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特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆dp-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):603060閱讀:297來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆dp-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其應(yīng)用,屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
近年來(lái),玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等轉(zhuǎn)基因作物已在許多國(guó)家允許種植和生產(chǎn),并被廣泛用作食品或飼料的加工原料。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品存在著生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和食品安全等一系列的問(wèn)題,因此,世界各國(guó)政府和相關(guān)國(guó)際組織紛紛制定相應(yīng)的安全管理法規(guī),加強(qiáng)遺傳改良作物的規(guī)范管理,并對(duì)遺傳改良作物及其產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識(shí)制度。我國(guó)于2001年5月9 日公布并實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》,并在2002年I月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)、標(biāo)示和進(jìn)ロ安全管理三個(gè)配套管理辦法。為了應(yīng)對(duì)遺傳改良作物管理相關(guān)的法律法規(guī)和制度,建立高效、快速、特異的檢測(cè)技術(shù)十分必要,它是各國(guó)際組織和國(guó)家管理遺傳改良作物的有力技術(shù)支撐。目前已經(jīng)發(fā)展并廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法有兩類(lèi)ー類(lèi)是基于核酸水平的檢測(cè),另ー類(lèi)是基于蛋白質(zhì)水平的免疫學(xué)檢測(cè)。基于核酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)技術(shù)因具有高靈敏度和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),已成為目前最重要、應(yīng)用最廣泛的遺傳改良作物及其產(chǎn)品檢測(cè)技木。不論采用基于核酸還是基于蛋白質(zhì)的方法,在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)時(shí)都應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽(yáng)性對(duì)照,以確保檢測(cè)過(guò)程的有效和檢測(cè)結(jié)果的可靠性。目前,用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要是用純合的轉(zhuǎn)基因植物材料配置的,位于比利時(shí)的歐盟聯(lián)合研究中心下屬的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM)專(zhuān)業(yè)配制和提供用于轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。到目前為止僅能得到十幾種在市場(chǎng)上銷(xiāo)售的遺傳改良作物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。但這類(lèi)來(lái)源于農(nóng)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),其必須有專(zhuān)門(mén)的研究機(jī)構(gòu)來(lái)制備,貯存和測(cè)定過(guò)程受很多因素影響,很難維持恒定的量,價(jià)格昂貴, 而且,這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因含量范圍一般是從0. 1%到5%,而實(shí)際檢測(cè)的樣品中的轉(zhuǎn)基因含量可能會(huì)超出這個(gè)范圍。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺乏已成為檢測(cè)方法建立和應(yīng)用的瓶頸,阻礙了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度的順利實(shí)施。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子是ー種重組質(zhì)粒分子,其中一般包含轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)的外源基因片段或品系特異性片段以及物種特異性片段。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的優(yōu)點(diǎn)主要是可以通過(guò)微生物進(jìn)行大量培養(yǎng),純度較高;且操作容易,穩(wěn)定性高,同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時(shí)包含多個(gè)外源目的基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因,經(jīng)濟(jì)高效。近年來(lái),越來(lái)越受到各國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)專(zhuān)家和學(xué)者們的重視,并逐漸取代傳統(tǒng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品用于轉(zhuǎn)基因品系及其加工產(chǎn)品的PCR檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系由先鋒公司研發(fā),已先后在美國(guó)、加拿大和日本三國(guó)批準(zhǔn)環(huán)境釋放,并在澳大利亞、韓國(guó)、菲律賓、墨西哥等8個(gè)國(guó)家和地區(qū)批準(zhǔn)用于食品和飼料加工原料。我國(guó)雖然不種植轉(zhuǎn)基因大豆,但每年都進(jìn)ロ幾千萬(wàn)噸轉(zhuǎn)基因大豆用于食品或飼料加工原料。迄今為止,還沒(méi)適用于轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的報(bào)道。為了給中國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆品系監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐,有必要開(kāi)發(fā)適用于轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系特異性檢測(cè)的、穩(wěn)定可靠的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題,本發(fā)明提供了一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其應(yīng)用,本發(fā)明的目的在于提供特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明所提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子,其包含以下序列片段DP_305423品系特異性片段和大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異序列片段。所述的DP-305423的品系特異性序列,指的是轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-305423的外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)的DNA序列如SEQ ID NO: I所示。所述大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin特異性片段,指的是大豆凝集素基因片段,其DNA 序列如SEQ ID NO:2所示。所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的骨架質(zhì)粒是PMD18-T。所述的用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子,其中用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的引物序列如下(表I)
表I構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的PCR引物
權(quán)利要求
1.一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子,其特征在于其序列如SEQ ID No:8 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的的構(gòu)建方法,其特征在于包括以下步驟①以轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-305423基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;反應(yīng)體系為總體積為50 μ 1,其中10倍的PCR反應(yīng)液5 μ 1,dNTPs 4μ I,上下游引物20 μ M各I μ 1,模板5μ I, Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ 1,用 ddH20 補(bǔ)足至 50 μ I ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C 5分鐘;然后進(jìn)入以下循環(huán)94°C 50秒,55°C 50秒,72°C 60秒,共 30 個(gè)循環(huán);最后 72°C延伸 5 分鐘;產(chǎn)物記為Pdp305423 SEQ ID No: I、PLectin SEQ ID No:7 ;②將Ρ Ρ305423 和P^tin克隆進(jìn)PMD18-T載體,分兩步進(jìn)行第一步采用PMD18-T為基礎(chǔ)載體將上步PCR擴(kuò)增的Pdp3ci5423 SEQ ID No: I片段采用T-A 克隆的方式連接到載體中;第二步用限制性?xún)?nèi)切酶&oR I和漢·Η I將P^etin片段SEQ ID No:7和含有Pdp3ci5423 片段的PMD18-T重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切;然后用T4連接酶將二者連接;獲得將轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-305423品系特異性序列片段及大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin特異性片段融合在 PMD18-T上的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子,將其命名為pMD-DP305423,其序列如SEQ ID Νο:8所示,將 PMD-DP305423導(dǎo)入大腸桿菌JM109即可長(zhǎng)期保存使用。
3.如權(quán)利要求2所述的一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的的構(gòu)建方法,其特征在于所述的引物序列如下DP305-F ACATAATTTTGAAAGATGATTAATG SEQ ID NO:3DP305-R CAAAGCTTATATATGCCTTCCG SEQ ID NO:4LN-F CGGAATTCAAGGCAAACTCAGCGGAAAC SEQ ID NO:5LN-R CGGGATCCAGTGTCAAACTCAACAGCGAC SEQ ID NO:6。
4.如權(quán)利要求I所述的一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系中作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子及其應(yīng)用,構(gòu)建了適用于轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系特異性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子,其包含轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423的品系特異性序列和大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段,對(duì)所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在轉(zhuǎn)基因大豆PCR檢測(cè)中的適用性進(jìn)行了驗(yàn)證表明,所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子高度特異于轉(zhuǎn)基因大豆DP-305423品系的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586308SQ20121005960
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者孫昌雷, 李文華, 楊正友, 趙鳳春 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
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