專利名稱：一種簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法
技術領域：
本發明涉及植物保護技術領域，尤其是一種簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法。
背景技術：
近年來，上世紀60年代初在江浙一帶發現的水稻條紋病毒(rice stripe virus, RSV)和水稻黑條矮縮病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)又在我國多個水稻種植區流行，僅2004-2005年間水稻條紋病毒在江蘇省的發病面積就在2000萬畝以上。南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)，又名水稻黑條矮縮病毒2號(Rice black-streaked dwarf virus 2，RBSDV-2)，是最近新發現的一種重要的水稻病毒，自2001年在廣東陽江市報道以來，2010年已在越南北部和我國華南、 華中、華東等14個省市自治區發生，發病面積達2000萬畝以上。以上3種重要的水稻病毒均由昆蟲以持續性方式傳播，且在田間均可感染水稻、玉米、高梁、稗草等一些常見的禾本科作物和雜草。其中，由灰飛虱傳播的水稻條紋病毒、水稻黑條矮縮病毒分屬于纖細病毒屬 (genus Tenuivirus)禾口呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(genus Fi jivirus)，由白背飛虱傳播的南方水稻黑條矮縮病毒是呼腸孤病毒科斐濟病毒屬第二組一個暫定的新成員。從寄主范圍、流行特點、地理分布等流行學來看，這3種水稻病毒病在我國都曾大面積流行并造成了水稻等作物產量的嚴重損失，近年來雖病情指數有所不同但都常年發生且發生地域存在一定的重疊，尤其在我國華東地區，這給該類病害的診斷、預測預報和防控帶來了一定的困難，也對病害的檢測提出了更高的技術要求。血清學方法是常用的快速廉價的檢測方法之一，但由于RBSDV與SRBSDV之間存在強烈的血清學交叉反應，目前所制備的多克隆抗體尚不能用來區分這2種病毒。大量RSV、RBSDV、SRBSDV基因組全序列相繼測定及其登錄和公開促進了這些病毒的分子檢測方法的建立，華南農大周國輝等]和湖南農大周倩等根據SlO序列分別發展了巢式和一步RT-PCR方法用于特異性地檢測SRBSDV，江蘇農科院季英華等根據序列差異較多的S9序列發展了檢測RBSDV和SRBSDV的方法。日本學者Le et al.采用環介導的等溫擴增技術建立了 9種水稻病毒的檢測方法，但這些方法均不能用來同時檢測這3種病毒。

發明內容
本發明要解決上述現有技術的缺點，提供一種快速、準確、靈敏且同步檢測這3種重要水稻病毒的方法。本發明解決其技術問題采用的技術方案這種簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，應用一套病毒特異性引物以待測樣品總RNA為模板進行一步RT-PCR擴增，該引物共有6條，它們的基因序列表示如下DRS-1，5，-CACTCTAGCTGATTTGCAGAAGGCA-3，；DRS-2,5' -GGTCTTCACTTTCCCATTGGTGATG-3 ；
DRB-1，5，-ACTAAGCTTATTTGCTACCTCCAAAC-3，；DRB-2，5，-ATTAGTRCGCAAMGTGGACAAACTG-3，(R = A, G ;M = A, C)；DSR-1，5，-CGCTTTAGATGCTGACAAATCACTTTTA-3，；DSR-2，5 ’ -CTCCTTTTCTAAGTGCAGACAGTCC-3 ’。最后通過凝膠電泳條帶以判斷水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)、水稻條紋病毒(RSV) 以及南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)的侵染狀況，其具體包括以下步驟1)引物設計通過分析GenBank數據庫公布和本實驗室測定的水稻黑條矮縮病毒、水稻條紋病毒以及南方水稻黑條矮縮病毒外殼蛋白的基因，獲得3種病毒種內保守種間呈多態性的區域，并應用I^rimere. 0程序設計針對3種水稻病毒的6條特異性引物，這些引物在上海生工生物工程服務有限公司合成；2)樣品總RNA提取對于水稻等植物樣品，取0. Ig病株或健株葉片于研缽中加液氮研磨成粉狀，轉入1. 5mL離心管后，再加入ImL TRIzol試劑(Invitrogen)；對于飛虱樣品，取單頭蟲體，置于1.5mL離心管中，加入500 μ L TRIzol試劑Qnvitrogen)，再用經過高溫處理的玻棒將蟲體充分研磨；此后的操作均按TRIzoI試劑使用說明書提取總RNA 振蕩混勻后，加入氯仿0. 2ml，混勻后靜置3 5min ； 12000g離心lOmin，取上清至新離心管并加入等體積的異丙醇，混勻后12000g，4°C條件下離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2 次，干燥后將沉淀溶于無RNase的ddH20中，提取的總RNA保存于_80°C冰箱中備用；3)擴增反應采用One Step RT-PCRKit (寶生物工程(大連)有限公司)以樣品總RNA提取物為模板進行擴增，反應總體積50 μ L，內含樣品總RNA抽提物5 μ L，其他各組分參照試劑盒說明，包括:2Χ反應緩沖液25 μ L，6條引物各1 μ L，酶混合物2 μ L，再添加無RNase的ddH20至總體積50 μ L，反應程序為50°C反轉錄30min ；94°C預變性^iiin ；94°C 變性30s，63°C退火30s，72°C延伸30 60s, 30個循環；72°C延伸IOmin ；4)電泳分析取擴增產物5yL，點樣至1.2%的瓊脂糖凝膠上樣孔中，以 DL2000DNA標準分子量作為參照，在120伏的電壓下于IXTAE電泳緩沖液中電泳30 60min, EB染色后在紫外燈下觀察，記錄并分析與預期片斷大小的一致性。引物合成后通過梯度PCR確定引物的最適退火溫度為63°C，如圖1所示；其中 DRS-I和DRS-2特異性地擴增RSV的核衣殼蛋白基因，擴增產物大小為757bp ；DRB-I和 DRB-2特異性地擴增RBSDV的主要外層衣殼蛋白基因，擴增產物大小為592bp ；DSR-I和 DSR-2特異性地擴增SRBSDV的主要外層衣殼蛋白基因，擴增產物大小為142bp。發明有益的效果是本發明針對生產實際，發展建立了一種快速、準確、靈敏且同步檢測這3種重要水稻病毒的方法，并成功應用于單頭飛虱以及田間樣品的檢測和診斷， 為水稻黑條矮縮病、條紋病、南方黑條矮縮病的準確診斷、預測預報和科學防控提供了技術支撐。


圖1顯示在梯度退火溫度(Tm)條件下RT-PCR的擴增效率。其中M表示DNA標準分子量DL2000 ；泳道1-12分別為在Tm = 59. 8 72. 0°C條件下的擴增產物；圖2為本檢測方法特異性和靈敏毒分析。其中M表示DNA標準分子量DL2000 ；泳道1 3為引物DRB-1/DRB-2依次擴增RBSDV，SRBSDV和RSV標準樣品；泳道4 6為弓丨物DRZ-1/DRZ-2依次擴增RBSDV，SRBSDV和RSV標準樣品；泳道7 9為引物DRS-1/DRS-2 依次擴增RBSDV，SRBSDV和RSV標準樣品；泳道10 12為三對混合引物依次擴增RBSDV， SRBSDV和RSV標準樣品；泳道13-16為三對混合引物擴增RBSDV、SRBSDV, RSV混合樣品； 泳道17 28為三對混合引物擴增按1 10比例梯度稀釋的RBSDV、SRBSDV和RSV混合樣
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m ；圖3是本方法在不同來源的樣品檢測中的應用。其中M為DNA標準分子量DL2000 ； 泳道1為健康水稻樣品；泳道2-8為水稻病株樣品；泳道9-10為玉米病株樣品；泳道11為健康無毒灰飛虱樣品；泳道12-14為灰飛虱樣品；泳道15-16為白背飛虱樣品；泳道17為健康無毒白背飛虱樣品。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明作進一步說明實施例1 植物樣品的檢測。植物樣品選取田間疑似病毒侵染的水稻、玉米病株樣品主要于2008-2011年間采集自我國浙江、山東、湖北、湖南、廣東、上海等省市以及越南北部省市，并保存于-80°C冰箱。引物設計通過分析GenBank數據庫公布和本實驗室測定的水稻黑條矮縮病毒、 水稻條紋病毒以及南方水稻黑條矮縮病毒外殼蛋白的基因，獲得3種病毒種內保守種間呈多態性的區域，并應用I^rimere. 0程序設計針對3種水稻病毒的6條特異性引物，這些引物在上海生工生物工程服務有限公司合成。植物材料總RNA提取對于水稻、玉米等植物樣品，取0. Ig葉片于研缽中加液氮研磨成粉狀，轉入1. 5mL離心管后，再加入ImL TRIzol試劑Qnvitrogen)，振蕩混勻后，加入氯仿0. anl，混勻后靜置3-5min ； 12000g離心lOmin，取上清至新離心管并加入等體積的異丙醇，混勻后12000g，4°C條件下離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次，干燥后將沉淀溶于無RNase的(MH2O中，提取的總RNA保存于_80°C冰箱中備用。擴增反應反應總體積50 μ L，內含樣品總RNA抽提物5 μ L，2X反應緩沖液 25 μ L，6條引物各1 μ L，酶混合物2 μ L，再添加無RNase的ddH20至總體積50 μ L。反應程序為 50°C反轉錄 30min ；94°C預變性 2min ；94°C變性 30s，63°C退火 30s，72°C延伸 30 60s， 30個循環；72°C延伸IOmin。電泳鑒定擴增產物取擴增產物5 μ L，點樣至1. 2%的瓊脂糖凝膠上樣孔中，以 DL2000DNA標準分子量作為參照，在120伏的電壓下于IXTAE電泳緩沖液中電泳30 60min, EB染色后在紫外燈下觀察，記錄并分析與預期片斷大小的一致性，部分電泳鑒定圖片見圖3泳道1-10。結果分析根據電泳結果可判斷植物樣品是否存在上述3種病毒的侵染，若被侵染，是何種病毒侵染。例如僅擴增出592bp的條帶，表明該植物樣品存在RBSDV侵染(見圖 3，泳道2、8-10)；僅擴增出142bp條帶的樣品，表明該植物樣品存在SRBSDV侵染(見圖3， 泳道幻；僅擴增出757bp條帶的樣品，表明該植物樣品存在RSV侵染(見圖3，泳道4)。依次類推，擴增出592bp和142bp條帶的樣品，表明該植物樣品存在RBSDV和SRBSDV復合侵染 (見圖3，泳道5)；擴增出757bp和142bp條帶的樣品，表明該植物樣品存在RSV和SRBSDV復合侵染(見圖3，泳道6-7)。實施例2 單頭飛虱樣品的檢測。飛虱樣品灰飛虱和白背飛虱樣品主要于2008-2011年間采集自浙江、海南、湖南、上海、山東等省市，部分飛虱在水稻苗上飼養，余下保存于70%乙醇中備用。引物設計通過分析GenBank數據庫公布和本實驗室測定的水稻黑條矮縮病毒、 水稻條紋病毒以及南方水稻黑條矮縮病毒外殼蛋白的基因，獲得3種病毒種內保守種間呈多態性的區域，并應用I^rimere. 0程序設計針對3種水稻病毒的6條特異性引物，這些引物在上海生工生物工程服務有限公司合成。飛虱總RNA提取取單頭蟲體，置于1.5mL離心管中，加入500 μ L TRIzol試劑 anvitrogen)，再用經過高溫處理的玻棒將蟲體充分研磨；振蕩混勻后，加入氯仿0. Iml, 混勻后靜置3-5min ； 12000g離心lOmin，取上清至新離心管并加入等體積的異丙醇，混勻后 12000g, 4°C條件下離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次，干燥后將沉淀溶于無RNase 的ddH20中，提取的總RNA保存于_80°C冰箱中備用。擴增反應反應總體積50 μ L，內含樣品總RNA抽提物5 μ L，2X反應緩沖液 25 μ L，6條引物各1 μ L，酶混合物2 μ L，再添加無RNase的ddH20至總體積50 μ L。反應程序為50°C反轉錄30min ；94°C預變性^iiin ；94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸30 60s, 30 個循環；72°C延伸 IOmin0電泳鑒定擴增產物取擴增產物5μ L，點樣至1. 2%的瓊脂糖凝膠上樣孔中，以 DL2000DNA標準分子量作為參照，在120伏的電壓下于IXTAE電泳緩沖液中電泳30 60min,EB染色后在紫外燈下觀察，記錄并分析與預期片斷大小的一致性。部分電泳鑒定圖片見圖3泳道11-17。結果分析根據電泳結果可單頭飛虱物樣品中是否攜帶上述3種病毒，若攜帶的話，又攜帶何種病毒侵染。例如僅擴增出757bp條帶的灰飛虱樣品，表明該頭灰飛虱攜帶 RSV(見圖3，泳道12)；僅擴增出142bp條帶的灰飛虱和白背飛虱樣品，表明該頭灰飛虱和白背飛虱均攜帶有SRBSDV(見圖3，泳道14、16)；僅擴增出592bp條帶的白背飛虱樣品，表明該頭白背飛虱樣品攜帶有RBSDV (見圖3，泳道1 。依次類推，擴增出592bp和757bp條帶的灰飛虱樣品，表明該頭灰飛虱同時攜帶了 RBSDV和RSV 2種病毒(見圖3，泳道13)。檢測特異性和靈敏度分析先利用上述3對引物分別對3種病毒標準樣品進行一步法 RT-PCR擴增(結果見圖 2，泳道 1-9)，引物對DRB-I/DRB-2、DRZ-I/DRZ-2、DRS-I/DRS-2 均僅能在相應的病毒標準樣品中擴增到預期大小的條帶。接著利用等比例混合的3對引物并分別以RSV、RBSDV、SRBSDV標準樣品及其混合物作為模板進行PCR擴增(結果見圖2，泳道10-16)，利用3對混合引物在RSV、RBSDV、SRBSDV樣品同樣可擴增到特異的預期大小的片斷；在混合樣品中，無論是2種樣品混合還是3種樣品混合，都僅能檢測到預期大小的相應片斷。而利用這些引物在其它植物病毒如RGDV、RRSV、TMV、PVY樣品中均與健康水稻樣品一樣檢測不到任何預期大小的特異性條帶。為了更準確地分析特異性，我們還對各引物在部分水稻病株樣品中的擴增產物進行了測序分析，比對結果各擴增產物序列與對應病毒相應區域的序列同源性在98%以上。這些結果表明，本方法可特異性地用于檢測RSV、RBSDV、 SRBSDV0在此基礎上，我們又采用梯度稀釋標準樣品的方式對該方法的靈敏度進行了分析 (結果見圖2，泳道17-28)，當稀釋至1/10000，仍可有效檢測，表明本方法具有較高的靈敏
除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護范圍。
權利要求
1.一種簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，其特征是該檢測方法應用一套病毒特異性引物以待測樣品總RNA為模板進行一步RT-PCR擴增，該引物共有6條，分別為 DRS-I、DRS-2、DRB-I、DRB-2、DSR-I以及DSR-2，它們的基因序列如序列表所示，最后通過凝膠電泳條帶判斷水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)、水稻條紋病毒(RSV)以及南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)的侵染狀況。
2.根據權利要求1所述的簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，具體包括以下步驟1)引物設計通過比對分析RBSDV、RSV以及SRBSDV外殼蛋白的基因，獲得3種病毒種內保守種間呈多態性的區域，設計針對3種水稻病毒的6條特異性引物；2)樣品總RNA提取將待測樣品置于1.5mL離心管中，加入TRIzol試劑，提取總RNA保存于-80°C冰箱中備用；3)擴增反應采用OneStep RT-PCR Kit以樣品總RNA提取物為模板進行擴增，反應總體積50μ L，內含樣品總RNA抽提物5 μ L，其他各組分參照試劑盒說明，包括2 X反應緩沖液25 μ L，6條引物各1 μ L，酶混合物2 μ L，再添加無RNase的ddH20至總體積50 μ L，反應程序為50°C反轉錄30min ；94°C預變性^iiin ；94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸30 60s, 30 個循環；72°C延伸 IOmin ；4)電泳分析取擴增產物5yL，點樣至1.2%的瓊脂糖凝膠上樣孔中，以DL2000DNA標準分子量作為參照，在120伏的電壓下于IXTAE電泳緩沖液中電泳30 60min，EB染色后在紫外燈下觀察，記錄并分析與預期片斷大小的一致性。
3.根據權利要求2所述的簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，其特征是所述步驟2)中，待測樣品為水稻、玉米等植物樣品，取0. Ig葉片于研缽中加液氮研磨成粉狀，轉入 1. 5mL離心管后，再加入ImL TRIzol試劑，振蕩混勻后，加入氯仿0. ^il,混勻后靜置3 5min ； 12000g離心lOmin，取上清至新離心管并加入等體積的異丙醇，混勻后12000g，4°C條件下離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次，干燥后將沉淀溶于無RNase的ddH20中， 提取的總RNA保存于_80°C冰箱中備用。
4.根據權利要求2所述的簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，其特征是所述步驟2)中，待測樣品為飛虱樣品，取單頭蟲體，置于1.5mL離心管中，加入500μ L TRIzol試劑，再用經過高溫處理的玻棒將蟲體充分研磨；振蕩混勻后，加入氯仿0. 1ml，混勻后靜置 3 5min ； 12000g離心lOmin，取上清至新離心管并加入等體積的異丙醇，混勻后12000g， 4°C條件下離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次，干燥后將沉淀溶于無RNase WddH2O 中，提取的總RNA保存于_80°C冰箱中備用。
5.根據權利要求1-4任意一條所述的簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，其特征是設計的引物中DRS-I和DRS-2特異性地擴增RSV的核衣殼蛋白基因，擴增產物大小為757bp ；DRB-I和DRB-2特異性地擴增RBSDV的主要外層衣殼蛋白基因，擴增產物大小為 592bp ；DSR-I和DSR-2特異性地擴增SRBSDV的主要外層衣殼蛋白基因，擴增產物大小為 142bp。
6.根據權利要求1-4任意一條所述的簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，其特征是通過梯度PCR確定引物的最適退火溫度為63°C。
全文摘要
本發明涉及一種簡單快速同步檢測三種水稻病毒的方法，應用一套病毒特異性引物以待測樣品總RNA為模板進行一步RT-PCR擴增，該引物共有6條，分別為DRS-1、DRS-2、DRB-1、DRB-2、DSR-1以及DSR-2，它們的基因序列如序列表所示，最后通過凝膠電泳條帶以判斷水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)、水稻條紋病毒(RSV)以及南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)的侵染狀況。發明有益的效果是本發明針對生產實際，發展建立了一種快速、準確、靈敏且同步檢測這3種重要水稻病毒的方法，并成功應用于單頭飛虱以及田間樣品的檢測和診斷，為水稻黑條矮縮病、條紋病、南方黑條矮縮病的準確診斷、預測預報和科學防控提供了技術支撐。
文檔編號C12R1/94GK102559937SQ20121004982
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者呂明芳, 吳為奇, 張恒木, 羊健, 郭西貴, 陳劍平 申請人:浙江省農業科學院