生鏈霉菌所產生的抗生素，還產生慶大霉素(Gentamicin)、西索米星(Sisomicin)、阿司米星(Astromivin)等。小單孢菌有巨大的潛力，日益受到人們的重視。慶大霉素(Gentamicin, GM)是由放線菌屬絳紅小單孢菌(Micromonospora purpurea)、棘孢小單孢菌(Micromonospora echinospora )發酵產生的氨基糖苷類廣譜抗生素，對多種革蘭陰性菌和陽性菌有較強的抗菌作用。1963年被美國人Weinstein首次發現，1969年被用于臨床，它也是我國獨立自主研制成功的廣譜抗生素。慶大霉素各組分在結構上很相近，由三個環狀結構組成，分別為絳紅糖胺，2-脫氧鏈霉胺和加拉糖胺。根據分子結構的差異可以分為慶大霉素C，慶大霉素A，慶大霉素B和慶大霉素X等。慶大霉素C是主組分，2-脫氧鏈霉胺分別在4、6位上通過苷鍵連接絳紅糖胺和加拉糖胺。因絳紅糖胺C6’上的甲基化程度不同，形成了 Cl、C2、Cla三個組分。慶大霉素不同組分的抗菌活性因它們與細菌核糖體的親和力不同而異，最有效的成分為Cla，它的活性略高于C2，而Cl與細菌核糖體的親和力最弱。慶大霉素Cla組分可作為合成抗菌藥物依替米星的前體藥物，應用空間較大。慶大霉素的生物合成基因簇已被克隆。根據抗性基因與合成基因連鎖的規律， Unwin等用已報道的慶大霉素抗性基因設計引物，認Micromonospora echinospora ATCC15835基因組質粒文庫為模板進行PCR擴增，從1000個質粒中篩選到I個陽性克隆，包括38kb的外源片段，其中有28個完整的0RF。其中，講訪基因的功能已經被證實。講沐基因編碼產物與olivasterospora中的基因產物有57%的同源性。 Fms7催化福提霉素6’位甲基化，使KLl轉變為KK1，所以推斷皮 沐為6’ -C位甲基化酶基因。同時，慶大霉素與西索米星的化學結構非常相似，推測它們有相似的生物合成路線和相似功能的基因。慶大霉素化學結構中比西索米星多6’-C位的甲基，而在它們生物合成基因的比對中發現，西索米星生物合成基因簇中沒有與講沐相似的基因，所以推測講沐為6’-C 甲基化酶基因。而慶大霉素Cla在6’ -N位甲基轉移酶的作用下繼續合成慶大霉素C2b。慶大霉素Cla最常采用的制備方法為從小諾霉素的發酵液中分離得到。該方法通常包括發酵，將發酵液經過過濾得到濾液，濾液經脫色濃縮、濃縮液用大孔吸附樹脂吸附、用三種不同比例的乙醇一氨水進行洗脫、解析，解析液經濃縮、噴霧干燥得到慶大霉素Cla。 這種方法存在不足之處，例如生產周期長(480小時/批)；生產工藝復雜，樹脂吸附后需用混合溶液經過三次洗脫、解析才能得到慶大霉素Cla ;混合洗脫劑和解析劑中的乙醇采用蒸餾塔回收，設備復雜，需消耗大量蒸汽；所用大孔吸附樹脂的吸附量小；產品含量低(一般為85% — 90%);原材料消耗大，成本高。另一種生產慶大霉素Cla的方法為篩選慶大霉素Cla高產菌株。通過誘變慶大霉素產生菌絳紅小單孢菌，獲得慶大霉素Cla高產菌株，通過分離純化方法得到。但該方法對研究的菌株遺傳背景研究不清晰，菌株發酵產物中仍然可能有慶大霉素其他C組分的存在。

發明內容
本發明通過基因工程的方法將負責慶大霉素生物合成C-6位甲基轉移酶的編碼基因阻斷，從而使生產菌不能合成慶大霉素C組分。所得菌株產生的Cla含量高，且菌株遺傳背景較清楚，不會發生回復突變。本發明的目的是提供一種主要產生慶大霉素Cla組分的工程菌。本發明的另一目的是提供該基因工程菌株的構建方法。本發明的進一步目的是基因工程菌的應用。本發明通過框架內刪除失活的方法破壞絳紅小單孢菌中的皮7沐基因，主要包括以下步驟
(I)講沐基因阻斷質粒的構建
本發明構建了一種重組穿梭質粒，其含有缺失348bp保守序列的講沐基因及其上下游部分序列。本發明所述的重組穿梭質粒的骨架是pKC1139。(2)阻斷質粒轉化絳紅小單孢菌
將所述的重組穿梭質粒轉化慶大霉素產生菌，得到轉化子。所述的轉化方法為接合轉移，慶大霉素產生菌為絳紅小單孢菌。(3)雙交換阻斷株的篩選
雙交換篩選是根據抗性表型，篩選獲得同源基因雙交換阻斷突變株，對阻斷變株在基因水平發生的DNA雙交換進行PCR驗證，從而篩選到組分發生變化的轉化子。(4)發酵產物的分析
發酵產物分析為原株和變株的發酵液經酸堿處理和上樹脂柱除雜后采用薄層色譜 TLC、生物顯影、HPLC-ELSD和MS等方法分析其產物變化情況。本發明主要產生的慶大霉素Cla組分可作為合成抗菌藥物依替米星的前體藥物， 應用空間較大。本發明將絳紅小單孢菌進行改造，敲除了講沐基因部分保守序列，得到了一種主要產生慶大霉素Cla的基因工程菌。本發明所構建的基因工程菌提高了慶大霉素 Cla的產量。本發明的制備方法中雙交換雙臂的長度分別為1300bp和1500bp，雙交換發生的幾率較高，雙交換結合子的篩選較快。得到的慶大霉素Cla產生菌命名purpurea gntlf,保藏編號 CGMCC NO. 4838，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2011年5月9日。


圖I是講沐基因阻斷質粒的構建過程；
圖2是原菌株與敏感菌株PCR驗證的電泳圖譜 I. λ -DNA/ HindIII marker ；2.原菌株；3·阻斷株；
圖3是基因工程菌發酵液的薄層色譜圖
I為慶大霉素Cla標準品，2為慶大霉素標準品，3為原始囷株發酵液，4為基因工程囷株發酵液，5為慶大霉素C2b標準品。A為Cl，B為C2，C為Cla，D為C2b ;
圖4是慶大霉素標準品和基因工程菌發酵液的HPLC-ELSD圖譜；
A為慶大霉素標準品，B為原始菌發酵液，C為基因工程菌發酵液，D為C2b標準品圖5是慶大霉素Cla的質譜圖。
-TGCTCTAGACGGGTAGAACGGGTTGGTCC -3’ 帶有油a I 酶切
-CGGAATTCCAGCGTTGGCAATAATCATCAGC -3’ 帶有 &oR I 酶
具體實施例方式實施例I :講沐基因阻斷質粒的構建
根據已經發表的Micromonospora echinospora 相應序列(GenBank登錄號 AY524043)設計引物
左臂上游引物K1 5’ - TCCAAGCTTGTACCCTCGGAGCCGGTCTTGT-3’ 帶有歷/ d III酶切位點；
左臂下游引物K2 5’ - TGCTCTAGACTGGGTTGCGTCTGCGTGAT -3’ 帶有油a I 酶切位點；擴增I. 3kb片段Pl ；
右臂上游引物K3 位點；
右臂下游引物Κ4 切位點；擴增1.5kb片段Ρ2。以絳紅小單孢菌總DNA為模板，PCR擴增I. 3kb和I. 5kb這兩個片段，刪除了基因內部348bp的保守序列，PCR反應的條件為(I) 95°C預變性5min ；(2)解鏈95°C X 90 s ； 退火 55°C X30 s ;延伸 72°C X3 min ;30 個循環；(3)72°C X7 min。將 PCR產物 Pl 片段電泳回收，皆Mindl 11和Xba I雙酶切后，連入經同樣雙酶切后的pi J2925上，轉化大腸桿菌 DH-5 α感受態，篩選陽性克隆，獲得重組質粒pMPKOl。質粒pMPKOl經油al和&oRI雙酶切后，電泳回收，與經過相同酶處理過的P2片段連接。連接產物轉化大腸桿菌DH-5ci感受態，篩選陽性克隆，獲得重組質粒PMPK02。PMPK2刪除了目的基因內部的348bp保守序列。 質粒pMPK02經歷idIII和&oRI雙酶切后，電泳回收P1+P2片段，連入經同樣雙酶切后的 PKC1139上，轉化大腸桿菌DH-5 α感受態，篩選陽性克隆，獲得重組質粒ρΜΡΚ03。實施例2 阻斷質粒ρΜΡΚ03轉化絳紅小單孢菌
將含有oriT的穿梭質粒轉入大腸桿菌ET12567 (pUZ8002)中，得到供體菌株大腸桿菌 ET12567 (pUZ8002，供體質粒)。將大腸桿菌ET12567 (pUZ8002，供體質粒)單菌落，接種于 3 ml LB培養基(加入作用濃度為25 Pg/ml卡那霉素和氯霉素以及50 μδ/πι1供體質粒對應的抗生素)中，37 °C培養過夜，按O. 2%轉種到20 ml含三種抗生素的LB培養基中，37 °C培養2. 5 3. O h，離心沉淀菌體，用新鮮的LB培養基洗滌兩次，最后將菌體懸浮于約7. 5 ml培養基中，鏡檢計數約為IO8數量級。制備絳紅小單孢菌單孢子懸液，用2 X YT培養基洗滌2次，溶解在一定體積2 X YT 中使單孢子濃度為108，50°C熱激活10 min，37°C水浴預培養2 3 h，冷卻至室溫。將處理好的供體菌O. 5 ml與絳紅小單孢菌單孢子懸液O. 5 ml于eppendorf管中混合，離心沉淀，用少量的殘液懸浮后涂布在MS培養基上。28°C培養2(T24 h，用800 μ 含安普霉素(濃度度50 Pg/ml)和吡哌酸(終濃度50 Pg/ml)的水溶液覆蓋。28°C繼續培養 144 h，平板上長出菌落。實施例3 :雙交換阻斷株的篩選
將28°C培養長出的轉化子傳加藥平板于37°C培養，因為阻斷質粒在42°C都不能復制， 只有通過同源交換整合到染色體上之后接合子才會生長，表現為安普霉素抗性，說明接合子都發生了單交換整合。將單交換菌株在無藥平板上傳三代，挑350個單菌落分別點種到含藥和無藥的平板上，篩選出2株安普霉素敏感的菌株，提取這兩株菌的總DNA，PCR驗證， 其中一株與對照一樣大，說明其發生了單交換的脫落；另一株的片段比對照小，說明其發生了雙交換，將這株菌命名為M purpurea gn tlT。實施例4 :發酵產物的分析
(1)絳紅小單孢菌基因工程菌的搖瓶發酵
將絳紅小單孢菌斜面用挖塊法接種于30mL種子培養基中，34°C搖床培養32_36h，10% 轉種于30mL發酵培養基中，34 °C搖床培養120h。種子培養基可溶性淀粉I. O,黃豆餅粉I. 5，葡萄糖O. 1，碳酸鈣O. 3，硝酸鉀
O.05 ；pH6. 8
發酵培養基可溶性淀粉5. O,黃豆餅粉3. 5，硫酸銨O. 05，蛋白胨O. 2，葡萄糖I. 5，硝酸鉀O. 05，碳酸鈣O. 6，氯化銨O. 1，玉米粉I. 5，氯化鈷10μ g/mL ；pH7. 5
(2)發酵液處理
用濃硫酸調節發酵液pH到I. 5,攪拌酸化30min,然后10000r/min離心IOmin,取上清并用2mol氫氧化鈉調pH至6. 8,10000r/min離心IOmin,取上清備用。(3)D152型樹脂除雜
將處理好的樹脂裝柱，用蒸餾水洗柱。然后將處理好的發酵液上柱，控制低流速，吸附后用蒸餾水洗脫至無色，用2mol的氨水解吸，用部分收集器收集。將有活性的解吸液合并。(4)薄層色譜分析
氯仿-甲醇-氨水(I 1:1)混合振搖，上相飽和，下相展開。通過薄層色譜和生物顯影分析，可以發現與原始菌株相比，阻斷株的組分發生了變化。(5 ) HPLC-ELSD 分析
色譜柱為ODS C18柱(Diamonsil)，流動相為0. 2mol/L三氟醋酸-甲醇(92 :8)，流速為每分鐘0. 6ml，用蒸發光檢測器檢測。原始菌株和阻斷株各組分的保留時間，峰面積和相對含量如下表
表一慶大霉素各組分標準品的保留時間
權利要求
1.一種基因工程菌，其特征是，該菌株主要產生慶大霉素Cla組分，將該基因工程菌命名為 Micromonospora purpurea ，其保藏編號為CGMCC NO. 4838。
2.根據權利要求I所述的基因工程菌，其特征是，在野生菌株基因組中阻斷講沐基因。
3.根據權利要求2所述的基因工程菌，其特征是，構建基因工程菌的野生菌株，為慶大霉素產生菌絳紅小單胞菌或荊棘小單胞菌。
4.根據權利要求2所述的基因工程菌，其特征是，阻斷基因的序列如SEQID No. I所不，基因相應的氣基酸序列如SEQ ID No. 2所不。
5.根據權利要求2所述的基因工程菌，其特征是，阻斷講沐基因的方法包括基因阻斷和基因替換。
6.一種如權利要求I所述的基因工程菌的構建方法，其特征是，主要包括以下步驟(1)講沐基因阻斷質粒的構建；(2)^/7沐基因阻斷質粒轉化絳紅小單孢菌；(3)講沐基因雙交換阻斷株的篩選；(4 )講沐基因阻斷變株發酵產物的分析。
7.根據權利要求6所述的基因工程菌的構建方法，其特征是，通過框架內刪除失活構建阻斷質粒，該方法為PCR分別獲得講沐基因上下游片段I. 3kb和I. 5kb，刪除講沐基因內部348bp的保守序列，將兩個片段同時連接到pIJ2925上，再通過歷·/ (! III，EcoR I雙酶切將這兩個片段連接到穿梭載體PKC1139上。
8.根據權利要求6所述的基因工程菌的構建方法，其特征是，所述的雙交換阻斷株的篩選是根據抗性表型，篩選獲得同源基因雙交換阻斷突變株，對阻斷突變株在基因水平發生的DNA雙交換進行PCR驗證，從而篩選到組分發生變化的轉化子。
9.根據權利要求6所述的基因工程菌的構建方法，其特征是，所述的發酵產物分析為變株和原株的發酵液經酸堿處理和上樹脂柱除雜后采用薄層色譜TLC、生物顯影、 HPLC-ELSD和MS分析其產物變化情況。
10.一種重組載體，其特征是，含有大腸桿菌和鏈霉菌復制起點，含有權利要求7中刪除后缺失部分保守序列的gn沐基因的溫敏型質粒。
11.一種轉化子，其特征是，含有權利要求10所述的重組載體。
12.如權利要求11所述的轉化子，其特征在于，所述的轉化子的宿主細胞是大腸桿菌 ET12567。
13.權利要求I所述的基因工程菌在合成抗菌藥物中的應用。
14.權利要求I所述的基因工程菌在產生慶大霉素Cla組分中的應用。
15.根據權利要求14所述的應用，其特征在于，包括將權利要求8所述的轉化子與產慶大霉素的絳紅小單孢菌接合，挑選接合子。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種主要產生慶大霉素C1a的工程菌及其構建方法，是利用基因阻斷技術對慶大霉素產生菌棘孢小單孢菌中的6’-C-甲基轉移酶基因gntK進行破壞，以阻斷慶大霉素C1，C2和C2a的合成，使其主要產生慶大霉素C1a和少部分的慶大霉素C2b。原始菌株中C1a，C2，C2a和C1的含量分別為6.5%，45.3%，20.1%和27.1%，而阻斷株中的C1a和C2b的含量分別為94.0%和6.0%。本發明通過框架內刪除失活的方法破壞棘孢小單孢菌中gntK基因，包括gntK基因阻斷質粒的構建，阻斷質粒轉化棘孢小單孢菌，雙交換菌株的篩選以及發酵產物的分析。本發明所構建的工程菌，不含有任何抗性標記，通過連續傳代，慶大霉素C1a產量非常穩定。
文檔編號C12N1/20GK102586146SQ20121003214
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月14日 優先權日2011年12月19日
發明者倪現樸, 夏煥章, 李 昊 申請人:沈陽藥科大學