專利名稱：一種小麥抗白粉病基因分子標記引物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及小麥抗白粉病基因分子的標記引物，屬于植物生物技術領域，具體涉及一種可用于追蹤小麥品系07鑒126中抗白粉病基因的分子標記引物及其用途。
背景技術：
小麥是世界上重要的糧食作物，在全世界各大農作物產區均有大面積種植。在我國，特別是北方地區冬小麥產量約占全國小麥總產量的56%左右。小麥的高產、穩產， 對解決世界性糧食危機具有重要意義。小麥白粉病是由專性寄生菌(Blumeria graminis DC.)所引起的世界性主要病害，在嚴重年份能導致小麥減產50%以上。將抗性基因導入到小麥中是最經濟、有效、安全的防治方法。已被正式命名的抗白粉病主效基因有57個 (見參考文獻薛飛等O009)小麥地方品種小白冬麥抗白粉病基因分子標記.作物學報.35(10) :1806-1811)。但是在育種中得到應用的抗性基因十分有限。由于病菌變異快，產生的新毒性小種克服了原有抗病基因的抗性；另外，攜帶某些抗性基因的小麥品種其農藝性差而不宜作為育種親本直接用于生產實踐(見參考文獻詹海仙等O010)小麥抗白粉病基因來源及抗性評價的研究進展.中國農學通報，26 (10) :42-46)。目前，在我國對白粉病抗性最好的基因是Rii21。Rii21發現至今已經17年(見參考文獻Chen et al. Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew. TAG,1995, (91) :1125-1128.),并且在生產中已經發現了對其具有毒性的菌株(見參考文獻段霞瑜等(1998)小麥白粉病菌生理小種的鑒定與病菌毒性的檢測.植物病理學報.25(1) 31-36.)。因此挖掘和利用新的抗性基因，對小麥的穩產具有重要實踐意義。DNA分子標記技術因其具有多態性高、檢測方便、快速、準確等特點，在農作物抗病遺傳育種中發揮了極其重要的作用。一方面通過尋找與抗病基因緊密連鎖的分子標記，能夠直接或間接地定位抗病基因和識別抗病基因的異同；另一方面，應用與抗病基因緊密連鎖的分子標記，能夠把多個基因聚合在同一個品種中，從而實現基因累加，提高抗病育種的使用年限；更為重要的是，應用分子標記能夠在基因型水平上對抗病基因進行深入評價和鑒定，為分子標記輔助育種奠定基礎(見參考文獻邱永春和張書紳O004)小麥抗白粉病基因及其分子標記研究進展.麥類作物學報.24( :127 13 。本發明人團隊選育獲得一個抗白粉病的小麥品系“07鑒126”。該品系對我國目前白粉菌強優勢生理小種E09、 Ell和其它多種小種表現免疫或高度抵抗。“07鑒126感”是“07鑒126”的感病近等基因系。利用“07鑒126”和“07鑒126感”進行雜交，構建了 Fl和F2分離群體。通過對其進行抗條銹病性鑒定及分子標記篩選，結果表明，“07鑒126”的白粉病抗性為顯性單基因控制的全生育期抗性。(見參考文獻楊宏O009)小麥抗白粉病新基因PmCDl和抗條銹病基因的鑒定及分子標記篩選博士論文.中國科學院研究生院.)
發明內容
本發明在現有研究基礎上，進一步篩選和開發了與該白粉病基因緊密連鎖的分子標記，并在不同遺傳背景的分離群體中驗證了標記的有效性。這為利用分子標記輔助選擇轉育抗白粉病基因，選育抗白粉病小麥新品種奠定基礎。所解決的技術問題本發明目的在于提供基于聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)的可用于追蹤小麥品系07鑒126中抗白粉病基因的分子標記引物序列及其用途。本發明所提供的用于追蹤小麥品系07鑒126中抗白粉病基因緊密連鎖的分子標記引物為分子標記引物對)(cib9和分子標記引物對)(Cib5中的至少一對，其中所述的分子標記引物對)(cib9的脫氧核糖核苷酸序列為上游引物(F)5' -GTCTGCTCCAACTTCCTCT-3‘；下游引物(R)5' -CAGTTCAGCATCATCAATCG-3‘；使用該引物進行PCR擴增，僅能在抗病小麥品系07鑒定126的基因組DNA中擴增出一條I^bp的DNA特異片段，該片段的脫氧核糖核酸序列為GTCTGCTCCAACTTCCTCTGTCAGTACACCCATTTTCCTATCCTTTC
CTTCCTTGTTTCTTTCGTTCATCCATGAATCAATCGCTGAAGATCGATCGGAGATGGGGAGGCGGATTGAAATGAAACCGATTGATGATGCTGAACTG所述的分子標記引物對)(Cib5的脫氧核糖核苷酸引物序列為上游引物(F)5' -AGTCACTACAACGAGAGTTGG-3‘；下游引物(R)5' -TACAAGAGCTTCGTGCAGCAG-3‘。使用該引物進行PCR擴增，僅能在小麥品系07鑒定1 的基因組DNA中擴增出一條的DNA特異片段，該片段的脫氧核糖核酸序列為AGTCACTACAACGAGAGTTGGTGAGGTACACATCAATAACATGTATATCATATATACCTTGTTTTTCCTTGTTCGCCCCCTTCTTGTCTGCCAGATACTTGGGGCAGTTCCGCTTCCAGTGACCGTTCCCCTTGCAGTAG
AAACACTCAGTCTCTGGCTTGGGCCCAGCCTTGGGTTTCTTCACAGGATTAGCAACTGACTTGCCACCCTTCTTGGAGTTACCCTTCTTGCCCTTGCCATTTTTCTTGAAACTGGTGGTCTTATTGACCATCAACACTTGATGTTCTTTCTGTATGTCCGCCTCAGCAACTTTCAGCACCGCAAACACGTCGGCAATGGACTTATCCATCCCTTGCATGTTGTAATGCTGCACGAAGCTCTTGTA本發明還提供了上述分子標記引物在轉育小麥品系07鑒126中抗白粉病基因以及在小麥白粉病分子標記輔助育種中的用途。本發明的有益效果為利用本發明公開的2個分子標記引物(即分子標記引物對 Xcib9和分子標記引物對kil^)或其中任何一個，可方便地采用PCR擴增檢測，追蹤小麥品系07鑒126中抗白粉病基因。在小麥育種過程中，利用本發明公開的分子標記，可在苗期白粉病未發病前對小麥育種材料中的抗白粉病基因進行分子標記輔助選擇，提高育種效率，加速育種進程。


圖1是引物對)(Cib5(圖la)和引物對)(Cib9(圖lb)在親本材料及其F2代單株中的擴增結果。圖 Ia 中 M :tans II K plus ；圖 Ib 中 M :pBR322 DNA/MspI。泳道信息1 :07鑒126，2 川麥39 (四川高感白粉病品種)，3 12 :07鑒126與川麥39雜交F2單株。箭頭示特異擴增片段。R 抗病；S:感病。在該群體的168個F2單株中，該特異片段與抗病單株共分離。圖2是引物對)(Cib5(圖2a)和引物對)(Cib9(圖2b)在親本材料及其F2代單株中的擴增結果。圖 2a 中 M :tans II K plus ；圖 2b 中 M :pBR322DNA/MspI。泳道信息1 :07鑒126，2 川農19 (四川高感白粉病品種)，3 12 :07鑒126與川農19雜交F2單株。箭頭示特異擴展片段。R 抗病；S:感病。在該群體的234個F2單株中，特異片段與抗病單株共分離。圖3是引物對)(Cib5(圖3a)和引物對)(Cib9(圖3b)在親本材料及其F2代單株中的擴增結果。圖 3a 中 M :tans II K plus ；圖 3b 中 M :pBR322 DNA/MspI。泳道信息1 :07鑒126，2 :07鑒1 感(四川感白粉病品系，為07鑒1 感病近等基因系)，3 12 :07鑒1 與07鑒1 感雜交F2單株。箭頭示特異擴增片段。R 抗病； S 感病。在該群體的281個F2單株中，特異片段與抗病單株共分離。
具體實施例方式以下結合實施例詳細地說明本發明。實施方案為便于更好的理解本發明，但并不限定于本發明。下述實施方法中的實驗方法均為常規方法，所涉及實驗材料均為常規生化試齊LU實施例1 引物)(Cib9的實施例(1)采用CTAB法提取小麥基因組DNA，提取步驟1)取2g新鮮幼嫩葉片，液氮研磨成細粉后加預熱至65°C的2 X CTAB提取液 CTAB ； 1. 4M NaCl, 0. IM Tris-HCl, pH 8. 0,0. IM EDTA，pH 8.0) 15ml，混勻。》65°C水浴30-45min，其間輕搖混勻。冷卻至室溫后加等體積的氯仿異戊醇 (24 1)，輕輕混勻至上清液呈牛奶狀，4000rpm離心IOmin03)取上清液，加等體積異丙醇，置于冰浴沉淀DNA。4)勾出DNA，用70%酒精洗2次，無水乙醇洗一次氣干DNA，溶于適量pH 8. 0的 1 X TE溶液中。加入RNA酶至終濃度100 μ g/ μ 1。5) IOOV恒定電壓下，1 %瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，檢測DNA濃度及質量。(2) PCR 擴增反應體系如下DNA dNTPs
Xcib9上游引物F Xcib9下游引物R Taq plus聚合酶 IOxPCR緩沖液
Mg
2+
ddH.O
100-150 ng 100 μΜ 5 pmol 5 pmol IU 2.5 μ 1.5 mM 加至終體積25 μ
① 94。C4分鐘② 94。C30秒鐘③58 0C30秒鐘④ 72。C30秒鐘重復②-■> 30個循環⑤ 72°C10分鐘PCR 反應在 PTC-200 型 PCR 儀(MJ Research, U. S. A.)中進行。引物 Xcib9 擴增結果在10%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr Bis = 29 1)中電泳，然后銀染顯色。實施例2 引物)(Cib5的實施例(1)采用CTAB法提取小麥基因組DNA，提取步驟1)取2g新鮮幼嫩葉片，液氮研磨成細粉后加預熱至65°C的2 X CTAB提取液 CTAB ； 1. 4M NaCl, 0. IM Tris-HCl, pH 8. 0,0. IM EDTA，pH 8.0) 15ml，混勻。》65°C水浴30-45min，其間輕搖混勻。冷卻至室溫后加等體積的氯仿異戊醇 (24 1)，輕輕混勻至上清液呈牛奶狀，4000rpm離心IOmin03)取上清液，加等體積異丙醇，置于冰浴沉淀DNA。4)勾出DNA，用70%酒精洗2次，無水乙醇洗一次氣干DNA，溶于適量pH 8. 0的 1 X TE溶液中。加入RNA酶至終濃度100 μ g/ μ 1。5) IOOV恒定電壓下，1 %瓊脂糖凝膠電泳30分鐘，檢測DNA濃度及質量。(2) PCR 擴增
反應體系如下DNA100-150 ng
dNTPs
Xcib5上游引物F Xcib5下游引物R Taq plus聚合酶 IOxPCR緩沖液 Mg2+ ddH20
100 μΜ 5 pmol 5 pmol IU 2.5 μ 1.5 mM 加至終體積25 μ
① 94。C4分鐘② 94。C30秒鐘③58 0C30秒鐘④ 72。C30秒鐘復②—④30個循環⑤ 72°C10分鐘 PCR 反應在 PTC-200 型 PCR 儀(MJ Research, U. S. A.) 增產物在瓊脂糖凝膠上分離，100V恒定電壓電泳40分鐘后，
中進行。引物對)((3讓5擴 EB染色檢測。
權利要求
1.與小麥品系07鑒1 中抗白粉基因緊密連鎖的分子標記引物，其特征在于所述標記引物是分子標記引物對)(cib9和分子標記引物對)(Cib5中的至少一對，其中所述的分子標記引物對)(cib9的脫氧核糖核苷酸引物序列為 上游引物(F) 5' -GTCTGCTCCAACTTCCTCT-3‘； 下游引物(R) 5' -CAGTTCAGCATCATCAATCG-3‘； 所述的分子標記引物對)(cib5的脫氧核糖核苷酸引物序列為 上游引物(F) 5' -AGTCACTACAACGAGAGTTGG-3‘； 下游引物(R) 5' -TACAAGAGCTTCGTGCAGCAG-3‘。
2.根據權利要求1所述的與小麥品系07鑒126中抗白粉基因緊密連鎖的分子標記引物，其特征在于使用所述的分子標記引物對)Ccib9進行PCR擴增，在抗病小麥品系07鑒定 126中擴增出一條I^bp的特異片段；使用分子標記引物對)((3讓5進行PCR擴增，在小麥品系07鑒定126中擴增出一條3^bp的特異片段。
3.權利要求1或2所述的分子標記引物在轉育小麥品系07鑒126中抗白粉病基因以及在小麥白粉病分子標記輔助育種中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種小麥抗白粉病基因分子標記引物及其用途。本發明所提供的用于追蹤小麥品系07鑒126中抗白粉病基因的分子標記引物為分子標記引物對Xcib9和分子標記引物對Xcib5中的至少一對，其中使用所述的分子標記引物對Xcib9進行PCR擴增，在抗病小麥品系07鑒定126中擴增出一條145bp的特異片段；使用分子標記引物對Xcib5進行PCR擴增，在小麥品系07鑒定126中擴增出一條385bp的特異片段。利用本發明公開的2個分子標記引物或其中任何一個，可方便地采用PCR擴增檢測，追蹤小麥品系07鑒126中抗白粉病基因。在小麥育種過程中，利用本發明公開的分子標記，可在苗期白粉病未發病前對小麥育種材料中的抗白粉病基因進行分子標記輔助選擇，提高育種效率，加速育種進程。
文檔編號C12N15/11GK102533750SQ201210037308
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月20日 優先權日2012年2月20日
發明者余懋群, 余水洋, 潘志芬, 鄧光兵, 龍海 申請人:中國科學院成都生物研究所