專利名稱：米根霉rh1-5及其分離培養方法
技術領域：
本發明涉及霉菌類微生物及分離培養方法，具體涉及一種米根霉RH1-5及其分離培養方法。
背景技術：
大曲作為濃香型曲酒的糖化發酵劑，在培養過程中經過一定富集、培養、自然篩選、馴化形成了特殊的微生物系，為曲酒生產發酵提供豐富而有益的微生物菌源，從而形成代謝產物的多樣性，即香味成份的復雜性，同時大曲還是復合酶制劑，大曲中含有淀粉酶、糖化酶、酒化酶、酯化酶、蛋白酶等多種酶系，為形成復雜的香氣成份提供催化劑。但受環境微生物的影響，大曲微生物菌系繁雜，其糖化力波動較大，直接影響大曲在釀酒過程中的糖化效果。

發明內容
本發明的目的在于提供一種米根霉RH1-5及其分離培養方法，通過該分離培養方法獲得米根霉RH1-5，分離培養方法工藝簡單，米根霉RH1-5糖化力波動較小，穩定大曲在釀酒過程中的糖化效果。本發明的技術解決方案是該米根霉RH1-5菌株是從濃香中高溫大曲中分離篩選而得，菌種已于2011年11月29日在北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，菌種編號為=CGMCC No.5513,分類命名米根霉 Rhizopus oryzae。所述米根霉RH1-5的分離培養方法是取中高溫大曲適量粉碎后稱取10克，于裝有90mL無菌水的三角瓶中，震蕩30min獲得菌懸液；用無菌吸管吸取菌懸液l.OmL，放入盛有9mL無菌水的試管中，依次用10倍法稀釋至不同稀釋度，取10 —2、10 —3、10 —4稀釋度的樣品各ImL加入直徑為90_無菌培養皿中，分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、察氏培養基進行平板培養，搖勻后置于恒溫培養箱中28°C _32°C倒置培養3-5天；挑取培養皿內形態規則的菌落，在麩皮汁固體斜面培養基上劃線培養，進行多次反復的分離純化，獲得單個純種菌落，鏡檢確定為霉菌后保藏于麩皮汁固體斜面培養基備用；將所得霉菌菌株點種于篩選培養基平板上，用透明圈法進行糖化霉菌初篩，篩出產糖化酶能力強的微生物，最終篩選出一株霉菌，經26S rDNA序列同源性分析鑒定為米根霉，命名腿-5。所述麩皮汁固體斜面培養基在I. OL麩皮汁中加入其質量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%瓊脂，PH自然，121°C滅菌15min ;其中，麩皮汁制備加入5_6倍于麩皮重量的水，攪拌均勻煮沸30min，取出過濾得麩皮汁。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)將200克馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000毫升煮沸半小時，用雙層紗布過濾，取其濾液加蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂10克，煮沸融化并補水至1000毫升。
所述孟加拉紅瓊脂養基購于上海國藥集團。所述察氏培養基三角瓶中加入硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化鉀O. 5克、硫酸亞鐵O. 01克、蔗糖30克、瓊脂10克、蒸餾水1000毫升，加熱溶解得混合液，121°C殺菌20min，冷卻后添加混合液質量的O. 05%去氧膽酸鈉，再每IOOml培養基中加入IOOul鏈霉素。所述篩選培養基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KN03 lg、瓊脂 IOg 組成，ρΗ7· 2-7. 4，121°C滅菌 30min。 本發明對大曲中的微生物進行分離篩選獲得一株霉菌——米根霉，與實驗室現有的保藏菌株進行性能對比試驗，結果表明該菌株不僅糖化力高，而且耐酸、耐高溫，適宜于 釀酒窖池發酵的酸性環境，有益于培養制作強化高溫大曲，對提高出酒率具有重要的意義。
具體實施例方式下面結合具體的實施例進一步說明本發明的技術解決方案，這些實施例不能理解為是對技術解決方案的限制。實施例I :依以下步驟分離培養米根霉RH1-5
取中高溫大曲適量粉碎后稱取10克，于裝有90mL無菌水的三角瓶中，震蕩30min獲得菌懸液；用無菌吸管吸取菌懸液I. OmL，放入盛有9mL無菌水的試管中，依次用10倍法稀釋至不同稀釋度，取10 —2、10 —3、10 —4稀釋度的樣品各ImL加入直徑為90mm無菌培養皿中，分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、察氏培養基進行平板培養，搖勻后置于恒溫培養箱中28°C倒置培養5天，每個稀釋度同時做3個平行；挑取培養皿內形態規則的菌落，在麩皮汁固體斜面培養基上劃線培養，進行多次反復的分離純化，獲得單個純種菌落，鏡檢確定為霉菌后保藏于麩皮汁固體斜面培養基備用；將所得霉菌菌株按編號點種于篩選培養基平板上，用透明圈法進行糖化霉菌初篩，篩出產糖化酶能力強的微生物，最終篩選出一株霉菌，經26S rDNA序列同源性分析鑒定為米根霉，命名RH1-5。其中，所述麩皮汁固體斜面培養基在I. OL麩皮汁中加入其質量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%瓊脂，PH自然，121°C滅菌15min ;其中，麩皮汁制備加入5倍于麩皮重量的水，攪拌均勻煮沸30min，取出過濾得麩皮汁。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)將200克馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000毫升煮沸半小時，用雙層紗布過濾，取其濾液加蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂10克，煮沸融化并補水至1000毫升。所述孟加拉紅瓊脂養基購于上海國藥集團。所述察氏培養基三角瓶中加入硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化鉀O. 5克、硫酸亞鐵O. 01克、蔗糖30克、瓊脂10克、蒸餾水1000毫升，加熱溶解得混合液，121°C殺菌20min，冷卻后添加混合液質量的O. 05%去氧膽酸鈉，再每IOOml培養基中加入IOOul鏈霉素。所述篩選培養基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KNO3 lg、瓊脂 IOg 組成，ρΗ7· 2，121°C滅菌 30min。實施例2 :依以下步驟分離培養米根霉RH1-5
取中高溫大曲適量粉碎后稱取10克，于裝有90mL無菌水的三角瓶中，震蕩30min獲得菌懸液；用無菌吸管吸取菌懸液I. OmL，放入盛有9mL無菌水的試管中，依次用10倍法稀釋至不同稀釋度，取10 —2、10 —3、10 —4稀釋度的樣品各ImL加入直徑為90mm無菌培養皿中，分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、察氏培養基進行平板培養，搖勻后置于恒溫培養箱中30°C倒置培養4天，每個稀釋度同時做3個平行；挑取培養皿內形態規則的菌落，在麩皮汁固體斜面培養基上劃線培養，進行多次反復的分離純化，獲得單個純種菌落，鏡檢確定為霉菌后保藏于麩皮汁固體斜面培養基備用；將所得霉菌菌株按編號點種于篩選培養基平板上，用透明圈法進行糖化霉菌初篩，篩出產糖化酶能力強的微生物，最終篩選出一株霉菌，經26S rDNA序列同源性分析鑒定為米根霉，命名RH1-5。所述麩皮汁固體斜面培養基在I. OL麩皮汁中加入其質量1%葡萄糖、O. 5%酵母 膏、1%瓊脂，PH自然，121°C滅菌15min;其中，麩皮汁制備加入5. 5倍于麩皮重量的水，攪拌均勻煮沸30min，取出過濾得麩皮汁。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)將200克馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000毫升煮沸半小時，用雙層紗布過濾，取其濾液加蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂10克，煮沸融化并補水至1000毫升。所述孟加拉紅瓊脂養基購于上海國藥集團。所述察氏培養基三角瓶中加入硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化鉀O. 5克、硫酸亞鐵O. 01克、蔗糖30克、瓊脂10克、蒸餾水1000毫升，加熱溶解得混合液，121°C殺菌20min，冷卻后添加混合液質量的O. 05%去氧膽酸鈉，再每IOOml培養基中加入IOOul鏈霉素。所述篩選培養基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KNO3 lg、瓊脂 IOg 組成，ρΗ7· 3，121°C滅菌 30min。實施例3 :依以下步驟分離培養米根霉RH1-5
取中高溫大曲適量粉碎后稱取10克，于裝有90mL無菌水的三角瓶中，震蕩30min獲得菌懸液；用無菌吸管吸取菌懸液I. OmL，放入盛有9mL無菌水的試管中，依次用10倍法稀釋至不同稀釋度，取10 —2、10 —3、10 —4稀釋度的樣品各ImL加入直徑為90mm無菌培養皿中，分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、察氏培養基進行平板培養，搖勻后置于恒溫培養箱中32°C倒置培養3天，每個稀釋度同時做3個平行；挑取培養皿內形態規則的菌落，在麩皮汁固體斜面培養基上劃線培養，進行多次反復的分離純化，獲得單個純種菌落，鏡檢確定為霉菌后保藏于麩皮汁固體斜面培養基備用；將所得霉菌菌株按編號點種于篩選培養基平板上，用透明圈法進行糖化霉菌初篩，篩出產糖化酶能力強的微生物，最終篩選出一株霉菌，經26S rDNA序列同源性分析鑒定為米根霉，命名RH1-5。所述麩皮汁固體斜面培養基在I. OL麩皮汁中加入其質量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%瓊脂，PH自然，121°C滅菌15min ;其中，麩皮汁制備加入6倍于麩皮重量的水，攪拌均勻煮沸30min，取出過濾得麩皮汁。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)將200克馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000毫升煮沸半小時，用雙層紗布過濾，取其濾液加蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂10克，煮沸融化并補水至1000毫升。所述孟加拉紅瓊脂養基購于上海國藥集團。所述察氏培養基三角瓶中加入硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂(MgSO4 ·7Η20) O. 5克、氯化鉀O. 5克、硫酸亞鐵O. 01克、蔗糖30克、瓊脂10克、蒸餾水1000毫升，加熱溶解得混合液，121°C殺菌20min，冷卻后添加混合液質量的O. 05%去氧膽酸鈉，再每IOOml培養基中加入IOOul鏈霉素。
所述篩選培養基(g/L):由可溶性淀粉10g、K2HPO4 O. 3 g、MgCO3 或 MgSO41g、NaClO. 5g、KNO3 lg、瓊脂 IOg 組成，ρΗ7· 4，121°C滅菌 30min。實施例4 :菌種性能對比優化試驗
將實施例1-3獲得的菌株與實驗室保藏的四株糖化菌株從試飯糖化力、糖化力、液化力及酯化力指標進行性能對比試驗。接種培菌糖化米飯滅菌后，冷卻至35 40°C，以無菌操作接入霉菌孢子懸浮液，充分搖勻，于不同溫度和不同pH培養不同時間，中間隔IOh左右搖瓶I次；取出后測其水分、試飯酸度、試飯糖化力、糖化力、液化力、酯化力指標；查閱資料得知試飯糖分無法真實的反應曲的質量好壞，因為試飯糖分測定值未考慮接種量及時間的影響，試飯糖化力可以相對準確地反應曲的質量。試飯糖化力mg/gh
試飯糖化力=試飯糖分+ (菌種對米飯的接種量X試飯時間)X1000糖化酶活力結果以I克絕干曲在Ph4. 6溶液中，35°C糖化可溶性淀粉I小時所產生的葡萄糖毫克數(mg/gh)
液化酶活力在35°C、Ph4. 6溶液時，I克絕干曲在I小時液化可溶性淀粉的質量(g/gh)，α-淀粉酶作用于α-1，4葡萄糖苷鍵。(I)、不同培菌糖化溫度
表I不同培菌糖化溫度指標測定
權利要求
1.米根霉RH1-5,其特征在于該米根霉RH1-5菌株是從濃香中聞溫大曲中分尚篩選而得，菌種已于2011年11月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，菌種編號為CGMCC No. 5513。
2.米根霉RH1-5的分離培養 方法，其特征在于該分離培養方法包括以下步驟取中高溫大曲適量粉碎后稱取10克，于裝有90mL無菌水的三角瓶中，震蕩30min獲得菌懸液；用無菌吸管吸取菌懸液I. OmL，放入盛有9mL無菌水的試管中，依次用10倍法稀釋至不同稀釋度，取10 —2、10 —3、10 —4稀釋度的樣品各ImL加入直徑為90mm無菌培養皿中，分別采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、察氏培養基進行平板培養，搖勻后置于恒溫培養箱中28°C _32°C倒置培養3-5天；挑取培養皿內形態規則的菌落，在麩皮汁固體斜面培養基上劃線培養，進行多次反復的分離純化，獲得單個純種菌落，鏡檢確定為霉菌后保藏于麩皮汁固體斜面培養基備用；將所得霉菌菌株點種于篩選培養基平板上，用透明圈法進行糖化霉菌初篩，篩出產糖化酶能力強的微生物，最終篩選出一株霉菌，經26S rDNA序列同源性分析鑒定為米根霉，命名RH1-5。
3.根據權利要求2所述的米根霉RH1-5的分離培養方法，其特征在于所述麩皮汁固體斜面培養基在I. OL麩皮汁中加入其質量1%葡萄糖、O. 5%酵母膏、1%瓊脂，PH自然，121°C滅菌15min ;其中，麩皮汁制備加入5-6倍于麩皮重量的水，攪拌均勻煮沸30min，取出過濾得麩皮汁。
4.根據權利要求2所述的米根霉RH1-5的分離培養方法，其特征在于所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)將200克馬鈴薯去皮切成小塊，于鍋中加水1000毫升煮沸半小時，用雙層紗布過濾，取其濾液加蔗糖或葡萄糖20克、瓊脂10克，煮沸融化并補水至1000暈升。
5.根據權利要求2所述的米根霉RH1-5的分離培養方法，其特征在于所述孟加拉紅瓊脂養基購于上海國藥集團。
6.根據權利要求2所述的米根霉RH1-5的分離培養方法，其特征在于所述察氏培養基三角瓶中加入硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀I克、硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. 5克、氯化鉀O. 5克、硫酸亞鐵O. 01克、蔗糖30克、瓊脂10克、蒸餾水1000毫升，加熱溶解得混合液，121°C殺菌20min，冷卻后添加混合液質量的O. 05%去氧膽酸鈉，再每IOOml培養基中加入IOOul鏈霉素O
7.根據權利要求2所述的米根霉RH1-5的分離培養方法，其特征在于所述篩選培養基(g/L):由可溶性淀粉 10g、K2HP04 0.3 g、MgC03 或 MgS04lg、NaCl O. 5g、KN03 lg、瓊脂 IOg 組成，ρΗ7· 2 — 7· 4，121°C滅菌 30min。
全文摘要
本發明公開了一種米根霉RH1-5及其分離培養方法，通過該分離培養方法獲得米根霉RH1-5，該米根霉RH1-5菌株是從濃香中高溫大曲中分離篩選而得，菌種已于2011年11月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，菌種編號為CGMCCNo.5513。本發明的分離培養方法工藝簡單，米根霉RH1-5糖化力波動較小，穩定大曲在釀酒過程中的糖化效果。
文檔編號C12N1/02GK102634460SQ20121005965
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月8日 優先權日2012年3月8日
發明者吳建峰, 孫瑩, 季方, 張培訓, 楊艷 申請人:江蘇今世緣酒業股份有限公司