通過未受精胚珠培養雄性不育煙草單倍體的方法
【專利摘要】本發明提供一種通過未受精胚珠培養雄性不育煙草單倍體的方法。所述培養雄性不育煙草單倍體的方法是以未授粉的雄性不育煙草花蕾發育介于大孢子母細胞時期到二核期之間的胚珠為培養材料，經過消毒處理后在28℃光照培養室中，依次經過胚狀體誘導培養、再生芽生根培養和再生植株的培養之后培養而成，在培養過程過每天在1500Lux光照條件下連續光照十個小時。采用本發明的方法培育雄性不育煙草，明顯提高了煙草胚珠胚狀體的誘導和植株再生的頻率。
【專利說明】通過未受精胚珠培養雄性不育煙草單倍體的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于煙草育種【技術領域】，具體涉及通過未受精胚珠培養獲得雄性不育煙草雜交種單倍體的方法。
【背景技術】
[0002]單倍體是指具有配子染色體組成的孢子體。單倍體誘導技術作為現代高效育種體系的主要組成部分，具有如下顯著優點:作物單倍體材料加倍后即為純系(雙單倍體)，優中選優后可快速純合優良雜交組合的優異基因位點，從而使育種年限較常規方法縮短3~4年；其次，由于雙單倍體植株的基因型和表現型完全一致，在篩選育種材料時能大大降低誤選頻率，明顯提高選擇效率，特別是在選擇由隱性基因控制的優良性狀時更是優勢明顯。此外，利用單倍體培養可以快速獲得加倍單倍體(DH)群體，可為開展作物重要農藝性狀分子標記的理想材料，而利用分子標記進行輔助選擇是現代高效育種體系的主要組成部分(張正.2007.農作物單倍體育種研究概況與思考.山東農業科學，N0.5.122-125)。
[0003]煙草是世界上重要的經濟作物。通常，可以通過體外培養煙草的花藥或小孢子產生單倍體，即花藥起源的單倍體。20世紀90年代，美國一些煙草科研機構，特別是北卡州立大學煙草遺傳育種項目組做了大量研究，發現這類單倍體經加倍后往往產量和品質性狀劣變嚴重，育種利用的價值有限，再加上這類單倍體的加倍頻率很低，通常只有1%左右，目前這種方法在煙草育種中已很少使用(任學良，李繼新，李明海.2007.美國煙草育種進展簡況.中國煙草學報，N0.6.57-64)。而從煙草未授粉子房誘導單倍體植株具有明顯的優點，如倍性和性狀變異小，后代比較穩定，更接近于原始親本等(潘莉，楊鐵釗.2000.煙草未授粉子房胚狀體誘導的研究.西北植物學報，N0.1.59— 63)。
[0004]國外學者Wernsm an等人早在1979年就開始了煙草未授粉子房培養工作，并成功獲得了單倍體植株(Burk LG, Gerstel DU, Wernsman EA.1979.Maternal Haploids ofNicotiana tabacum L.from Seed.Science.，N0.2.585)。他們將煙草雌性單倍體和雄性單倍體加倍后的雙單倍體與它們的來源親本進行了比較，發現雌性雙單倍體優于雄性雙單倍體，雌性雙單倍體與來源親本更相似，不會造成產量和品質的劣變(Wernsman EA,Matzinger DF, Rebeca C Rufty.1989.Androgenetic vs.Gynogenetic Doubled Haploidsof Tobacc0.Crop Sci，N0.29.1151-1155)。目前，他們已經將這種技術成功應用于煙草育種中(任學良，李繼新，李明海.2007.美國煙草育種進展簡況.中國煙草學報，N0.6.57-64)。但這種方法不是直接利用子房或胚珠培養獲得單倍體，而是借助野生煙草N.africana作為雜交父本，獲得大量的高發芽力種子，雜交后代幼苗大多數在子葉階段死亡，存活的幼苗是易于分辨的母體單倍體，利用這類單倍體的葉柄體外培養很容易實現單倍體的自然加倍，而且頻率很高，通常達80%以上(任學良，李繼新，李明海.2007.美國煙草育種進展簡況.中國煙草學報，N0.6.57-64)。
[0005]國內學者祝仲純、吳海珊等人對普通煙草品種copus yeusuheku N0.4進行了未授粉子房培養(祝仲純，吳海珊.1979.從未授粉的小麥及煙草子房培養出單倍體植株.遺傳學報，N0.2.181-183)，繼之對普通煙草品種NC2326、大葉黃煙和不育煙草純系品種MSNC2326進行了未授粉子房培養(祝仲純，吳海珊.1981.從煙草單倍體植株未傳粉子房又培養出單倍體植株.遺傳學報，N0.1.63-65)，接著又對普通煙草品種革新五號進行了未授粉子房培養(祝仲純，劉振岳，吳海珊等.1981.離體培養未傳粉煙草子房的胚狀體發育.植物學報，N0.6.499-501)，他們以子房為外植體，直接將子房接種于Hl培養基(附加生長素IAA0.5mg/L和細胞分裂素KT2mg/L)上培養，但僅見copus yeusuheku N0.4通過子房培養獲得單倍體植株的報道。吳伯驥和鄭國鎦對普通煙草品種柳葉煙、金星煙、黃苗榆和黃花煙草品種甘肅黃花煙進行了未授粉子房培養，也是以子房作為外植體，直接將子房接種于H2培養基(附加生長素IAA0.5mg/L和細胞分裂素6_BA2mg/L)上培養，也獲得了單倍體植株(吳伯驥，鄭國鎦.1982.從未授粉煙草子房誘導單倍體植株的細胞學和胚胎學研究.植物學報，N0.2.125-129)，但具體品種不詳。而 申請人:采用與祝仲純等人和吳伯驥等人相同的培養基、相同時期的子房、相同的接種方法對雄性不育煙草未授粉子房進行培養，并未觀察到胚珠膨大、子房壁被推向上方，進而分化出再生植株的現象。其中，采用吳伯驥等人報道的附加生長素IAA0.5mg/L和細胞分裂素6_BA2mg/L的H2培養基，將子房直接接種，改為去除子房壁和剝取胚珠接種，胚珠并不直接形成胚狀體，進而發育成苗，而是先形成愈傷組織，再由愈傷組織分化形成胚狀體，最后長成植株,但單倍體植株頻率較低，并增加了性狀變異的風險。而且，祝仲純等人和吳伯驥等人均以花粉發育時期作為子房培養時期的依據不適合于雄性器官退化的雄性不育煙草。祝仲純等人采用N6培養基對大葉黃煙未傳粉子房進行了培養(祝仲純，吳海珊，安慶坤.1984.大葉黃煙未傳粉子房培養及其細胞學研究.遺傳學報，N0.4.281-287)，將花粉處于單核期的子房直接接種于N6培養基(附加生長素IAA0.5mg/L、細胞分裂素KT6mg/L、肌醇100mg/L和蔗糖8g/L)上培養，獲得了再生植株，但頻率很低，僅占4%;提高培養基中生長素的用量，能夠誘導出旺盛的愈傷組織，然后分化出大量的苗，但產生了染色體數的多樣畸變，單倍體植株頻率低。 申請人:采用相同培養基，以胚珠為外植體對雄性不育煙草進行培養，結果是除大孢子母細胞時期子房內胚珠外其它外植體產生膨大胚珠的比率極小。潘莉等人采用Hl培養基對普通煙草品種NC89未傳粉子房進行了培養(潘莉，劉宗才，喜進安.1998.外源激素對煙草未授粉子房培養的作用.河南農業大學學報，N0.2.16 7-170)，將子房作為外植體，直接接種于附加2，4-D和6-BA的Hl培養基上培養，結果表明，2，4-D能夠誘導子房產生愈傷組織，然后分化成胚狀體；6-BA濃度為8.89 μ mo I/L時，子房能夠直接產生胚狀體，進而形成小苗；6_BA濃度為2.22 μ mol/L和4.44 μ mol/L時，子房則先產生愈傷組織，再分化成胚狀體,進而形成小苗,但單倍體的誘導率低，形成小植株所需的時間長。他們繼之對普通煙草品種MC944、K326XC319、G80、Coker319、晉太6號、遼煙I號和不育純系品種MS NC89未傳粉子房進行了培養，并探討了胚狀體誘導的影響因素(潘莉，楊鐵釗.2000.煙草未授粉子房胚狀體誘導的研究.西北植物學報，N0.1.59-63)，但最終未見獲得再生植株的報道。冉邦定對普通煙草(SpeightG-28XBurley21) Fl、(Speight G28XKy56)Fl和紅花大金元品種進行了未授粉子房培養。選擇花冠比花萼約長I厘米的花蕾里的胚珠接種于附加KT2mg/L、IAA0.5mg/L、活性碳IOg/L的B5和H兩種基本培養基上，獲得了再生植株，但未鑒定倍性，結果不明確，且再生植株誘導率極低。 申請人:采用相同培養基、相同發育時期的胚珠進行培養，甚至未見有明顯膨大的胚珠。盡管前人涉及了雄性不育煙草未傳粉子房的培養(祝仲純，吳海珊.1981.從煙草單倍體植株未傳粉子房又培養出單倍體植株.遺傳學報，N0.1.63-65 ;潘莉，楊鐵釗.2000.煙草未授粉子房胚狀體誘導的研究.西北植物學報，N0.1.59-63)，但僅限于純系品種，未見有雄性不育雜交種未傳粉子房培養的報道，尤其是通過未受精胚珠培養獲得雄性不育煙草單倍體植株的研究，至今未見公開報道。

【發明內容】

[0006]本發明提供一種通過未受精胚珠培養獲得雄性不育煙草雜交種單倍體植株的方法，采用該方法可以明顯提高胚狀體和植株的誘導頻率。
[0007]本發明提供的技術方案:所述一種通過未受精胚珠培養雄性不育煙草單倍體的方法，其特征在于具體步驟如下:
[0008](1)制備培養基
[0009]采用Hl培養基或H2培養基作為基本培養基，然后加入生長素IAA、細胞分裂素KT(即激動素KT)、蔗糖和瓊脂制備成胚狀體誘導培養基，其中生長素IAA和細胞分裂素KT在胚狀體誘導培養基中的終濃度分別是0.5mg/L和2mg/L ;所述蔗糖和瓊脂在胚狀體誘導培養基中的終濃度分別是2%和1% ；
[0010]采用Hl培養基作為基本培養基，然后加入蔗糖和瓊脂制備成不含激素的固體狀再生芽誘導培養基，其中，所述蔗糖和瓊脂在再生芽誘導培養基中的終濃度是2%和1% ；
[0011]采用Hl培養基和N6培養基作為基本培養基，然后加入生長素IAA、蔗糖和瓊脂制備成固體狀再生芽生根培養基，其中生長素IAA在再生芽生根培養基中的終濃度是IOmg/L，蔗糖和瓊脂在再生芽生根培養基中的終濃度分別是8%和0.8% ；
[0012](2)培養材料的采集，在雄性不育煙草開花期間，采胚珠發育介于大孢子母細胞時期到二核期之間的未授粉的雄性不育煙草花蕾；
[0013](3)消毒處理和接種，將步驟(2)中采集的雄性不育煙草花蕾放入濃度為0.1%的升汞水溶液中消毒7-9min，然后用無菌水沖洗3_4次，在無菌條件下將花蕾的基部切掉，擠出子房，并去除子房壁或直接剝離胚珠后，將胚珠放入步驟(1)中制備的胚狀體誘導培養基中；
[0014](4)胚狀體的誘導，將步驟(3)中接種有胚珠的胚狀體誘導培養基置于28°C光照培養室中，每天在1500Lux光照下連續光照培養10小時，誘導胚珠產生胚狀體；
[0015](5)再生芽的誘導，將步驟(4)中獲得的胚狀體在無菌條件下轉移到步驟(1)中制備的再生芽誘導培養基上，繼續置于28°C光照培養室中，每天在1500LUX光照下連續光照培養10小時，培養2-3周，誘導胚狀體產生再生芽；
[0016](6)再生植株的培養，將步驟(5)中獲得的再生芽在無菌條件下轉移到再生芽生根培養基上，繼續置于28°C光照培養室中，每天在1500Lux光照下連續光照培養10小時，培養2-3周，使其生根形成小植株，之后，對萌發根的再生植株轉移到新配制的再生芽生根培養基上在同樣的條件下繼續培養，形成雄性不育煙草單倍體再生植株。
[0017]在步驟(6)中培養的雄性不育煙草單倍體再生植株長至2_3cm高或有3_4片葉片時，取所得再生植株的葉片樣品通過流式細胞儀分析進行倍性確定。通過流式細胞儀分析倍性是以正常的子房供體植株DNA含量作為對照標準，調節到40channelS，每個曲線峰至少分析10000個細胞，并重復4次。所述葉片樣品的制備方法:取按照上述方法培育的再生植株1.3-1.6cm2幼葉，在0.5ml的細胞裂解液中(Tris-Hcl buffer, ph=7.2)用刀片切碎，把樣品和溶液混合物通過孔徑30 μ m微孔膜過濾到測試管里，加20ul DAPI染色液[137mM NaCl, 2.7mM KC1,4.3mM Na2HP04,1.47mM KH2P04,0.4μ g propidium iodide (PI)(sigma) ,0.l%tritonX-100, and4 μ g RNAse A]染色 15min 后，將樣品上樣于流式細胞儀。
[0018]步驟2中采集的花蕾外觀表現時期介于花冠即將露出花萼時期至花冠比花萼長一倍而花藥未散粉時期之間階段的花蕾。
[0019]本發明步驟(1)中所述Hl培養基、H2培養基和N6培養基均是以水為溶劑，并按照每升水加入以下配方物質配制而成，每種培養基的具體物質配方如表1所示。
[0020]表1Hl培養液、H2培養液和N6培養液配方
[0021]
【權利要求】
1.一種通過未受精胚珠培養雄性不育煙草單倍體的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)制備培養基 采用Hl培養基或H2培養基作為基本培養基，然后加入生長素IAA、細胞分裂素KT、蔗糖和瓊脂制備成胚狀體誘導培養基，其中生長素IAA和細胞分裂素KT在胚狀體誘導培養基中的終濃度分別是0.5mg/L和2mg/L ;所述蔗糖和瓊脂在胚狀體誘導培養基中的終濃度分別是2%和1% ； 采用Hl培養基作為基本培養基，然后加入蔗糖和瓊脂制備成不含激素的固體狀再生芽誘導培養基，其中，所述蔗糖和瓊脂在再生芽誘導培養基中的終濃度是2%和1% ； 采用Hl培養基和N6培養基作為基本培養基，然后加入生長素IAA、蔗糖和瓊脂制備成固體狀再生芽生根培養基，其中生長素IAA在再生芽生根培養基中的終濃度是10mg/L，蔗糖和瓊脂在再生芽生根培養基中的終濃度分別是8%和0.8% ； (2)培養材料的采集，在雄性不育煙草開花期間，采胚珠發育介于大孢子母細胞時期到二核期之間的未授粉的雄性不育煙草花蕾； (3)消毒處理和接種，將步驟(2)中采集的雄性不育煙草花蕾放入濃度為0.1%的升汞水溶液中消毒7-9min，然后用無菌水沖洗3_4次，在無菌條件下將花蕾的基部切掉，擠出子房，并去除子房壁或直接剝離胚珠后，將胚珠放入步驟(1)中制備的胚狀體誘導培養基中； (4)胚狀體的誘導，將步驟(3)中接種有胚珠的胚狀體誘導培養基置于28°C光照培養室中，每天在1500LUX光照下連續光照培養10小時，誘導胚珠產生胚狀體； (5)再生芽的誘導，將步驟(4)中獲得的胚狀體在無菌條件下轉移到步驟(1)中制備的再生芽誘導培養基上，繼續置于28°C光照培養室中，每天在1500Lux光照下連續光照培養10小時，培養2-3周，誘導胚狀體產生再生芽； (6)再生植株的培養，將步驟(5)中獲得的再生芽在無菌條件下轉移到再生芽生根培養基上，繼續置于28°C光照培養室中，每天在1500Lux光照下連續光照培養10小時，培養2_3周，使其生根形成小植株，之后，對萌發根的再生植株轉移到新配制的再生芽生根培養基上在同樣的條件下繼續培養，形成雄性不育煙草單倍體再生植株。
2.根據權利要求1所述的一種通過未受精胚珠培養雄性不育煙草單倍體的方法，其特征在于該方法還包括以下步驟:在步驟(6)中培養的雄性不育煙草單倍體再生植株長至2-3cm高或有3-4片葉片時，取所得再生植株的葉片樣品通過流式細胞儀分析進行倍性確定。
3.根據權利要求1所述的一種通過未受精胚珠培養雄性不育煙草單倍體的方法，其特征在于:步驟2中采集的花蕾外觀表現時期介于花冠即將露出花萼時期至花冠比花萼長一倍而花藥未散粉時期之間階段的花蕾。
4.根據權利要求1所述的一種通過未受精胚珠培養雄性不育煙草單倍體的方法，其特征在于:步驟(7)中通過流式細胞儀分析倍性是以正常的子房供體植株DNA含量作為對照標準，調節到40channels,每個曲線峰至少分析10000個細胞,并重復4次。
5.根據權利要求2所述的一種通過未受精胚珠培養雄性不育煙草單倍體的方法，其特征在于:所述通過流式細胞儀進行倍性分析的葉片樣品是采取再生植株1.3cm2-l.6cm2幼葉，在0.5ml的細胞裂解液用刀片切碎，把樣品和溶液混合物通過孔徑30 μ m微孔膜過濾到測試管里，加20ul DAPI染色液染色15min后，將樣品上樣于流式細胞儀。
【文檔編號】A01H4/00GK103718957SQ201310680014
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】曹景林, 程君奇, 蔡長春, 黎根, 李亞培, 吳成林 申請人:湖北省煙草科研所