專利名稱：黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備參數的優選方法、制備工藝及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于ー種動物飼用微 生態調節劑，具體地說是ー種黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備參數的優選方法、制備エ藝及應用。
背景技術：
從1950年美國食品與藥物管理局首次批準抗生素作為飼料添加劑以來，抗生素在提高動物的生產效率發揮了巨大作用。但抗生素在動物產品中的殘留和導致病原菌耐藥性等問題日益引起人們的重視。世界各國正逐步限制或禁止在飼料中使用抗生素。1999年瑞士禁止使用飼用抗生素；2006年歐盟全面禁止抗生素作為飼料添加劑；2001年9月4日我國正式規定蛋雞飼料中不得使用任何抗生素。抗生素作為飼料添加劑的另一缺陷是它不僅殺死動物腸道內的有害菌，也殺死了有益菌，破壞了動物腸道內微生物平衡，從而導致動物發生腹瀉等疾病。因此，人們開始將目光轉向微生態制劑。微生態制劑是在微生態學理論的指導下，調整生態失調，保持動物腸道微生態平衡，提高宿主健康水平或增進健康狀態的生理性活菌制品及其代謝產物以及促進這些生理菌群生長繁殖的生物制品。微生態制劑包括益生菌、益生元和合生元。益生菌是指含活菌或菌體組分及代謝產物的生物制品，它經ロ或其它粘膜進入機體，可在粘膜表面處改善微生物區系的屏障功能或刺激特異或非特異性免疫。它作為ー種無毒、無殘留、無抗藥性的抗生素有效替代品而得到廣泛應用。目前常用的益生菌主要有乳酸菌、芽孢桿菌、光合細菌和真菌四大類。其中芽孢桿菌因其抗逆性強、耐高溫高壓、易貯存等優良特性，且具有調節腸道菌群平衡、增強動物免疫力、提高生產性能等諸多功能，被認為是最理想的微生物添加剤。但是隨著研究的深入，人們發現益生菌在產品應用方面存在較大困難，如活菌制劑穩定性差、產品種類單一、應用范圍有限、效果不穩定等。益生元是指在胃腸道的上部不能被水解也不能被吸收、能選擇性地刺激腸內有益菌(如芽孢桿菌等)生長繁殖并激活其代謝功能、能促進腸內健康優勢菌群的構成并提高其數量，并能增強宿主機體健康的物質。天然植物成分低聚糖(如黃芪多糖)、微藻及天然植物等都是具有益生元特性的物質。根據益生菌和益生元的特性，ー些科學家也進而考慮把兩者結合起來，這ー想法最終促成了合生元的誕生。合生元是把指益生菌與益生元合并使用的制劑，具有同時發揮益生菌與益生元雙重作用的特點。丁軻等報道用中草藥和益生菌合生元對大腸桿菌和沙門氏菌具有很好的抑制作用。李亞杰等也用黃芪多糖與益生菌制成合生元，顯著提高了肉雞的日增重，增強了肉雞的免疫功能。合生元既可發揮益生菌的生理性細菌活性，又可選擇性増加這種菌的數量使益生作用更持久，是ー種很有潛力的微生態調節劑。合生元在動物體上的作用效果要優于益生菌和益生元，然而，市面上的由合生元制品多是益生菌和益生元的復合添加，在制備エ藝中沒有考慮優選益生元的濃度、益生菌的培養溫度、培養時間以及合生元的活菌數，因而不能確保合生元產品的使用效果。

發明內容
本發明的目的是提供一種黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備參數的優選方法、制備エ藝及應用，通過體外培養試驗，科學選取黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備參數，實現制備エ藝優化，確保合生元產品的使用效果。本發明的原理根據枯草芽孢桿菌的生長曲線，確定枯草芽孢桿菌的培養最佳溫度。利用菌液OD值，確定適宜的黃芪多糖添加量。再根據枯草芽孢桿菌生長代時G，確定合生元的最佳培養時間，最終確定黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元的最佳制備エ藝。本發明提供的黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備參數的優選方法如下
1、生長曲線繪制和培養溫度的確定將活化后的枯草芽孢桿菌ACCC11025菌液以1% 的接種量接種于營養肉湯培養基中，分別于32で、120 rmirr1和37で和120 rmirr1的條件下振蕩培養，隔0.5 h取樣I次，連續培養12h，于540 nm下測定其吸光度，以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制曲線，根據生長曲線確定培養最佳溫度；
2、黃芪多糖最適添加量的確定在營養肉湯培養基里加入不同比例的黃芪多糖，使黃苗多糖的濃度分別為0 mg.mL'l mg mL_1>l. 5 mg mL_1>2 mg.mL—1,將姆個濃度的培養基分裝入3個容器瓶中，每個容器瓶中的液體相等，115で滅菌15 min后作為實驗用培養基;
將活化后的枯草芽孢桿菌菌液以容量比1%的接種量分別加入上述含不同濃度的黃芪多糖液體培養基中，置37で、120 PmirT1培養箱中振蕩培養，分別在4，4. 5,5,5. 5,6,6. 5，7 h時采樣，根據540 nm下測定吸光度(以黃芪多糖濃度為0 mg*mじ1培養基組為空白對照管調零)，以確定黃芪多糖適宜添加量；
3、黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元最適培養時間的確定將黃芪多糖的最適添加量確定好后，根據測量的最適添加濃度組的OD值，利用公式計算代時G，從而根據枯草芽孢桿菌在每個時間段的代時以確定合生元的最適培養時間；
G =(t2-tl)/3. 322(lgx2-lgxl)
式中tl、t2分別代表培養時間，xl、x2分別代表不同時間合生元的OD值；
4、黃芪多糖-枯草芽孢桿菌菌液活菌數檢測利用平板菌落計數法對黃芪多糖-枯草芽孢桿菌菌液活菌數進行檢測。本發明提供的黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備エ藝如下
1、以營養肉湯培養基，加入黃芪多糖，使黃芪多糖的含量為f2 mg-mr1，最佳為I. 5mg*mL 1 ；
2、將活化后的枯草芽孢桿菌菌液以容量比1%的接種量接種于含量為Hmgmr1的黃芪多糖液體培養基中，置37°C、120 r-min^1培養箱中振蕩培養，4. 5飛h后取出，最適培養時間為5. 5 h，即得深黃色的黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元產品。本發明提供的黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元的應用每天灌喂一次，灌喂量10 16 mL。本發明的積極效果
I、科學選取黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備參數，實現制備エ藝優化，確保合生元產品的使用效果；2、用量小，黃芪多糖最佳添加濃度為I.5mg mじ1，枯草芽孢桿菌菌量為I. 25X IO8mじ1，本發明制備的微生態制劑的原料用量不會對動物本身產生毒副作用，同時也不會増加生產成本；
3、本發明的黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元菌液中活菌數為IO9CFU-mr1以上，活菌數較高。


圖I是枯草芽孢桿菌(ACCC11025) 32で與37で的生長曲線示意圖。圖2是不同時間段合生元菌液中枯草芽孢桿菌的代時示意圖。
具體實施方式
(I)生長曲線繪制及培養溫度的確定
在無菌實驗室中，按I %容量比例的接菌量將活化后的枯草芽孢桿菌液接種于裝有50mL營養肉湯培養基(市場銷售)的100 mL錐形瓶中，分別于32で、120 nmirT1和37で和120 rmirr1的條件下振蕩培養，隔0. 5 h取樣I次，連續培養12h，于540 nm下測定其吸光度，以時間(h)為橫坐標、吸光度(0D值)為縱坐標繪制曲線(見圖1)，根據生長曲線確定枯草芽孢桿菌培養最佳溫度。由圖I可見，該菌株在37で和32で都能良好的生長，但37で條件下的枯草芽孢桿菌的生長情況要優于32で。因此培養該菌株的最佳溫度為37で。本發明所述的枯草芽孢桿菌活化后用平板菌落計數法計算細菌數，確定含菌量為I. 25 X IO8 CFU*mじ1。(2)黃芪多糖最適添加量的確定
考察在不同黃芪多糖稀釋濃度以及不同的培養時間下枯草芽孢桿菌ACCC11025的生長情況。以營養肉湯培養基，加入不同比例的黃芪多糖，使黃芪多糖的濃度分別為0mg.mLベ，I mg*mL_1,1. 5 mg*mじ1, 2 mg.mL'將姆個濃度的培養基分裝入3個100 mL錐形瓶中，每瓶50mL，115で滅菌15 min后作為實驗用培養基。將活化后的枯草芽孢桿菌菌液以容量比例1%的接種量分別加入上述含不同濃度的黃芪多糖液體培養基中，置37で、120 !■ min—1培養箱中振蕩培養，分別在4h，4. 5h，5h，
5.5h,6h,6. 5h,7 h采樣,于540 nm下測定其吸光度(以黃苗多糖濃度為0 mgじ1培養基組為空白對照組)(見表I)。
權利要求
1.一種黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備參數的優選方法，其特征是 a、生長曲線及培養溫度的確定將活化后的枯草芽孢桿菌ACCC11025菌液以容量比1%的接種量接種于營養肉湯培養基中，分別于32 0C >120 rmirr1和37 °〇和120 rmirT1的條件下培養，隔O. 5 h取樣I次，連續培養12h，于540 nm下測定其吸光度，以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制生長曲線，確定培養溫度； b、黃芪多糖最適添加量的確定以營養肉湯培養基，加入不同比例的黃芪多糖，使黃芪多糖的濃度分別為0 mg.mL'l mg mL_1>l. 5 mg mL_1>2 mg·!!!!/1,將每個濃度的培養基分裝入3個容器瓶中，每個容器瓶中的液體相等，115 °C滅菌15 min后作為實驗用培養基； 將活化后的枯草芽孢桿菌菌液以容量比1%的接種量分別加入上述含不同濃度的黃芪多糖液體培養基中，置37 0C>120培養箱中振蕩培養，分別在4h、4. 5h、5h、5.5h、.6h、6. 5h、7 h時采樣,于540 nm下測定其吸光度，以確定黃苗多糖最適添加量； C、黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元最適培養時間的確定將黃芪多糖的最適添加量確定好后，根據測量的最適添加濃度組的OD值，利用公式計算代時G，從而根據枯草芽孢桿菌在每個時間段的代時以確定他們的最適培養時間；G =(t2-tl)/3. 322(lgx2-lgxl) 式中tl、t2分別代表培養時間，χ1>χ2分別代表不同時間合生元的OD值； d、黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元菌液活菌數檢測利用平板菌落計數法對黃芪多糖-枯草芽孢桿菌菌液活菌數進行檢測。
2.一種如權利要求I所述黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備參數的優選方法的制備工藝如下 a、以營養肉湯培養基，加入黃芪多糖，使黃芪多糖的含量為廣2mg-πιΓ1 ； b、將活化后的枯草芽孢桿菌菌液以容量比1%的接種量接種于含量為f2 mgmr1的黃芪多糖液體培養基中，置37°C、120 PmirT1培養箱中振蕩培養，4. 5飛h后取出，即得深黃色的黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元產品。
3.根據權利要求2所述的黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備參數的優選方法的制備工藝，其特征是營養肉湯培養基中的黃芪多糖的最佳含量為I. 5 mg-mL-1 ;枯草芽孢桿菌接種于黃芪多糖液體培養基中在37 0C>120 PmirT1培養箱中振蕩培養，最適培養時間為.5. 5 h0
4.一種如權利要求2所述黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備工藝的應用每天灌喂一次，灌喂量10 16 mL。
全文摘要
一種黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元制備參數的優選方法、制備工藝及應用，將活化后的枯草芽孢桿菌ACCC11025菌液以容量比1%接種于含1~2mg mL-1黃芪多糖的液體培養基中，分別置37℃、120r min-1培養箱中振蕩培養，培養4.5~6h。該發明的黃芪多糖-枯草芽孢桿菌合生元可以顯著提高動物的日增重，降低料重比和腹瀉率，對動物的生長性能有顯著改善作用。
文檔編號C12N1/20GK102696879SQ201210066560
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月14日 優先權日2012年3月14日
發明者劉顯軍, 文宇婷, 樸鐘云, 杜欣, 邊連全, 陳靜 申請人:沈陽農業大學