專利名稱：利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學基因表達調控領域，更具體的涉及利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，它適用于山羊同一組織細胞在不同發育時期、不同生理條件下microRNA介導的靶基因的差異篩選，或者不同組織細胞在相同的發育時期microRNA介導的靶基因比較研究。
背景技術：
microRNA是大約18_24bp的小的非編碼RNA，它在轉錄后調控基因的表達。是1993年首次發現的一類在動植物中發揮重要作用的基因表達調控因子。它們通過依賴于microRNA和靶基因互補性的降解或者抑制翻譯的兩種不同機制負調控靶基因的表達水平。在大多數哺乳動物中，microRNA通過5’末端第2 8bp的序列互補配對祀基因mRNA,在翻譯水平負調控基因的表達，5’末端的這2 Sbp的序列稱為種子序列，它在各個物種中都是高度保守的，并且通過與靶mRNA完全互補配對介導基因的表達調控。許多研究表明正是microRNA 2 8bp種子序列的突變或者與之完全互補配對靶mRNA —個或者幾個堿基的突變導致mi croRNA功能缺失，進而弓I起生理狀態的改變。mi croRNA與靶基因組成復雜的調控網絡，一個microRNA可以與多個祀基因相互作用，多個microRNA也可能作用于同一個革巴基因，另外microRNA及其靶基因不同時期、不同生理條件、不同組織其表達量均存在差異。因此，如何準確定位、分析microRNA靶基因成為許多科學家關注的問題。靶基因挖掘方法主要有兩大類計算機預測和基于雜交的基因芯片。其中，計算機預測雖然快速、簡單，但這種主要基于microRNA種子序列與其靶基因之間堿基互補配對的最小自由能的計算機方法，由于短小序列的存在，容易出現假陽性，需要大量的實驗驗證，且以表達譜數據已知為背景；基因芯片是基于雜交策略的主流技術，自發明以來，它一直在基因表達譜技術中占據優勢地位。該技術利用過表達microRNA的樣本及其對照的mRNA池與固定在芯片上的數以萬計根據已知基因序列設計的探針雜交，以高通量的方式確定mRNA的種類和豐度，從而推測microRNA的靶基因。雖然該技術獲得了廣泛的應用，但是價格昂貴、需要大量的RNA，且存在數據處理過程噪音難以確定、探針與相似轉錄本間交叉雜交等問題。此外，由于要設計探針，它和計算機預測一樣需要參考基因組序列信息。因此，為了研究山羊組織或者器官的HiiCT0RNA靶基因的情況，也為其它物種提供一種研究與某個microRNA相關的靶基因的分子方法，我們在miRBase已有數據的基礎上，搜尋獲得microRNA種子序列互補配對的序列,利用真核生物mRNA帶有polyA尾巴的特點，在反轉錄酶作用下，加入帶有特殊接頭的反轉錄引物，合成第一鏈cDNA，然后，通過特異設計的兩步PCR反應，富集與microRNA相互作用的所有靶基因，將其特異性擴增獲得可以用常規凝膠檢測到的核苷酸序列，并輔以PAGE技術，定位、分析與某個特異microRNA序列相互作用的靶基因。、發明內容
本發明的目的是提供一種實驗性的、簡便快速的、高特異性的獲取哺乳動物組織或器官miCToRNA靶基因的分子方法。包括以下步驟I)特異反轉錄引物的設計所述反轉錄引物包括錨定堿基VN (N代表A、T、C或者G ；V代表堿基A、G或C)、12個T、寡核苷酸CTGA(3’到5’端)以及特殊接頭SEQ ID NO. 2。錨定堿基VN、12個T的寡聚核苷酸保證了 cDNA的從頭合成，SEQ ID NO. 2的引入有利于特異兩步PCR的設計。通過反轉錄引物將樣本所有mRNA反轉錄成帶有特殊接頭SEQ ID NO. 2的cDNA。2)特異兩步PCR反應所述特異兩步PCR反應的引物由根據miRBasel6. 0數據庫提供的與某個microRNA種子序列相互配對的核苷酸序列與特殊接頭SEQ ID NO. I的上游引物，和待擴增cDNA上帶有的特殊接頭SEQ ID NO. 2的下游引物組成。為保證特異性，這兩個特殊接頭序列SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 2在動物基因組中或轉錄組中是不存在的。其中為了獲得與某個microRNA相互作用的所有靶基因部份序列。第一步PCR過程中，我們利用哺乳動物microRNA 5’末端第2 8個堿基與其靶基因mRNA互補配對的特點，設計了特殊的上游引物，利用PCR反應過程中，低溫條件下，引物3’末端幾個堿基必然精確地與模板分子結合的原理，非特異性的富集了某個特異microRNA相互作用的靶基因，反應程序94°C預變性5分鐘；94°C，40秒，37°C，30秒，72°C，I分30秒，5個循環；第二步PCR過程中，依據上下游退火溫度的一致性，通過提高退火溫度特異性的擴增某個microRNA相互作用的靶基因片段，反應程序94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，32個循環；72°C，10分鐘。其中，山羊組織microRNA靶基因挖掘流程如附圖I所示(I)microRNA是長度為18 24bp的非編碼的小RNA，它參與包括細胞增殖、凋亡、分化等許多的生物學過程，在轉錄后調控靶基因的表達。哺乳動物中，其作用方式是5’端第2 8個堿基的種子序列通過與多個靶mRNA完全互補配對以抑制靶基因的翻譯。(2)真核生物的mRNA具有5’端帽子和3’端polyA尾巴的特點。利用這種特點，在反轉錄酶的作用下，加入特殊接頭SEQ ID NO. 2的反轉錄引物組合，就能合成帶有特殊接頭 SEQ ID NO. 2 的 cDNA。(3)沿著箭頭延伸的方向，以mRNA為模板、在反轉錄酶5’到3’聚合酶的活性作用下，從5’向3’合成mRNA與cDNA的雜合雙鏈。(4)合成的雜合雙鏈在反轉錄酶的RNaseH的作用下，降解雜合雙鏈的mRNA，合成比較穩定的第一鏈cDNA。(5)加入包含特殊接頭SEQ ID NO. I以及某個microRNA種子序列互補序列的引物組合，利用DNA聚合酶，退火溫度為低溫條件下，非特異性的合成與某個microRNA種子序列互補配對的全部的cDNA。(6)合成得到包含特殊接頭SEQ ID NO. I以及某個microRNA種子序列互補序列、特殊接頭SEQ ID NO. 2、12個堿基T以及錨定堿基NV，目的靶基因片段的特異DNA序列。(7)加入特殊接頭SEQ ID NO. I以及某個microRNA種子序列互補序列的上游引物組合，以及特殊接頭SEQ ID NO. 2的下游引物，利用DNA聚合酶的作用，在退火溫度為高溫的條件，特異的擴增目的靶基因片段。(8)通過多個PCR循環反應，合成得到可以通過常規手段檢測到的多個目的靶基因片段，用于后面的分離、克隆、測序。(9) PCR產物通過PAGE檢測和銀染顯色。3) PAGE凝膠及半定量分析PCR產物經過10% PAGE凝膠，120 140V電壓，7 8小時電泳后，銀(硝酸銀)染顯色，借助凝膠輔助分析工具(如genetool),半定量分析某個特異microRNA介導的革巴基因表達情況。每個泳道對應的條帶可被切下并加以回收，利用原引物條件重擴增，克隆測序供進一步分析，反應程序94°C，5分鐘；94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，32個循環；72°C，10分鐘。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分離擴增的靶基因，并利用凝膠輔助分析工具檢測片段的大小和表達豐度，利用microRNA與靶基因相互作用的特點，輔以PAGE和凝膠分析工具，可視化不同時期、不同生理狀態下基因水平表達差異，檢測各個泳道片段的大小和表達豐度，作為區分不同樣本的標志。山羊的基因組測序至今尚未完成，我們采用該方法對山羊組織樣本的microRNA靶基因進行了檢測，獲得了與某個microRNA種子序列相互作用的靶基因核苷酸序列。本發明提供一種利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于包括以下步驟(I)合成反轉錄引物；(2)合成包含不同接頭序列的上、下游PCR引物；(3)消化去除基因組污染，對樣品總RNA的提取；(4)采用步驟(I)的反轉錄引物將樣品RNA反轉錄獲得cDNA ；(5)采用步驟⑵上下游PCR引物，兩步PCR法獲得某一 microRNA的靶基因序列；(6) PCR產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其片段大小和表達豐度；(7)切取靶基因條帶，重擴增、回收、克隆、測序。其中，兩條接頭序列在山羊基因組中或轉錄組中不存在，在其中一個具體的實施方式中，接頭序列分別具有SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；在更加具體的實施方式中，接頭序列就是SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。在一個具體的實施方式中，步驟(I)所設計的反轉錄引物為接頭SEQ ID NO. 2,4個動態堿基、12個T以及錨定堿基N(N代表A、T、C或者G)V(V代表堿基A、G或C)的組合，具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。在一個具體的實施方式中，步驟(3)采用DNaseI消除基因組DNA污染。在一個具體的實施方式中，步驟(4)以純化的組織總RNA為模板，以SEQ ID NO. 3所示序列為反轉錄引物，在反轉錄酶作用下合成帶有SEQ ID NO. 3的cDNA ;反轉錄體系如下總 RNA 4iil，反轉錄酶 0. 5iil，反應緩沖液 2iil，SEQ ID NO. 30. 5 U I (50 u M),RNase-free ddH203 u I ;反應條件37°C, 15 分鐘；85°C，5 秒。在一個具體的實施方式中，步驟(5)特異兩步PCR上游引物的結構特征為接頭 SEQ ID NO. I與microRNA種子序列互補序列的組合,具有SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列；下游引物具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。在更加具體的實施方式中，步驟(5)PCR 擴增分兩步進行，第一步 PCR 反應體系cDNA I iil，SEQ ID NO. 43 u I(IOuM), masterMix(TaKaRa) 12. 5 u 1，ddH20 7. 5 u I ;反應條件94°C 預變性 5 分鐘；94°C,40 秒，37°C，30秒，72°C，1分30秒，5個循環；第二步PCR反應體系在第一步PCR產物中加入SEQ IDNO. 21 u KlOu M);反應條件94°C 預變性 5 分鐘；94°C，40 秒，60. 5°C，30 秒，72。。，I 分 30秒，32個循環。在一個具體的實施方式中，步驟(6)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分離擴增的靶基因，并利用凝膠輔助分析工具檢測片段的大小和表達豐度，利用microRNA與靶基因相互作用的特點，輔以PAGE和凝膠分析工具，可視化不同時期、不同生理狀態下基因水平表達差異，檢測各個泳道片段的大小和表達豐度，作為區分不同樣本的標志。在一個具體的實施方式中，步驟(7)切取的靶基因條帶重擴增的條件為94°C預變性5分鐘-MV, 40秒，60. 5 °C, 30秒，72。。，I分30秒，共計32個循環。 本發明與現有技術相比具有以下優點和效果I、適用范圍廣。本發明適用于基因組序列已知和未知的所有哺乳動物，適用于microRNA介導的已知轉錄本的檢測和未知轉錄本的發現；本方法發明適用于任何普通分子生物學實驗室采用。2、性價比高。本發明利用常規儀器和試劑去探索microRNA介導的基因表達情況，成本低廉，實驗結果理想。3、覆蓋率高，冗余少。本發明利用poly(T/A)置換法將其置換成人工接頭序列，確保了帶polyA尾mRNA 100%的覆蓋率。另一端(上游引物)種子序列互補序列加特殊接頭的組合，既保證了 microRNA作用的所有靶基因的獲取，又增加了特異性。以上概括的描述了本發明，可通過參照本文提供的某些具體實施例進一步理解本發明，需要指出的是，這些實施例僅是為了說明而不是限制本發明。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步的說明。圖I :山羊組織microRNA靶基因挖掘流程圖。圖2 :某生理狀態山羊皮膚樣品總RNA1. 0%瓊脂糖檢測結果圖。3代表第3種生理狀態，M 為 Marker DL2000。圖3 :某生理狀態山羊皮膚樣品mir-203靶基因擴增結果(a) I. 0%瓊脂糖檢測結果，3代表第3種生理狀態，M為marker DL2000 ； (b) 10% PAGE檢測結果，3代表第3種生理狀態，M 為 Marker DL1000。圖4 :第3種生理狀態山羊皮膚樣品mir-203靶基因重擴增結果。1、2、3、4、5表示從圖3(b)中切取大小為382bp、276bp、221bp、189bp、130bp片段重擴增結果，M為MarkerDLlOOO0圖5 :10種不同生理狀態總RNA1. 0%瓊脂糖檢測結果圖，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別代表不同生理狀態的總RNA，M為DL6000。.圖6 :10種不同生理狀態山羊皮膚樣品mir-203靶基因的表達圖譜(a)，I. 0%瓊脂糖檢測結果；(b)，10% PAGE檢測結果。Ml為DL2000 ；M2為DL1000。圖7 :切取的不同生理狀態10% PAGE膠mir-203靶基因條帶重擴增I. 0%瓊脂糖檢測結果。(a)，標注的A-B代表不同生理狀態的第幾條帶，例如1-1代表第I種生理狀態切取的第一條帶重擴增結果，M代表Marker ; (b), 345bp特異條帶重擴增1.0%瓊脂糖檢測結果。6、7、8、9、10分別代表不同生理狀態，N表示陰性對照，M為Marker DLlOOO0
具體實施例方式實施例I.山羊皮膚組織mir-203靶基因挖掘模式的建立I.試驗樣品試驗樣品來自內蒙古農業大學動物遺傳育種與繁殖自治區重點實驗室，采集了山羊肩胛部位第3種生理狀態的皮膚樣品。2.總RNA的提取、處理和檢測按Trizol法提取總RNA的方法提取總RNA。用無RNase的DNase-I處理總RNA，以去除其中痕量基因組DNA污染，通過普通瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性(圖2)，用核酸測定儀測定濃度。我們研究針對mir-203這一具體microRNA所針對的祀基因的情況,設計并合成了包括錨定堿基VN (N代表A、T、C或者G ；V代表堿基A、G或C)、12個T、寡核苷酸CTGA (3’到5’端)以及特殊接頭(SEQ ID NO. 2)的反轉錄引物(SEQ ID NO. 3)，并按照《分子克隆實驗指南》提供的反轉錄方案，在特異反轉錄引物(SEQ ID NO. 3)存在的條件下制備cDNA，-80°C保存備用。3. PCR 擴增3. I 第一步 PCR以步驟2第3種生理狀態制備的cDNA為模板，加入由特殊接頭SEQ ID NO. I以及與mir-203種子序列互補序列組成的上游引物SEQ ID NO. 4，富集所有與mir-203相互作用的靶基因。PCR 反應體系為 25 ill，包括 master Mix (TaKaRa) 12. 5 ，上游引物 SEQ IDNO. 43 u KlOu M)，模板 I u 1，ddH20 7. 5 u I0反應程序94V預變性5分鐘-MV, 40秒，37°C，30秒，72°C，I分30秒，5個循環；3. 2 第二步 PCR在第一步PCR產物中加入包含特殊接頭的下游引物SEQ ID NO. 21 U l(10u M)，特異性的擴增mir-203的靶基因。反應條件94V預變性5分鐘-MV, 40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，32個循環。72°C，10分鐘。I %瓊脂糖凝膠、10 % PAGE檢測表明，mRNA為模板獲得了完全不同于DNA模板的結果，DNA模板幾乎得不到擴增結果，mRNA模板得到了清晰的多條結果(圖3)，這在驗證了 microRNA與其靶基因存在一對多的作用方式的同時，也說明了特殊的兩步PCR設計的合理性。4. PAGE膠回收、重擴增、克隆測序切取步驟3PAGE膠中各清晰的條帶，100°C煮沸10分鐘，取5iU上清按如下PCR
反應重擴增。PCR 反應體系為 25 iil，包括 master Mix(TaKaRa) 12. 5 yl，上下游引物各 I yl，PAGE膠回收產物上清液5 iil，ddH205. 5 ill。反應程序94V預變性5分鐘-MV, 40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分鐘30秒，32個循環。72 °C，10分鐘。1%瓊脂糖檢測結果如圖4所示，獲得了 120 750bp大小不同的6條帶，膠回收、克隆測序，所測序列見序列表SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 12，分別對應圖3 (a)中大小為75化？、382& 、276& 、22化？、18% 、13(^ 的條帶。每條序列都包含我們設計的上下游引物，進一步說明了我們方法設計的合理性。 實施例2.山羊皮膚樣品中不同時期mir-203靶基因的檢測分析利用實施例I建立的方法，借助genetool PAGE膠條帶判型工具，我們比較分析了山羊10種不同生理狀態山羊皮膚樣品(圖5)mir-203靶基因的表達圖譜(圖6)。結果表明，對于PAGE凝膠，在700bp-50bp范圍內，不同生理狀態mir-203靶基因表達數目存在差異，10種不同生理狀態條帶數目分別為12、14、11、12、11、12、12、13、13、14。不同生理狀態之間既有共同表達的條帶，也有差異表達的條帶；以每種生理狀態下共表達的200bp左右的量為參考標準，利用genetool半定量了各個條帶相對于參考標準的相對表達量(表I)，不同生理狀態同一條帶表達量也存在差異。表110種不同生理狀態皮膚樣品mir-203靶基因的相對表達量
不同生理狀態相對表達量 條帶范圍____
(bp)1 2 3 4 5 6 7 8910
698o. 250.21 0.24 0.20 0. 190.05
6870.29
6300.08 0. 130.10
6060.28
5800.08 0.110.08 0.050.130.14
4950.07 0.060.05
453o. 20 0.220.36 0.46 0.39 0.37 0.270.050. 16
4230.03 0.070.14 0.120. 100.063850.26 0.350.24 0.23 0.24 0. 17 0.26 0.320.280.41 3490.060.090. 130. 12 293o. 190.22
2840. 14 0. 180.23 0.35 0.19 0.34 0.28 0.230.240.41
2630. 14 0.110. 14 0.22 0.31 0.13 0. 11 0.160.190.14
2250.21 0.140.26 0.27 0.27 0.30 0.21 0.250.240.25
20000 1.00I. 00 1.00 L 00 I. 00 1.00 I. 00I. 00L 00
1650.04 0. 13
1240. 15 0.360.19 0.23 0. 19 0.36 0.31 0.390.400.38
1160. 11 0.170. 16 0.17 0.22 0.27 0.10 0.230.330.24
1000.06 0. 110.08 0.04 0.14 0. 16 0.05 0. 170.160.19切取不同生理狀態下mir-203靶基因條帶，按實施實例I步驟4所述重擴增、克隆測序。重擴增部份結果I %瓊脂糖檢測如圖7所示，其片段大小主要集中在120 400bp左右；測序結果顯示序列與序列表中SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 12—致。大小分別為382bp (表I 為 385bp)、345bp (表 I 為 349bp)、276bp (表 I 為 284bp)、269bp (表 I 為 263bp)、221bp (表I 為 225bp)、189bp (表 I 為 200bp)、130bp (表 I 為 124bp)。其中 382bp、276bp、269bp、221bp、189bp、130bp為各種生理狀態共有的條帶，分別對應圖7 (a)的A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A_6，八表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種生理狀態；345bp為6、8、9、10種生理狀態皮膚樣品特有的條帶(圖7(b))，這與表I結果一致。說明了本方法的穩定性和特異性
權利要求
1.利用種子序列檢測山羊組織或器官中micix)RNA靶基因的分子方法，其特征在于包括以下步驟 (1)合成反轉錄引物； (2)合成包含不同接頭序列的上、下游PCR引物； (3)消化去除基因組污染，對樣品總RNA的提取； (4)采用步驟(I)的反轉錄引物將樣品RNA反轉錄獲得cDNA； (5)采用步驟(2)上下游PCR引物，兩步PCR法獲得某一microRNA的靶基因序列； (6)PCR產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其片段大小和表達豐度； (7)切取靶基因條帶，重擴增、回收、克隆、測序。
2.根據權利要求I所述利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于涉及到的兩條接頭序列在山羊基因組中或轉錄組中不存在，分別具有SEQIDN0. I和SEQID NO. 2所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求I所述利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(I)所設計的反轉錄引物具有SEQID NO. 3所示的核苷酸序列，為接頭SEQ ID NO. 2下游緊接4個動態堿基下游緊鏈接12個T以及錨定堿基NV的組合，其中，N代表A、T、C或者G ；V代表堿基A、G或C。
4.根據權利要求I所述利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(3)中采用DNaseI消除基因組DNA污染。
5.根據權利要求I所述利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(4)以純化的組織總RNA為模板，以SEQID NO. 3所示序列為反轉錄引物，在反轉錄酶作用合成帶有SEQ ID NO. 3的cDNA。
6.根據權利要求5所述反轉錄反應,其特征在于反轉錄體系如下總RNA4 u I,反轉錄SI 0. 5 u 1，反應緩沖液 2u I, SEQID NO. 30. 5 U I (50 u M)，RNase-free ddH20 3 u I ;反應條件37°C，15 分鐘，85°C，5 秒。
7.根據權利要求I所述利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(5)特異兩步PCR上游引物具有SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，結構特征為接頭SEQID NO. I與microRNA種子序列互補序列的組合；下游引物具有SEQ IDNO. 2所示的核苷酸序列。
8.根據權利要求I所述利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于特殊兩步PCR法上游引物為SEQ ID NO. 4 ;下游引物為SEQID NO. 2。
9.根據權利要求I所述利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(5) PCR擴增分兩步進行，第一步PCR反應體系cDNA lul, SEQ IDNO. 43 u I (IOuM), master Mix(TaKaRa) 12. 5u I, ddH20 7. 5 u I ;反應條件:94°C 預變性 5分鐘；94°C，40秒，37°C，30秒，72°C，I分30秒，5個循環；第二步PCR反應體系在第一步PCR產物中加入SEQ ID NO. 21 u I(IOuM);反應條件94°C預變性5分鐘；94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72。。，I分30秒S，32個循環。
10.根據權利要求I所述利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(6)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分離擴增的靶基因，并利用凝膠輔助分析工具檢測片段的大小和表達豐度，利用microRNA與靶基因相互作用的特點，輔以PAGE和凝膠分析工具，可視化不同時期、不同生理狀態下基因水平表達差異，檢測各個泳道片段的大小和表達豐度，作為區分不同樣本的標志。
11.根據權利要求I所述利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(7)切取的靶基因條帶重擴增的條件為94°C預變性5分鐘；94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，共計32個循環。然后通過克隆、測序獲得靶基因核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及一種利用種子序列檢測山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法。具體而言，提供了種子序列介導的可控遺傳操作，用于在基因表達檢測中篩選與特定microRNA相關的靶基因。在設定上游種子序列的互補序列和下游錨定序列的基礎上添加特殊接頭，通過反轉錄和特殊二步PCR將microRNA的靶基因擴增；擴增后的microRNA靶基因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中檢測其片段大小和表達豐度，用于篩選在不同生理狀態或實驗條件下特異表達的基因；特定的靶基因序列通過DNA回收和測序方法得到。此法可用于評估microRNA調節的基因或遺傳途徑，也可用表達譜來評估基因表達特征，在系統生物學研究中具有重要價值。
文檔編號C12Q1/68GK102643898SQ20121003835
公開日2012年8月22日 申請日期2012年2月13日 優先權日2012年2月13日
發明者付紹印, 張文廣, 李金泉, 趙德超 申請人:內蒙古農業大學