專利名稱：一種小菜蛾抗菌肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種新的抗菌肽，本發明還涉及所述抗菌肽的制備方法和應用。此外，本發明還涉及表達小菜蛾抗菌肽的基因工程菌。
背景技術：
長期以來，無論人類還是動植物的細菌性疾病的防治都是難以徹底解決的難題。 自上世紀30年代發現青霉素后，各種天然、合成、半合成的抗生素被廣泛應用于抵抗各種微生物的感染。然而大量使用抗生素又帶來了一系列新問題，其中最主要的一點是耐藥性菌株的產生。細菌對抗菌藥物的耐藥，使得曾一度廣泛使用、療效佳的藥物在臨床治療中失去抗菌活性。畜牧業生產中大量耐藥性菌株的產生，造成抗感染治療難度增加、治療周期延長、新藥的使用周期變短；此外多重耐藥菌株的增加和擴散，還給人類疾病的防治乃至環境帶來了威脅。細菌耐藥性的問題推動了人們探求新型抗菌藥物的決心。隨著人類對脊椎動物免疫反應的認識，抗菌肽逐漸走入人們的視野，近年來更成為藥物研究方面的重點。昆蟲是世界上較大的生物種群，據估計其種類多于106種，除海洋外，其他生態環境都有昆蟲的分布。但昆蟲并不具有高等生物類似的免疫體系，即昆蟲缺乏B和T淋巴細胞系統，也無免疫球蛋白及補體存在.然而昆蟲能在自然界占據極大的物種優勢，說明其具有獨特的免疫能力及防御系統。在這一體系中起著重要作用的就是抗菌肽。抗菌肽(antimicrobial peptides)是在誘導條件下，昆蟲產生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性多肽類物質的總稱，具有“傳統抗生素”無法比擬的優越性不會誘導抗藥菌株的產生，有希望成為新一代抗囷劑。1975 年瑞典科學家 G. Boman 等人(Steinerhd et al. Nature, 1981，292:246-248) 從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導分離得到一種殺菌肽，并將其命名為 cecropin。此后，許多抗菌肽相繼被分離、純化。一些抗菌肽的氨基酸一級結構和基因序列得到確定。80年代，有關抗菌肽的研究主要集中在大型的經濟昆蟲。90年代以來，在繼續對大型經濟昆蟲進行研究的同時，又擴展到一些小型昆蟲和其它無脊椎及脊椎動物， 抗菌肽已成為免疫學和分子生物學研究的熱點，其中昆蟲抗菌肽基因工程研究最受重視。 目前已發現抗菌肽或類似抗菌肽的小分子肽類廣泛存在于生物界，包括細菌、動植物和人類。這種內源性的抗菌肽經誘導而合成，在機體抵抗病原的入侵方面起著重要的作用，更被認為是缺乏特異性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽具有廣譜殺菌作用，大多數對革蘭氏陽性菌有較強的殺滅作用，有些則對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均起作用。對某些真菌、原生動物，尤其對耐藥性細菌有殺滅作用，并能選擇殺傷腫瘤細胞，抑制乙型肝炎病毒的復制。并且大多數抗菌肽的抑菌機制不同于抗生素，不是通過作用于細菌某些特定位點來阻斷其生物大分子的合成，因此不易受細菌耐藥性產生機制的影響。同時抗菌肽符合抗感染藥物抗菌譜廣、作用明顯，不良反應小等優點，所以將抗菌肽作為新的抗菌藥物來開發，前景相當廣闊。
昆蟲抗菌肽多為30—45個氨基酸殘基組成，分子量小，4kD左右，沒有免疫原性， 通常等電點在10左右，耐熱，不易被胰蛋白酶、胃蛋白酶水解。根據抗菌肽氨基酸組成和結構特征，可以將昆蟲抗菌肽分為以下幾類
(I)具有兩親α -螺旋結構的抗菌肽此類抗菌肽分子不含半胱氨酸，不形成二硫鍵， 有兩親性α-螺旋結構，屬于陽離子型抗菌肽，在昆蟲抗菌肽中發現較早、數量較多。如 Cecropins，最初發現于惜古比天蠶體內，目前已經從鱗翅目和雙翅目昆蟲中分離出20多種cecropin類似物。其共有的特點是通常由30-40個氨基酸殘基組成，在肽鏈的兩端都形成α-螺旋結構，N端通常呈堿性，帶正電荷，親水；C端通常為酰胺化。中性，不帶電荷或帶少量負電荷，疏水。此類抗菌肽的抗菌譜廣泛，對細菌、真菌及病毒的感染甚至癌細胞都有作用，通過在細胞膜上形成電勢依賴通道(voltage-dependent channel),改變細胞膜的通透性，使細胞內容物泄漏而殺菌。(2)分子內含有二硫鍵的抗菌肽這類抗菌肽的分子中也形成兩親α-螺旋結構，但由于含有半胱氮酸殘基，所以分子內還形成二硫鍵。如Insect defensins,首先從肉蠅(Phormia terranovae)中分離得到，與哺乳動物防御素高度同源。除雙翅目昆蟲外，在半翅目、鞘翅目、膜翅目、毛翅目和蜻蜒目中均發現了此類昆蟲防御素。(3)富含 Pro 或 Arg 的抗菌妝(Proline—rich or arginine-rich peptides) 這類抗菌肽一般含有12 — 35個氨基酸殘基，又可分為兩類一類為不含取代基結構，如來自于蜜蜂的apidaecin等；另一類含糖基化位點結構,如來自于果蠅的Drosocin有一個與 Thr殘基相連的N-乙酰半乳糖胺-半乳糖結構，而Pyrrhocoricin則在相應位置上連有 N-乙酰半乳糖胺。一旦去除分子中的糖基。抗菌活性也隨之消失.這類抗菌肽多數只對革蘭氏陰性菌有效。(4)富含Gly的抗菌肽此類抗菌肽分子量相對較大些，如Attacins(20kD)、 Sarcotoxins (30kD)、Diptericins (9kD)等.后兩者還有以下共同特點C端富含甘氨酸,而 N端脯氨酸則較多，對部分革蘭氏陰性菌有效。20多年來，人們對抗菌肽已進行了比較系統的理論和應用研究，其作用及機理如下
抗菌肽的抗菌作用及其機理抗菌肽分子可以在細菌細胞質膜上穿孔而形成離子孔道，造成細菌細胞膜結構破壞，引起胞內水溶性物質大量滲出，而最終導致細菌死亡。抗菌肽分子首先結合在質膜上，接著其分子中的疏水段和兩親性α-螺旋也插入到質膜中， 最終通過膜內分子間的相互位移，抗菌肽分子聚集形成離子性通道，使細菌失去膜勢而死亡。但是 Gazit 等(Gazit E et al. Biochem is try, 1994，33 (35) : 10681-10692)得出的實驗結果表明，抗菌肽只是結合到了單位膜的表面上，并未插入膜中，更未形成通道。 然而，抗菌肽的作用靶部位是細菌細胞質膜，以及抗菌肽的作用結果是導致細菌細胞質膜通透性增大等基本內容是確切無疑的，這也正是抗菌肽與青霉素等傳統抗生素對細菌作用機制不同的本質所在。抗菌肽的抗病毒作用及其機理研究發現煙芽夜蛾幼蝦
的血淋巴對6種DNA、RNA病毒有明顯的抑制作用，使病毒感染力迅速降低，而且這種抗病毒活性具有廣譜性° Mariam (Mariam E et al. International J of Antimicrobial Agents, 1999, 13:57-60)試驗表明來源于爪蟾的抗菌肽Magainins及其它Magainins類抗菌肽具有抗皰疹病毒-HSV的作用，還發現人的嗜中性粒細胞防御素(HNP-I)對一種皰疹病毒有抑制作用。此外，蜂毒素和天蠶素也可以在亞毒性濃度下抑制艾滋病毒HIV-I的基因表達，從而抑制減少HIV-I的增殖。這表明抗菌肽對于當今人類的頑癥——艾滋病也有抑制作用。 抗菌肽的抗寄生蟲作用及其機理抗菌肽可以有效地殺滅產生人類及動物寄生蟲病的寄生蟲，如瘧疾、Chagas氏病、萊什曼病等。目前發現一種合成的天蠶素-蜂毒素雜合體對萊什曼原鞭毛蟲有損傷作用，起作用的靶目標是細胞質膜，它可以快速降低 H- OH+的通透性，破壞膜電勢，質膜形態也受到損壞。Shahabuddin(Shahabuddin M et al. Experimental Parasitogy, 1998, 89 (I) : 103-112)研究發現昆蟲抗菌肽對感染蚊子的瘧原蟲發育的不同時期有不同的作用，主要對瘧原蟲的卵囊期和子孢子期造成明顯的損傷。 抗菌肽對腫瘤細胞作用及其機理國內外已對抗菌肽殺傷腫瘤細胞的作用進行了廣泛研究，發現抗菌肽對體外培養的癌細胞的作用主要是使癌細胞膜上形成孔洞，內容物外泄，線粒體出現空泡化，嵴脫落。核膜界限模糊不清，有的核膜破損，核染色體DNA斷裂，并抑制染色體DNA的合成，細胞骨架也受到一定程度的損傷(王芳等.生物化學與生物物理進展，1998，25 (I) : 64-67;賈紅武等·蠶業科學，1996，22 (4) : 62)。通過對荷瘤小鼠的研究證明，抗菌肽能顯著抑制ECA腹水瘤荷瘤小鼠腹水的積累；對S180肉瘤和M14宮頸癌的抑瘤率亦達30%-50%(許玉澄等·動物學研究，1998，19(4) :263-268)。抗菌肽還可以調動機體的免疫機能，從體液免疫方面來抵抗癌瘤的入侵。抗菌肽和干擾素、補體一樣是機體非特異性天然防御系統的重要組成部分。機體受損傷或病原微生物入侵時，能迅速產生抗菌肽來殺傷入侵者，它對正常真核細胞幾乎沒有作用，而且許多抗菌肽在100°c加熱IOmin條件下仍能保持一定活力，且對較大的離子強度和較低或較高的P H都有較強的抗性。另外，因為抗菌肽的合成速度非常快(假定核糖體上肽鍵合成速率不變，抗菌肽的產生比I gM要快100多倍)，而且小肽的擴散比大的蛋白質和免疫細胞更加迅速，作用更顯靈活，所以Boman曾指出，抗菌肽是機體的一種理想的一線防御物。與普通抗生素相比，抗菌肽的“抗菌譜”更廣，除了抗細菌外， 有的抗菌肽還能作用于真菌、原蟲、有包膜的病毒及癌細胞(對癌細胞的選擇性作用可能與其細胞骨架的改變有關)，同時能加速免疫和傷口愈合過程。這預示抗菌肽在治療及預防癌癥和抗病毒、抗感染等方面具有良好的應用前景。更為重要的是，由于抗生素的濫用導致菌株產生了抗性，人們需要尋找新的抗菌藥劑。抗菌肽這種從生物體中獲得的物質恰巧具有獨特的抗菌機理，不是像一般的抗生素那樣通過阻斷生物大分子的生物合成來發揮作用，因而極有希望開發成為一類新型的廣譜高效抗菌藥物。 抗菌肽的天然產量低，合成或從機體中提取步驟復雜、產率低、價格相當昂貴，利用基因工程技術生產抗菌肽具有重要意義。抗菌肽所攜帶的堿性氨基酸使其對蛋白酶非常敏感，必須采用融合表達策略以抵消其堿性并降低其對宿主細胞的毒性。謝維等合成了家蠶抗菌肽CMIV基因，并將其克隆到金黃色葡萄球菌A蛋白和IgG親合的結構域ZZ的融合表達載體中，得到Pezz318-CMIVV質粒，以此質粒轉化E. coliHBlOl,得到ZZ-CMIV融合表達的蛋白，用 CNBr切割后，得到CMIV肽。李秀蘭等(李秀蘭等.中國生物化學與分子生物學報，1999， 15 (3) : 387-391)對天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了 50%的改動，根據E. coli偏愛的密碼子人工合成了肽基因片斷，重組到測序載體，再將此片斷重組到表達載體Pet-28上進行表達，融合蛋白經CNBr裂解后，具有與天然抗菌肽相同的生物活性。吳映雅等將柞蠶抗菌肽D基因連接在牛成纖維細胞生長因子cDNA的上游，在酵母中成功地得到了表達，表達產物具有抗菌活性和牛成纖維細胞生長因子的抗原性。Kevin等(Kevin L P, Melissa H B , Rober E ff. Gene. 1993, 134:7-13)將 HNP(human neutro philpeptide I)和 CEME (synthet iccecropin/meIittinhybrid)分別與GST (glutathione-S-trans ferase)、 ORRF> IgG 結合序列及 SPA (staphylococcal protein A)在 E. coli 或 S. aureus 中融合表達，結果在S. aureus中雖實現了與SPA的融合分泌表達,但表達產量較低；Zhang (Zhang L et al. Biochem Biophys. Res. Commun. 1998，247:674-680)選擇RepA蛋白的序列作為抗菌肽的融合表達伴侶，并插入Histag等序列作為純化親和位點，實現了在E. coli中的融合表達。Christsnen B等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一個供體抗菌肽的活性都高。然而，由于抗菌肽分子小，分離提純存在一定的困難，故天然資源有限。化學合成和基因工程法獲得抗菌肽是主要手段，但化學合成抗菌肽成本高，而通過基因工程在微生物中直接表達抗菌肽基因，則可能對宿主有害而不能獲取表達產物。作為一種新的潛在的抗菌藥物，隨著抗菌肽在抗革蘭氏陰性和陽性菌活性方面的研究的深入，抗菌肽正引起越來越多的關注，然而，缺乏低成本的有效的大規模生產抗菌肽的方法，正成為制約抗菌肽作為藥物應用的瓶頸。正因為如此，許多生物表達系統被逐步建立以生產抗菌肽，比如原核生物大腸桿菌表達系統，以及真核的酵母表達系統。盡管如此， 在這些表達系統中，仍然要面臨許多問題抗菌肽經常是以融合蛋白的形式在原核宿主中進行表達，以消除天然抗菌肽對宿主自身的毒性。由于抗菌肽結構與功能的緊密聯系，作為融合伴侶的部分(常常是含有各種酶切位點的親和標簽)，需要在融合蛋白表達純化后經過酶或者化學因子的切割，來釋放出真正有抗菌活性的具天然結構的抗菌肽。可是，融合蛋白純化后進行酶切(或者化學因子切割)，再經過純化，得到有活性的抗菌肽的過程是一個費時且成本高的過程。而酵母表達體系中，抗菌肽的表達周期長、目的蛋白的產量低，大規模生產的成本高，都是該系統的缺點。因此，現在急需建立一種新的抗菌肽的表達方法，來滿足目前對抗菌肽研究乃至商業化的需要。

發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種來自于小菜蛾的cecropin家族的抗菌肽 pxCECAl以及編碼該抗菌肽的基因。本發明的第二個目的在于提供上述抗菌肽的用途。本發明的第三個目的在于提供制備上述抗菌肽的方法。本發明的第四個目的在于提供表達上述抗菌肽的基因工程菌。為實現上述目的，本發明的技術方案如下
一種小菜蛾抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 7 (其成熟肽序列)所示。本發明抗菌肽具有對不同細菌的抑菌和殺菌活性，并且其對某些抗生素抗性菌的抗菌活性，為取代傳統的化學抗生素類藥物，開發出具有新靶點抗菌譜廣且不易誘導產生抗藥性的多肽類抗生素提供了研究基礎。進而，本發明提供所述抗菌肽在制備抗菌藥物、抗病毒藥物或抗腫瘤藥物中的用途。所述細菌包括但不限于例如金黃色葡萄球菌atfreiAs)、綠膿桿菌 iPseudomonas aerwgifliosa )、短小芽抱桿菌{Bacillus 應i/iAs)、枯草芽抱桿菌{Bacillus
6subtilis)等等，以及耐藥性細菌，如甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌。本發明還提供包括所述抗菌肽的藥物，包括上述抗菌藥物、抗病毒藥物及抗腫瘤藥物。本發明還提供編碼上述抗菌肽的基因，其可以是SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。本發明進一步提供含有上述基因的載體，例如表達載體，其出發載體來自pTWINl ； 含有所述載體的宿主細胞，例如大腸桿菌BL21 (DE3)。本發明還提供了一種制備上述蛋白的方法，本發明方法是將純化標簽(標簽蛋白)、內含肽以及上述抗菌肽融合表達。純化標簽通過內含肽與抗菌肽連接，從而在有效純化的基礎上，通過內含肽的自切作用，得到不含標簽的抗菌肽。優選構建 CBD-intein-pxCECAl 融合蛋白。具體地，本發明將pxCECAl插入到質粒pTWINl中得到重組表達載體pTWINl-pxCECAl，并將其轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，經篩選得到基因工程菌株 pTWINl-pxCECAl-BL21(DE3)，該基因工程菌已于2012年2月13日，保藏于中國典型培養物保藏中心(地址中國湖北省武漢市武漢大學)，分類命名為大腸埃希氏菌{Escherichia co7i)BL21 (DE3)-pTWINl-pxCECAl FompT hsdSB(rBmg) gal dcm (DE3)保藏號為CCTCC NO: 2012013。利用該基因工程菌株E. coli BL21(DE3) (pTWIN- pxCECAl)，可表達基因工程重組小菜蛾抗菌肽融合蛋白CBD-intein-pxCECAl。該基因工程菌對融合蛋白的表達量高，表達穩定，利于產業化生產。本發明還提供所述抗菌肽的基因工程制備方法，包括下列步驟克隆編碼上述抗菌肽的基因，將該基因插入pTWINl質粒,轉化大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3),篩選陽性克隆，經IPTG誘導表達得到融合蛋白CBD-intein-pxCECAl，經其自切得到所述的抗菌肽。具體地，可以利用上述基因工程菌來制備所述小菜蛾抗菌肽pxCECAl，包括下列步驟
A.基因工程菌株的發酵及上清制備將所述大腸桿菌接種2X YT培養基中，經O. ImM IPTG在15°C下誘導過夜；發酵菌液離心得到菌體后，超聲波破碎菌體，離心后得到細胞粗提物上清；
B.融合蛋白的掛柱分離以及柱上自切將破碎得到的上清，緩慢通過裝有幾丁質珠的純化柱，以10倍柱體積的結合緩沖液洗填料；之后將柱內緩沖液pH值調至6. O,放置4°C 36小時；
C.目的蛋白小菜蛾抗菌肽pxCECAl的洗脫收集以及純化濃縮用洗脫緩沖液緩緩洗脫幾丁質柱，收集洗脫液；以30KD的超濾管超濾，取超濾后的穿漏液，再以IOKD的超濾管濃縮即得。上述方法簡單易操作，省時并能有效降低生產成本。并首次利用了 MPACT-TWIN 系統來表達純化抗菌肽，該系統的優點在于利用可誘導的具有自切割活性的蛋白質——內含肽，來分離純化目的蛋白，省去了費時費錢的酶切過程，而且達到了切割和純化同步完成的效果，省時省力，純化后的目的蛋白pxCECAl經鑒定能達到很高的純度，同時也顯示了 pxCECAl對革蘭氏陰性菌和陽性菌的較高的抗菌活性。本發明小菜蛾抗菌肽pxCECAl基因的克隆方法步驟如下
I.小菜蛾幼蟲用人造飼料養至五齡，將大腸桿菌E. coli JM109培養至對數生長期，用針蘸大腸桿菌菌液后刺小菜蛾幼蟲腹部，24小時之后，按照RNA提取試劑盒的方法提取其蟲體的總RNA后，通過RT-PCR得到總cDNA。根據GenBank上已經發表的小菜蛾抗菌肽 cecropin家族的同源序列，設計并合成引物，以上述得到的總cDNA為模板，PCR擴增得到 pxCECAl基因，PCR產物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產物并將其克隆到PCR2. I載體中，挑取單克隆用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序。2.根據信號肽分析軟件的分析，以及參考關于cecropin家族抗菌肽翻譯后修飾的文獻，去掉信號肽部分以及蛋白質N端的丙氨酸和脯氨酸，重新設計引物，以上述 PCR2. I-pxCECAl為模板，PCR擴增編碼成熟肽的pxCECAl基因。將PCR產物組裝入pGEM_T 載體，轉化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法小量提取質粒進行酶切鑒定，并進行測序。得到的陽性克隆子即為包含pxCECAl的大腸桿菌，用于基因的增殖和保藏。本發明表達基因工程融合蛋白CBD-intein-pxCECAl的大腸桿菌基因工程菌株的構建及誘導表達的具體方法如下
I.融合基因的制備及表達載體的構建
設計引物，兩端分別加上PStl以及sapl的酶切位點，以pGEM-T-pxCECAl重組質粒為模板，對pxCECAl進行擴增，擴增后的目的片段回收后，與載體pTWINl —起用以上兩種限制性內切酶進行酶切，酶切產物回收后用T4連接酶連接。連接產物轉化大腸桿菌JM109并送測序鑒定，得到含有重組質粒pTWINl-pxCECAl的大腸桿菌克隆。2.大腸桿菌基因工程菌的制備
將質粒pTWINl-pxCECAl轉化到感受態BL21 (DE3)中，PCR鑒定篩選出陽性轉化子，所得陽性克隆即為本發明涉及的能夠表達融合蛋白CBD-intein-pxCECAl的基因工程菌株。3.基因工程融合蛋白的表達
將重組表達質粒pTWINl-pxCECAl的單菌落接種到LB (含100 μ g/mL氨芐青霉素)培養基中，37 °C培養至A9600為O. 6，37 °C過夜，第2天活化菌液以4%接種到新鮮的LB (含 100 μ g/mL氨芐青霉素)培養基中，37 °C培養至A9600為O. 6時(約3小時)加入終濃度為 O. lmmol/L IPTG，15°C誘導過夜后，離心 4000rpm，4°C，25min 收集菌體，用 Buffer BI (20 mM HEPES, pH 8.5，500 mM NaCl, and I mM EDTA)重懸超聲波破碎，離心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達。以優化后的條件擴大培養，超聲波破碎后， 離心收集上清。本發明小菜蛾抗菌肽pxCECAl的分離純化具體方法如下
發酵破碎后的上清，以每分鐘O. 5-1. O ml的流速穿過裝有IOml床體積幾丁質珠的柱子，柱子預先以BI平衡。重復一次上柱，以使融合蛋白充分與幾丁質珠結合。用300ml的BI 洗柱子，以去除未結合的雜蛋白，之后用Buffer B2(20 mM HEPES, pH 6.0，500 mM NaCl, and I mM EDTA)平衡柱子，并將柱內填料及融合蛋白浸于B2中，將柱子置于4°C兩天。兩天后，用B2將柱子內釋放的目的蛋白洗脫，并用YM-10及YM-30的超濾管對洗脫的目的蛋白進行純化以及濃縮除鹽。純化后的目的蛋白利用Triicine-SDS法檢測表達量及蛋白純度，用MALDI-T0F-MS檢測目的蛋白pxCECAl的分子量。在本發明的一個實施例中提供了幾種小菜蛾抗菌肽pxCECAl活性鑒定的方法，證明本發明所涉及的小菜蛾抗菌肽pxCECAl能有效的抑制和殺滅受測的幾種革蘭氏陽性菌和陰性菌，而且對某些抗生素抗性菌也有很好的抑殺效果。同時該實施例中還證實了，小菜蛾抗菌肽pxCECAl作用于細菌的細胞膜，造成細菌細胞內溶物外泄而導致細菌死亡的作用機制。本發明通過RT-PCR等方法，得到了一種之前未報導過的小菜蛾抗菌肽基因 pxCECAl，在經過序列比對及分析后，得到有活性的成熟肽序列，并通過表達純化，測定了該抗菌肽對不同細菌的抑菌和殺菌活性，更證實了其對某些抗生素抗性菌的抗菌活性，為取代傳統的化學抗生素類藥物，開發出具有新靶點抗菌譜廣且不易誘導產生抗藥性的多肽類抗生素提供了研究基礎。本發明還利用內含肽在適當PH和溫度下自切的特性，構建了表達載體pTWINl-pxCECAl和基因工程菌株pTWINl_pxCECAl_BL21 (DE3)。這一表達系統的優勢在于，表達量大，表達后的分離純化簡單，不需要額外的酶切步驟來處理純化后的融合蛋白，只用在特定PH和溫度下誘導融合蛋白的自切，是的分離純化與目的蛋白的釋放合二為一，省去了大量金錢和時間上的投入，為今后抗菌肽在研究或者商業領域的大量生產提供了一種新穎而簡便的方法。與現有技術相比，本發明的優點和有益效果在于本發明抗菌肽對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有不同程度的抑制作用，而且對某些抗生素抗性菌也有很好的抑殺效果，該抗菌肽展示了較強的廣譜抗菌活性。此外，本發明表達純化抗菌肽的方法能保持天然的氨基酸序列，并保證其生物活性，并且該方法簡單、成本低。


圖I是小菜蛾總RNA得提取和反轉錄PCR調去小菜蛾抗菌肽基因pxCECAl的電泳圖，其中I.小菜蛾免疫前總RNA ;2.小菜蛾免疫后總RNA ;3. Marker D2000 ；4.內參小菜蛾actin基因；5.小菜蛾抗菌肽基因pxCECAl。圖2是重組表達質粒pTWINl- pxCECAl的構建流程圖。圖3是融合蛋白及目的蛋白的SDS-PAGE電泳圖，左圖基因工程大腸桿菌表達融合蛋白 CBD-intein- pxCECAl,其中 M :Fermentas Protein Marker ； I.未誘導；2.誘導后；3.誘導后上清；4.幾丁質柱穿漏液。右圖融合蛋白在不同pH下，自切割效率比較， 其中 M Fermentas Protein Marker ;1· pH 5. 5 ；2. pH 6. O ；3. pH 7. O ;4· pH 8. 5。圖4四不同溫度下融合蛋白自切后洗脫的目的蛋白電泳圖，左圖融合蛋白在 220C自切后洗脫目的蛋白pxCECAl。M NEB Protein Marker ；1. 12小時后洗脫的pxCECAl ；
2.24小時后洗脫的pxCECAl ;3· 36小時后洗脫的pxCECAl ;4· 48小時后洗脫的pxCECAl。 右圖融合蛋白在4°C自切后洗脫目的蛋白pxCECAl。M NEB Protein Marker ；1. 12小時后洗脫的pxCECAl ；2. 24小時后洗脫的pxCECAl ；3. 36小時后洗脫的pxCECAl ；4. 48小時后洗脫的pxCECAl。圖5是pxCECAl對大腸桿菌生長抑制曲線。圖6.是pxCECAl對MRSA1381生長抑制曲線。圖7是pxCECAl對大腸桿菌及MRSA1381殺菌作用曲線。圖8是過氧化氫酶釋放實驗結果。圖9是小菜蛾抗菌肽pxCECAl的蛋白質序列。下劃線部分為信號肽序列，方框部分為翻譯后編輯剪切掉的氨基酸殘基。
具體實施例方式下面結合附圖及具體實施例對本發明作進一步說明，但不應理解為對本發明的限制。在實施例中涉及的所有培養基和分子生物學操作方法若未特別說明，均為本領域技術人員所熟知的常規方法。實施例I小菜蛾總RNA的提取 (I)小菜蛾的免疫
小菜蛾幼蟲用人造飼料養至五齡，將大腸桿菌E. coli JM109培養至對數生長期，用針蘸大腸桿菌菌液后刺小菜蛾幼蟲腹部，24小時之后提取其蟲體的總RNA。(2)總RNA得提取
A.10-30mg組織加入Iml TRIzol，用一次性研磨杵充分勻漿，樣品加入TRIzoI后，室溫放置5min，使樣品充分裂解。B.每Iml TRIzol加入200 μ I氯仿，劇烈振蕩混勻后室溫放置3_5 min使其自然分相。C. 4°C 12，OOOrpm離心10-15min。樣品會分成三層黃色的有機相，中間層和無色的水相，RNA主要在水相中，把水相轉移到新管中。D.在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置10-20min。4°C 12,000 rpm離心IOmin,棄上清，RNA沉淀于管底。E. RNA沉淀中加入Iml 75%乙醇(用RNase-free水配制)，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。每Iml TRIzol加入Iml 75%乙醇。F. 4°C 5, 000-8, 000 rpm離心l_2min,棄上清；短暫快速離心，用移液器小心
吸棄上清，注意不要吸棄沉淀。室溫放置1-2分鐘晾干沉淀。G.溶解RNA，沉淀中加入 50-100 μ I RNase-free水，輕彈管壁，以充分溶解RNA，-70°C保存。實施例2小菜蛾抗菌肽pxCECAl基因的克隆
(I)合成pxCECAl cDNA的第一條鏈
按照Reverse Transcription System試劑盒說明書，以Oligo (dT)2Q為引物合成cDNA 第一鏈。反應體系如下，依次將以下試劑加入經DEPC水處理并滅菌過的PCR管中
權利要求
1.小菜蛾抗菌肽PXCECA1，其具有SEQID N0:2或SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列。
2.編碼權利要求I所述抗菌肽的基因。
3.含有權利要求2所述基因的載體。
4.權利要求3所述載體轉化的基因工程菌。
5.大腸桿菌(萬co7i)BL21(DE3)-pTWINl_pxCECAl，其保藏號為 CCTCC NO: M 2012013。
6.權利要求I所述抗菌肽的基因工程制備方法，包括下列步驟克隆權利要求2所述基因，將該基因插入PTWINl質粒，轉化大腸桿菌coli BL21 (DE3)，篩選陽性克隆，經IPTG誘導表達得到融合蛋白CBD-intein-pxCECAl，經其自切得到權利要求I所述的抗菌肽。
7.一種制備權利要求I所述小菜蛾抗菌肽pxCECAl的方法，包括下列步驟A.基因工程菌株的發酵及上清制備將權利要求5所述大腸桿菌接種2XYT培養基中，經O. ImM IPTG在15°C下誘導過夜；發酵菌液離心得到菌體后，超聲波破碎菌體，離心后得到細胞粗提物上清；B.融合蛋白的掛柱分離以及柱上自切將破碎得到的上清，緩慢通過裝有幾丁質珠的純化柱，以10倍柱體積的結合緩沖液洗填料；之后將柱內緩沖液pH值調至6. O,放置4°C 36小時；C.目的蛋白小菜蛾抗菌肽pxCECAl的洗脫收集以及純化濃縮用洗脫緩沖液緩緩洗脫幾丁質柱，收集洗脫液；以30KD的超濾管超濾，取超濾后的穿漏液，再以IOKD的超濾管濃縮即得。
8.權利要求I所述抗菌肽在制備抗菌藥物或抗病毒藥物中的應用。
9.權利要求I所述的抗菌肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。
10.含有權利要求I所述的抗菌肽的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種新的來自小菜蛾的抗菌肽pxCECA1，其氨基酸酸序列如SEQ ID No.2所示，本發明還公開了編碼該抗菌肽的基因、含有所述基因的載體以及含有所述載體的基因工程菌。本發明還公開了所述抗菌肽的制備方法，其是利用IMPACT-WIN系統對其進行表達純化。本發明提供的重組的基因工程菌株在IPTG的誘導下，融合蛋白CBD-intein-pxCECA1以可溶的形式得到高效表達，通過自切得到pxCECA1，其對幾種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較強的抗菌活性。
文檔編號C12N15/70GK102603884SQ20121004925
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者孟小林, 徐進平, 王健, 王宏 申請人:武漢大學