專利名稱：重金屬誘導下黃孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質提取領域，尤其涉及一種重金屬誘導下黃孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法。
背景技術：
環境中的重金屬通過食物鏈而在生物體內富集并持久存在，并日益威脅生態環境和人類健康。利用微生物處理工業廢水中的重金屬，具有費用低、對環境影響小、效率高等優點，越來越受到廣大科技人員的關注。白腐真菌對各種異生物質有廣譜而獨特的降解能力和降解機制，對溶液中重金屬離子也有良好的吸附效果。黃孢原毛平革菌是一種研究較廣的白腐真菌，其胞外聚合物主要為多糖和蛋白質，特別是蛋白質中的羥基、羧基、氨基等與重金屬離子的吸附與結合有重要關聯。研究胞外分泌物中的蛋白質種類、功能、分子量和等電點等，來探討黃孢原毛平革菌對重金屬吸附機理具有重要意義。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種步驟簡單、可行、 有效的對白腐真菌吸附重金屬研究具有重要意義的黃孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法。為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案一種在重金屬誘導下黃孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，包括以下步驟(I)培養過濾分離先液態培養黃孢原毛平革菌，再加入鎘離子溶液繼續培養，過濾得重金屬誘導后的胞外分泌液；(2)三氯乙酸(TCA)沉淀在所述胞外分泌液中加入TCA溶液，TCA溶液的添加量為所述胞外分泌液體積的1/9 1/10，沉淀過夜，經離心棄上清液，收集沉淀，得到沉淀物；(3)丙酮洗滌用丙酮溶液對所述沉淀物洗滌，離心、棄上清，(經冷凍)得到胞外分泌蛋白。上述的提取方法中，優選地，所述步驟(I)中，液態培養黃孢原毛平革菌至對數生長期中后期，加入鎘離子溶液繼續培養的時間為2h 4h，所述鎘離子溶液的濃度為 40 μ mo I 50 μ mol。上述的提取方法中，優選地，所述步驟(2)中，離心棄上清液后，再向此上清液中加入三氯乙酸溶液，并再次經沉淀過夜、離心棄上清液后，最后收集全部沉淀，得到所述沉淀物。上述的提取方法，所述步驟(2)中，加入的TCA溶液的質量-體積百分濃度優選為 98% 100% (w/ν) ο上述的提取方法，所述步驟(2)中，優選地，沉淀過夜的溫度為0°C 4°C，離心時的溫度和轉速分別為0°c 4°C和IOOOOrpm 12000rpm。
上述的提取方法，所述步驟(3)中，優選地，丙酮溶液的體積分數為80% 100%， 丙酮溶液經過低于_20°C預冷處理，并含O. 07% O. 08%的β -巰基乙醇。上述的提取方法，所述步驟(3)中，優選地，用丙酮溶液對沉淀物洗滌兩次，每次洗滌的溫度低于_20°C，每次洗滌的時間為5h 10h。與現有技術相比，本發明的優點為本發明的在重金屬誘導下黃孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，簡單、有效；采用質量-體積百分濃度為100%的沉淀劑TCA溶液， 能大量沉淀出蛋白，減少沉淀實驗中所需處理液體體積；該方法提取得到的胞外分泌蛋白， 結合熒光差異凝膠電泳技術，可以得到差異蛋白的種類、功能、分子量、等電點等，可找出在此過程中起主要作用的特異性蛋白和基因調控，為研究重金屬等逆境誘導下黃孢原毛平革菌分泌蛋白的變化及抵抗機理提供科學依據。


圖I是本發明實施例的黃孢原毛平革菌對重金屬鎘的去除率及吸附量隨時間的變化圖。圖2是本發明實施例的黃孢原毛平革菌在重金屬鎘誘導前、后分泌蛋白含量的變化圖。圖3是本發明實施例的黃孢原毛平革菌在重金屬鎘誘導前的蛋白質熒光差異凝膠電泳圖。圖4是本發明實施例的黃孢原毛平革菌在重金屬鎘誘導后的蛋白質熒光差異凝膠電泳圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例和附圖對本發明作進一步的說明。實施例一種本發明的重金屬誘導下黃孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，包括以下步驟(I)培養過濾分離選用一黃抱原毛平革菌(如Phanerochaete chrysosporium ATTC 96007,購自武漢大學中國典型培養物中心，優選采用該菌株，但不限于此)，從斜面培養基上刮取孢子于無菌水中制成懸液，將孢子懸液接種到250mL錐形瓶中，內裝有IOOmL Kirk液體培養基(滅菌)，于恒溫振蕩箱中培養，培養溫度35°C,搖床轉速為150rpm,培養后分別測得黃孢原毛平革菌在50h、55h、60h、65h、70h時間點的胞外蛋白分泌量(通過Bradford法測定)，并在這些時間點相應的投加重金屬鎘離子溶液(濃度為50 μ mol，調節pH 6.0)誘導4h，分別得到重金屬誘導前后胞外蛋白的分泌量及重金屬鎘的去除率和吸附量(原子吸收測定)，結果見圖I、圖2和表I ;表I :黃孢原毛平革菌不同時間點分泌蛋白量及對重金屬鎘的去除
權利要求
1.一種重金屬誘導下黃孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步驟(1)培養過濾分離先液態培養黃孢原毛平革菌，再加入鎘離子溶液繼續培養，過濾得重金屬誘導后的胞外分泌液；(2)三氯乙酸沉淀在所述胞外分泌液中加入三氯乙酸溶液，其添加量為所述胞外分泌液體積的1/9 1/10，沉淀過夜，經離心棄上清液，收集沉淀，得到沉淀物；(3)丙酮洗滌用丙酮溶液對所述沉淀物洗滌，離心、棄上清，得到胞外分泌蛋白。
2.根據權利要求I所述的提取方法，其特征在于所述步驟(I)中，液態培養黃孢原毛平革菌至對數生長期中后期，加入鎘離子溶液繼續培養的時間為2h 4h，所述鎘離子溶液的濃度為40 μ mo I 50 μ mol。
3.根據權利要求I或2所述的提取方法，其特征在于所述步驟(2)中，離心棄上清液后，再向此上清液中加入三氯乙酸溶液，并再次經沉淀過夜、離心棄上清液后，最后收集全部沉淀，得到所述沉淀物。
4.根據權利要求I或2所述的提取方法，其特征在于所述步驟(2)中，加入的三氯乙酸溶液質量-體積百分濃度為98% 100%。
5.根據權利要求I或2所述的提取方法，其特征在于所述步驟(2)中，沉淀過夜的溫度為(TC 4°C，離心時的溫度和轉速分別為(TC 4°C和IOOOOrpm 12000rpm。
6.根據權利要求I或2所述的提取方法，其特征在于所述步驟(3)中，丙酮溶液的體積分數為80% 100%，丙酮溶液經過低于_20°C預冷處理，并含O. 07% O. 08%的β -巰基乙醇。
7.根據權利要求I或2所述的提取方法，其特征在于所述步驟(3)中，用丙酮溶液對沉淀物洗滌兩次，每次洗滌的溫度低于_20°C，每次洗滌的時間為5h 10h。
全文摘要
本發明公開了一種重金屬誘導下黃孢原毛平革菌胞外分泌蛋白的提取方法，包括以下步驟先液態培養黃孢原毛平革菌，再加入鎘離子溶液培養，過濾得重金屬誘導后的胞外分泌液；在胞外分泌液中加入高百分濃度的三氯乙酸溶液，其添加量為胞外分泌液體積的1/9～1/10，沉淀過夜，經離心棄上清液，收集沉淀，得到沉淀物；最后用丙酮溶液對沉淀物洗滌，離心、棄上清，得到胞外分泌蛋白。本發明的提取方法簡單、有效，能大量沉淀出蛋白，減少沉淀中所需處理液體體積。
文檔編號C12P21/00GK102586367SQ20121003723
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月17日 優先權日2012年2月17日
發明者周穎, 官嵩, 尚翠, 曾光明, 李歡可, 楊靜, 賀建敏, 鄒正軍, 陳安偉, 陳桂秋 申請人:湖南大學