專利名稱：豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒的rt-pcr檢測及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒的 RT-PCR檢測及其專用引物。
背景技術：
豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)的RT-PCR檢測方法是目前快速檢測這2種病原的常用方法，被廣泛應用于實驗室病原診斷。與病毒分離的方法相比較，RT-PCR方法診斷更快速簡便，病毒分離相對來說耗時長，在臨床上不利于快速診斷，目前病毒病的實驗室診斷主要應用PCR/RT-PCR方法，一些PRRSV、CSFV的RT-PCR試劑盒已經商品化并投入臨床應用。當前豬病多病毒混合感染相當嚴重。臨床上豬繁殖與呼吸障礙綜合征常呈現 PRRSV和HP-PRRSV共存現象，不易區分，而由兩種毒株引起的發病防控策略有所不同，因此鑒別診斷非常必要。商品化的PRRSV、CSFV檢測RT-PCR試劑盒都是單項RT-PCR，I個試劑盒I次試驗僅能檢測一種病毒，對于可能混合感染了 PRRSV、HP-PRRSV、CSFV的同份豬病料要確診病原就需要3種試劑盒并且要做3次RT-PCR實驗，不僅費時費力，檢測成本也較高, 既不經濟也不快捷。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測病毒的專用引物。本發明提供的檢測病毒的專用引物，包括引物對A和引物對B。所述弓丨物對A包括弓丨物I和引物2，所述引物對B包括引物3和引物4，所述引物I的核苷酸序列為序列表中的序列I所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列2所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列3所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列4。上述專用引物中的引物對A可以同時擴增出豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株CH-Ia和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株HuN4。上述專用弓丨物由所述弓I物對A和所述弓I物對B組成，所述引物對A由所述引物I和所述引物2組成，所述引物對B由所述引物3和所述引物4組成。上述弓I物對A和上述弓I物對B可獨立包裝。上述專用引物中，所述病毒為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒中的至少一種；所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株或高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株。2/7頁本發明的第二個目的是提供一種檢測病毒的RT-PCR試劑。本發明提供的RT-PCR試劑，由所述的專用引物中的所述引物對A、所述引物對B、 dNTP、RNA酶抑制劑(Rnasin)、聚合酶和緩沖液組成所述引物對A中的所述弓I物I和所述弓I物2在所述RT-PCR試劑中的終濃度均具體為O. 5 μ M，所述弓I物對B中的所述弓I物3和所述弓I物4在所述RT-PCR試劑中的終濃度均具體為I μ M ; 所述RNA酶抑制劑在所述RT-PCR試劑中的終濃度為O. 4U/ μ L ；每種所述dNTP在所述RT-PCR試劑中的終濃度均為O. 4mM ；所述聚合酶在所述RT-PCR試劑中的終濃度均為O. IU/ μ L ；所述緩沖液由10 X RT-PCR Buffer、5 X RT-PCR enhancer 和 Quant Rtase 組成，購自天根生化科技有限公司，產品目錄號KRl 13。所述病毒為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒中的至少一種；所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株或高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株。本發明的第三個目的是提供一種檢測病毒的試劑盒。本發明提供的試劑盒，包括上述RT-PCR試劑。在上述試劑盒中，所述病毒具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒中的至少一種；所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒進一步具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株。上述專用引物或上述RT-PCR試劑或上述試劑盒在檢測病毒或制備檢測病毒產品中的應用；所述病毒具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒中的至少一種；所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒進一步具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株或高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株。本發明的第四個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣本是否含有病毒的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用上述專用引物或上述RT-PCR試劑或上述試劑盒中的所述引物對A和所述引物對B共同對待測樣本進行RT-PCR擴增，得到RT-PCR擴增產物；檢測RT-PCR擴增產物，若所述RT-PCR擴增產物的大小僅為525bp和435bp中的至少一種，則樣本中含有或候選含有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒；若所述RT-PCR擴增產物的大小僅為707bp，則樣本中含有或候選含有豬瘟病毒；若所述RT-PCR擴增產物的大小為525bp和435bp中的至少一種與707bp，則樣本
中含有或候選含有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒。在上述方法中，若所述RT-PCR擴增產物的大小僅為525bp，則樣本中含有或候選含有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株；若所述RT-PCR擴增產物的大小僅為435bp，則樣本中含有或候選含有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；若所述RT-PCR擴增產物的大小為525bp和435bp，則樣本中含有或候選含有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株；若所述RT-PCR擴增產物的大小為525bp和707bp，則樣本中含有或候選含有豬繁
5殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株和豬瘟病毒；若所述RT-PCR擴增產物的大小435bp和707bp，則樣本中含有或候選含有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和豬瘟病毒；若所述RT-PCR擴增產物的大小為435bp、525bp和707bp，則樣本中含有或候選含
有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和豬瘟病毒三種病毒；所述525bp的RT-PCR產物的核苷酸序列具體為序列表中的序列5 ；所述435bp的RT-PCR產物的核苷酸序列具體為序列表中的序列6 ；所述707bp的RT-PCR產物的核苷酸序列具體為序列表中的序列7。所述RT-PCR擴增中，以待測樣本的RNA為模板；所述RT-PCR擴增的退火溫度為55°C -58°C，所述RT-PCR擴增的退火溫度具體為 53 0C ；所述檢測RT-PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。本發明的第五個目的是提供一種檢測病毒的引物對。本發明提供的一種檢測病毒的引物對A由所述引物I和所述引物2組成；所述病毒具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒；本發明還提供的一種檢測病毒的引物對B由所述引物3和所述引物4組成；所述
病毒具體為豬痕病毒。上述引物對A在制備檢測豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒株系產品中的應用也是本發明保護的范圍，上述應用中，所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒株系具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株或高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株；或上述弓I物對B在制備檢測豬瘟病毒產品中的應用也是本發明保護的范圍。在上述內容中，所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒CH-Ia株，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株為HuN4。本發明的實驗證明，本發明提供的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒CH-Ia株、高致病性變異株HuM和豬瘟病毒的多重RT-PCR檢測方法，一次反應能同時檢測出豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒CH-Ia株、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuM和豬瘟病毒3種病毒，所用2對引物特異性較好，引物相互之間有較低的同源性及互補性；所述引物敏感性較好最低能檢測到RNA含量為O. 8ng/ul ;所述的多重RT-PCR方法特異性高，敏感性強，簡便、 快速、經濟、高效。經過與商品試劑盒比對，以及在臨床上試用，檢測結果準確，可以在臨床大量樣品的檢測中廣泛應用，從而提高PRRSV，HP-PRRSV和CSFV三種病毒的快速診斷水平， 在臨床診斷上具有很好的應用前景。


圖I為PRRSV、HP-PRRSV, CSFV多重RT-PCR以及單項RT-PCR電泳圖結果圖2 為 PRRSV、HP-PRRSV, CSFV RT-PCR 特異性電泳圖結果圖3為PRRSV、HP-PRRSV, CSFV多重RT-PCR及單項RT-PCR敏感性電泳圖結果
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中PRRSV代表豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株，HP-PRRSV代表高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株。實施例I、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒的多重RT-PCR檢測方法構建和專用引物的設計I、引物設計在GenBank中檢索出HP_PRRSV(高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，Genbank號 EFl 12445)、PRRSV (豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株，Genbank號AY032626)、CSFV (豬瘟病毒，Genbank號AF092448)的部分已知序列。對病毒各基因區進行同源性分析,分別選取PRRSV的NSP2基因以及CSFV的E2基因中的一段基因作為PCR擴增的靶序列。利用 DNAMAN對靶序列進行引物設計，對設計出來的2種病毒引物(其中引物對A可以同時擴增出豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株)利用 DNAstar進行引物二聚體分析，以避免引物之間形成穩定的引物二聚體。選出擴增序列為 PRRSV(525bp)、HP-PRRSV(435bp)、CSFV(707bp)的如下2對引物，并對每對引物擴增序列的同源性或互補性進行分析。避免它們之間有較高的同源性或互補性，從而確定3種病毒的多重RT-PCR引物如下弓丨物對A由引物I和引物2組成，具體如下引物I :5’ GGGCGACAATGTCCCTAACG 3’(序列 I)；引物2 :5’ GAGTCGATGATGGCTTGAGC 3’(序列 2)；弓丨物對B由引物3和引物4組成，具體如下引物3 :5’ AGGGAAAGTACAATACAACC 3’ (序列 3)；引物4 :5’ CACCACCAAGACAACAAA 3’(序列 4)；2、RT-PCR反應條件優化 分別提取PRRSV和CSFV的病毒的RNA。PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合征病毒，Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) CH-Ia (經典株)記載在豬繁殖-呼吸道綜合征病毒(PRRSV) CH-Ia株基因型鑒定，童光志，仇華吉，彭金美，《中國獸醫學報》1998年第2期，公眾可從山東省動物疫病預防與控制中心獲得；HP-PRRSV (高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，High pathetic porcine reproductive and respiratory syndrome virus) HuN4記載在高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學分析，童光志，周艷君，郝曉芳，田志軍，仇華吉，彭金美，安同慶，中國預防獸醫學報，2007年05期，公眾可從山東省動物疫病預防與控制中心獲得;CSFV(豬瘟病毒，Hog cholera virus)記載在豬瘟病毒GSLZ株的分離與鑒定，何小兵，賈懷杰，陳國華，房永祥，李玩生，曾爽，景志忠，《中國獸醫科學》2011年，第2期，中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室農業部獸醫公共衛生重點開放實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，公眾可從山東省動物疫病預防與控制中心獲得。
分別提取PRRSV (經典株 CH-la)、HP-PRRSV (HuM)、CSFV 的 RNA，再分別以 PRRSV (經典株 CH-Ia)的 RNA、HP-PRRSV (HuN4)的 RNA、CSFV 的 RNA、PRRSV (經典株 CH-1 a) +HP-PRRSV (HuM) +CSFV混合RNA (體積比I I I)為模板，均以引物對A和引物對B共同作為引物，按照如下體系和程序進行RT-PCR擴增通過對RT-PCR反應條件優化，確定最佳的反應條件=RT-PCR擴增體系25 μ L， 上下游混合引物引物對A (各25 μ Μ) O. 5 μ L (各條引物的終濃度O. 5 μ Μ)、引物對B (各 50 μ Μ)0· 5 μ L(各條引物的終濃度 ΙμΜ)，RNA 模板 2 μ L，10XRT-PCR Buffer2. 5 μ L(購自天根生化科技有限公司，產品目錄號KRl 13)，5 X RT-PCR enhancer5 μ L (購自天根生化科技有限公司，產品目錄號KR113)，dNTP mixturedOmM each) I μ L(終濃度O. 4mM)， RNasin(40U/μ L)O. 25 μ L(終濃度0.4U/μ L), Hotmaster Taq polymerase (2. 5U/ μ L) I. 25 μ L (終濃度 O. IU/ μ L)，Quant Rtase，最后用水補充至 25 μ L。優化后的程序為50°C翻轉錄30min ;94°C預變性3min ;94°C變性30s，53°C退火 30s，65。。延伸 30s, 30 個循環；65°C延伸 10min，4°C保存。結果如圖I所示，其中I為陰性對照，2為PRRSV+HP-PRRSV+CSFV目標基因片斷，3 為CSFV目標基因片斷，4為PRRSV目標基因片斷，5為HP-PRRSV目標基因片斷。可以看出， 2 得到 525bp，435bp 和 707bp 產物，3 得到 707bp，4 得到 525bp，5 得到 435bp。分別將上述RT-PCR產物送去測序，結果為525bp的RT-PCR產物的核苷酸序列為序列表中的序列5 (PRRSV的Genbank號 AY032626 的第 2748-3272 位核苷酸)； 435bp的RT-PCR產物的核苷酸序列為序列表中的序列6 (HP-PRRSV的Genbank號 EFl 12445 的第 2747-3181 位核苷酸)；707bp的RT-PCR產物的核苷酸序列為序列表中的序列7 (CSFV的Genbank號 AF092448 的第 2774-3480 位核苷酸);因此擴增產物通過測序，其序列與GenBank中查出CSFV和PRRSV的已知序列比較，證實是目的基因。說明，該引物組可以用來鑒定PRRSV病毒、HP-PRRSV病毒和CSFV病毒。3、特異性檢測分別檢測上述涉及的RT-PCR反應的引物對A、B特異性，方法如下I)引物對A特異性分別提取PEDV (豬流行性腹瀉病毒)、TGEV (豬傳染性胃腸炎病毒)、BVDV (牛病毒性腹瀉病毒)的RNA ；PEDV (豬流行性腹灣病毒，Porcine Epidemic Diarrhea Virus)記載在豬流行性腹瀉病毒的分離和鑒定，賴月輝，李嘉愛，鄒永新，羅映霞，巫月生，吳文福，《廣東畜牧獸醫科技》2003年3期，廣東省生物藥廠粵生生物制品研究所，公眾可從山東省動物疫病預防與控制中心獲得；TGEV (豬傳染性胃腸炎病毒，Transmissible Gastroenteritis Coronavirus),請提供拉丁名)記載在豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及全基因組序列分析，宋振輝，郭萬柱，《病毒學報》2008年24卷05期，四川農業大學，動物生物技術中心，公眾可從山東省動物疫病預防與控制中心獲得；
BVDV(牛病毒性腹 寫病毒，Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus),請提供拉丁名)記載在牛病毒性腹瀉病毒BVDV-JL株的分離與鑒定，張淑琴，郭利，冷雪，張亭亭，吳永旺，武華，《中國預防獸醫學報》，2011年03期，公眾可從山東省動物疫病預防與控制中心獲得；分別以CSFV、PEDV, TGEV, BVDV, PRRSV, HP-PRRSV 的 RNA 為模板，以弓 I物對 B 為引物，按照上述步驟2中的RT-PCR體系和程序進行擴增，結果如圖2的1-6所示，其中I為 CSFV, 2 為 PRRSV，3 為 HP-PRRSV，4 為 PEDV，5 為 TGEV，6 為 BVDV，可以看出，只有 CSFV 有 707bp目的條帶，未見其他非特異性帶，說明引物對B特異性高。分別以CSFV、PEDV, TGEV, BVDV, PRRSV的RNA為模板，以引物對A為引物，按照上述步驟2中的RT-PCR體系和程序進行擴增，結果如圖2的7-12所示，其中，7為PRRSV，8為 HP-PRRSV，9 為 CSFV，10 為 PEDV，11 為 TGEV，12 為 BVDV，可以看出，只有 PRRSV，HP-PRRSV 分別有525bp目的條帶和435bp目的條帶，未見其他非特異性帶，說明引物對A特異性高。4、敏感性檢測通過分光光度計測OD值，測得由步驟2得到的PRRSV的RNA的濃度為24000 μ g/ μ I，由步驟2得到的HP-PRRSV的RNA的濃度為24000 μ g/μ I,由步驟2得到的CSFV的RNA 的濃度為8000 μ g/μ I。分別將PRRSV的RNA、CSFV的RNA和HP-PRRSV的RNA進行10倍系列稀釋后作為模板，以引物對A和引物對B共同為引物，按照步驟2的體系和程序進行擴增。結果見圖3 (A)和圖3 (B)所示，圖3 (A)中1-7分別為PRRSV+HP-PRRSV+CSFV (混合體積比I : I : I)的RNA的IO1-IO7倍稀釋，圖3 (B)中1_7為CSFV的RNA的IO1-IO7倍稀釋，8-14 為 PRRSV 的 RNA 的 IO1-IO7 倍稀釋，15-21 為 HP-PRRSV 的 RNA 的 IO1-IO7 倍稀釋； 可以看出，任何RNA，IO5倍稀釋的模板有比較清晰地目的條帶，IO6倍稀釋的模板有比較弱的目的條帶，稀釋IO7倍及以上的模板已完全看不到目的條帶。實驗證明本發明的多重RT-PCR可以檢測到PRRSV、HP-PRRSV的RNA的最小濃度均為24ng/ μ I，CSFV的RNA的最小濃度為8ng/ μ I。多重RT-PCV的敏感性與單項RT-PCR的敏感性無明顯差別。5、重復性對PRRSV，HP-PRRSV, CSFV多重RT-PCR方法進行多次重復試驗實驗，結果穩定。實施例2、專用引物的應用對315份臨床疑似病料(來源于山東省動物疫病預防與控制中心附設獸醫院門診送檢的病死豬的肝、腎、肺組織混合樣品(質量比為I : I : I)進行檢測，具體如下提取315份臨床疑似病料的RNA(編號為1_315)，用引物對A和B作為引物，按照步驟2的體系和程序進行RT-PCR擴增，若得到525bp的RT-PCR產物(序列表中的序列5)，則樣本為PRRSV陽性；若得到435bp的RT-PCR產物(序列表中的序列6)，則樣本為HP-PRRSV陽性；若得到707bp的RT-PCR產物(序列表中的序列7)，則樣本為CSFV陽性；若得到525bp和435bp的RT-PCR產物，則樣本為PRRSV陽性和HP-PRRSV陽性；若得到525bp和707bp的RT-PCR產物，則樣本為PRRSV陽性和CSFV陽性；若得到707bp和435bp的RT-PCR產物，則樣本為CSFV陽性和HP-PRRSV陽性；
若得到707bp，525bp和435bp的RT-PCR產物，則樣本為CSFV陽性、PRRSV陽性和 HP-PRRSV 陽性；若均沒有707bp，525bp 和 435bp 的 RT-PCR產物，則樣本為 CSFV、PRRSV和 HP-PRRSV 均為陰性；結果如下編號為1-28的得到525bp的RT-PCR產物(序列表中的序列5)，則編號為1_28的樣本為PRRSV陽性(共28份)，含有PRRSV ；編號為29-124的得到435bp的RT-PCR產物(序列表中的序列6)，則編號為 29-124的樣本為HP-PRRSV陽性(共96份)，含有HP-PRRSV ；編號為125-230的得到707bp的RT-PCR產物(序列表中的序列7)，則編號為 125-230的樣本為CSFV陽性(共106份)，含有CSFV ；編號為231-239的得到707bp和525bp的RT-PCR產物，則編號為231-239的樣本為CSFV陽性和PRRSV陽性(共9份)，含有CSFV和PRRSV ；編號為240-261的得到707bp和435bp的RT-PCR產物，則編號為240-261的樣本為CSFV陽性和HP-PRRSV陽性(共22份)，含有CSFV和HP-PRRSV ；編號為262-271的得到525bp和435bp的RT-PCR產物，則編號為262-271的樣本為PRRSV陽性和HP-PRRSV陽性(共10份)，含有PRRSV和HP-PRRSV ；編號為272-277 的得到 525bp，435bp 和 707bp 的 RT-PCR 產物，則編號為 272-277 的樣本為PRRSV陽性，HP-PRRSV陽性和CSFV陽性(共6份)，含有HP-PRRSV和CSFV ；編號為278-315的均沒有525bp，435bp和707bp的擴增，，則編號為278-315的樣本中沒有感染PRRSV、HP-PRRSV和CSFV中的任一種。采用商品PRRSV檢測試劑盒(購自北京世紀元亨)、CSVF檢測試劑盒(北京世紀元亨)分別對上述315份樣品進行單項RT-PCR，結果與本發明上述的結果一致，比對結果符合率為100%。以上實驗說明，本發明的引物A和引物B組合的弓丨物組可以進行檢測PRRSV、 HP-PRRSV和CSFV，而且方法快，準確率高。
權利要求
1.一種檢測病毒的專用引物，包括弓I物對A和引物對B，所述引物對A包括引物I和引物2，所述弓I物對B包括引物3和引物4，所述引物I的核苷酸序列為序列表中的序列I ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列3 ；所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列4。
2.根據權利要求I所述專用引物，其特征在于所述專用引物由所述引物對A和所述引物對B組成，所述病毒為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒中的至少一種；所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株或高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株。
3.—種檢測病毒的RT-PCR試劑，由權利要求I或2所述的專用引物中的所述引物對 A、所述引物對B、dNTP、RNA酶抑制劑、聚合酶和緩沖液組成。
4.根據權利要求3所述RT-PCR試劑，其特征在于所述引物對A中的所述引物I和所述引物2在所述RT-PCR試劑中的終濃度均為O.5μΜ,所述引物對B中的所述引物3和所述引物4在所述RT-PCR試劑中的終濃度均為 ΙμΜ ；所述病毒為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒中的至少一種；所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株或高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株。
5.一種檢測病毒的試劑盒，包括權利要求3或4所述RT-PCR試劑；所述病毒具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒中的至少一種；所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒進一步具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株或高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株。
6.權利要求I或2所述專用引物或權利要求3或4所述RT-PCR試劑或權利要求5所述試劑盒在檢測病毒或制備檢測病毒產品中的應用；所述病毒具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒中的至少一種；所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒進一步具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株或高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株。
7.—種檢測或輔助檢測待測樣本是否含有病毒的方法，包括如下步驟用權利要求I或2所述專用引物或權利要求3或4所述RT-PCR試劑或權利要求5所述試劑盒中的所述弓I物對A和所述弓I物對B共同對待測樣本進行RT-PCR擴增，得到RT-PCR 擴增產物；檢測RT-PCR擴增產物，若所述RT-PCR擴增產物的大小僅為525bp和435bp中的至少一種，則樣本中含有或候選含有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒；若所述RT-PCR擴增產物的大小僅為707bp，則樣本中含有或候選含有豬瘟病毒； 若所述RT-PCR擴增產物的大小為525bp和435bp中的至少一種與707bp，則樣本中含有或候選含有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒。
8.根據權利要求7所述方法，其特征在于若所述RT-PCR擴增產物的大小僅為525bp，則樣本中含有或候選含有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株；若所述RT-PCR擴增產物的大小僅為435bp，則樣本中含有或候選含有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；若所述RT-PCR擴增產物的大小為525bp和435bp，則樣本中含有或候選含有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株；若所述RT-PCR擴增產物的大小為525bp和707bp，則樣本中含有或候選含有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株和豬瘟病毒；若所述RT-PCR擴增產物的大小435bp和707bp，則樣本中含有或候選含有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和豬瘟病毒；若所述RT-PCR擴增產物的大小為435bp、525bp和707bp，則樣本中含有或候選含有豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和豬瘟病毒三種病毒;所述525bp的RT-PCR產物的核苷酸序列具體為序列表中的序列5 ；所述435bp的RT-PCR產物的核苷酸序列具體為序列表中的序列6 ；所述707bp的RT-PCR產物的核苷酸序列具體為序列表中的序列7。
9.一種檢測病毒的引物對，為引物對A或引物對B，所述引物對A由所述引物I和所述引物2組成；所述引物對B由所述引物3和所述引物4組成。
10.權利要求I或2所述專用引物中的所述引物對A在制備檢測豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒株系產品中的應用，所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒株系具體為豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株或高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株；或權利要求I或2所述專用引物中的所述引物對B在制備檢測豬瘟病毒產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒的RT-PCR檢測及其專用引物。本發明提供了檢測病毒的專用引物，包括引物對A和引物對B，所述引物對A包括引物1和引物2，所述引物對B包括引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本發明的實驗證明，本發明提供的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒和豬瘟病毒的多重RT-PCR檢測方法，一次反應能同時檢測出豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒經典株、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒株和豬瘟病毒3種病毒，在臨床診斷上具有很好的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK102586477SQ20121003415
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月15日 優先權日2012年2月15日
發明者蘭鄒然, 孫圣福, 張棟, 李云崗, 杜蘭榮 申請人:山東省動物疫病預防與控制中心