專利名稱：絲膠蛋白替代血清的細胞培養基的制作方法
技術領域：
本發明屬于細胞培養基領域，特別涉及一種絲膠蛋白替代血清的細胞培養基。
背景技術：
牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基，含有豐富的細胞生長必需的營養成份，具有極為重要的功能。血清提供能促使細胞指數生長的激素、基礎培養基中沒有或含量微小的營養物，以及低分子營養物。胎牛血清是心臟穿刺取血，新生牛(10 14天)和小牛(10個月內)血清是靜脈取血。血清采集條件必須符合工業生產的標準低溫下采集、一次分離、分離后立即混合凍存。牛血清在制備的時候首先需要熱滅活，在56 °C水浴中嚴格控溫30分鐘除去對于細胞生長有害的物質；其次血清通過層析的方法去除IgG，再次除去葡萄糖，然后射線滅菌、多次過濾滅菌。整個流程極其復雜，造價高昂，而且血清中可能帶有朊病毒，血清的批次也缺少穩定性。絲膠(sericin)是構成蠶絲纖維外層組織的蛋白質。絲膠對包裹在其內部的絲素起著保護和粘接的作用。絲膠具有水溶性，易溶于熱水、酸、堿溶液中。組成絲膠的多數氨基酸含有羥基、羧基、氨基等極性較強的側基，總量占整體的三分之二，其中絲氨酸和天冬氨酸就分別占33 %和17%。鱗翅目香蛾科的家香Bombyx mori成苗的絲和大香蛾科Saturniidae某些屬的野生大蠶蛾成的繭可以用來制備絲膠。除家蠶外，本發明涉及的可以制備絲膠的資源主要有天香(Antheraea yamamai ；giant silkworm ；Japanese oak silkmoth);中國作香(Antheraea pernyi ；tussah ；Chinese oak silkmoth),玻拍香(Antheraea assama ； muga silkworm);印度昨蠶(Antheraea proylei);山蠶(Antheraea roylei);塔色蠶 (Antheraea mylitta ；Tasar silkworm);蓖麻香(Samia Cynthia ；eri-silkworm),柳蠶(Ctias selene),烏桕大蠶蛾(Attacus atlas),黃目天蠶屬(Caligula),透目天蠶屬 (Rhodinia)等一些吐絲能力較強的絹絲昆蟲。

發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是針對動物細胞培養用血清價格昂貴、又易攜帶病毒、批次穩定性差的不足，提供一種可以代替血清的動物細胞培養添加劑及含有該添加劑的細胞培養基。經過廣泛的研究和反復的試驗，本發明人發現絲膠蛋白用于細胞培養基中能夠促進細胞生長，絲膠蛋白替代或者部分代替細胞培養基中的血清后，細胞也能正常生長或者生長的更旺盛，從而完成了本發明。本發明的技術方案如下一種細胞培養基，包括基礎培養基和營養添加劑，其特征在于，所述的營養添加劑是20 2000 μ g/ml絲膠蛋白。本發明中，絲膠蛋白在本發明的細胞培養基中的濃度可以是20 2000μ g/ml，也可以是10 500 μ g/ml或者10 200 μ g/ml。
本發明中，所述的基礎培養基是各種常規的用于動物細胞培養的合成培養基，這些培養基加入牛血清后即可用于細胞的培養。這些培養基都是本發明可以采用的基礎培養基。所述的基礎培養基包括RPMI 1640、01^、]\^] 、01^]\1、或者擬1 12，優選1^]\0 1640。本發明所述的絲膠蛋白包括家蠶絲膠蛋白、柞蠶絲膠蛋白、蓖麻蠶絲膠蛋白、天蠶絲膠蛋白、琥珀蠶絲膠蛋白、柳蠶絲膠蛋白、烏桕大蠶蛾絲膠蛋白中的一種或多種。本發明中，所述的細胞培養基較佳的還包括牛血清。牛血清的濃度優選 O. 5% -15% (Wt)，優選O. 5%-10% (Wt)，更優選O. 5%-5% (wt)。所述的牛血清包括胎牛血清、新生牛血清或者成牛血清，優選胎牛血清。本發明的一較佳實例是一種細胞培養基，由基礎培養基、5% -15% (wt)牛血清和10 500 μ g/ml絲膠蛋白組成。其中，所述的基礎培養基如上所述，最優選RPMI 1640。 所述的牛血清如上所述，優選胎牛血清。相對于由基礎培養基和5%-15% (wt)牛血清組成的細胞培養基來說，該細胞培養基可以促進細胞生長代謝、促進細胞生長。本發明的另一較佳實例是一種細胞培養基，由基礎培養基、O. 5% -10% (wt)牛血清和10 200 μ g/ml絲膠蛋白組成。其中，所述的基礎培養基如上所述，最優選RPMI 1640。所述的牛血清如上所述，優選胎牛血清。相對于由基礎培養基和5%-15% (wt)牛血清組成的細胞培養基來說，該培養基可使細胞正常生長。本發明的再一較佳實例是一種細胞培養基，由基礎培養基和20 2000 μ g/ml絲膠蛋白組成。其中，所述的基礎培養基如上所述，最優選RPMI 1640。相對于由基礎培養基和5%-15% (wt)牛血清組成的細胞培養基來說，該培養基可使細胞正常生長。本發明所述的細胞培養基優選液體培養基。本發明所述細胞培養基的制備方法是常規方法，將各原料混合后，除菌即可。除菌方法是常規高溫滅菌方法滅菌或者過濾除菌法。本發明還提供絲膠蛋白在配制細胞培養基中作為細胞培養基用血清的替代物的應用。本發明還提供絲膠蛋白在配制細胞培養基中作為促進細胞生長調節劑的應用。本發明所述的細胞是指動物細胞，非植物、非微生物細胞，包括哺乳動物細胞系、 細胞株、原代細胞、組織培養細胞、干細胞；人類細胞、細胞株、細胞系、原代細胞、干細胞、組織培養細胞。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現有技術，本發明的有益效果如下本發明使用絲膠蛋白能促進細胞生長。 本發明使用絲膠替代血清,極大地降低了成本,提高了細胞培養體系的穩定性,避免了血清帶來的污染，具有重要的應用價值。


以下結合

本發明的特征和有益效果。圖I是細胞AGS生長曲線圖。圖2是細胞LCL生長曲線圖。
具體實施例方式
4
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下述實施例中未注明的具體技術或條件，均為常規技術或條件，或按照本領域內的文獻所描述的技術或條件， 或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。所述的百分比若無特殊說明是指質量百分比。實施例I制備絲膠蛋白溶液將純度超過92 %的絲膠蛋白溶解在水或者PBS緩沖液中，得濃度大于100mg/ml絲膠儲存液。該儲存液通過常規高溫滅菌方法滅菌或者O. 2 μ m過濾器過濾滅菌后使用。實施例2MTT法測定絲膠蛋白對細胞的增殖作用實驗條件細胞AGS (人胃癌細胞系，購買自Sigma，產品編號89090402)(圖I)和細胞LCL (人淋巴母細胞，購買自中科院昆明動物所細胞庫)(圖2)，以不同培養基培養，細胞培養條件為37°C，5%二氧化碳。培養24小時和48小時后，測定增殖情況，結果見圖I和圖2。所用的培養基見下列a-h所示。其中FBS為胎牛血清，GIBCO為商業品牌，RPMI 1640 為商業化的基礎鹽培養基(以下簡稱1640)。總共測試三批絲膠蛋白，第一批提取自家蠶，
第二批提取自柞蠶，第三批提取自蓖麻蠶，提取方法與家蠶絲膠蛋白提取方法相同。
a, 10% FBS(GIBCO)+1640。
b, 10% FBS(國產)+1640。
c,絲膠蛋白第一批30 μ g/mL+1640。
d,絲膠蛋白第一批30 μ g/mL+0. 5% FBS(GIBCO)。
e，絲膠蛋白第--批 30 μ ;g/mL+0. 5% FBS (國產)。
f，絲膠蛋白第二二批 30 μ ;g/mL+1640ο
g，絲膠蛋白第三Ξ批 30 μ ;g/mL+1640ο
h,1640。
實施例3
實驗條件同實施例2，直接在細胞培養基(10% FBS+MEM和I-MDM)中加入上述
絲膠儲存液，使絲膠蛋白的終濃度在一定范圍內。使用人宮頸癌細胞系(Hela)、人T淋巴細胞系(H9)、人羊膜細胞系(Wish)、中國倉鼠卵巢細胞系(CHO-Kl)、人乳腺癌細胞 (MDA-MB-231)、人肺癌細胞系(SPC-Al)和豬腎細胞系(PK-15)。放置于正常環境培養 (37°C，5 % 二氧化碳)。結果，終濃度為10 500 μ g/ml的絲膠能夠促進細胞生長。實施例4實驗條件同實施例2，將上述絲膠儲存液加入細胞培養基(FBS+1640、MEM和 I-MDM)中，使絲膠蛋白的終濃度在一定范圍內，同時減少細胞培養體系中的血清用量。使用人宮頸癌細胞系(Hela)、人T淋巴細胞系(H9)、人羊膜細胞系(Wish)、中國倉鼠卵巢細胞系(CHO-Kl)、人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)、人肺癌細胞系(SPC-Al)和豬腎細胞系(PK-15)。 放置于正常環境培養(37°C，5%二氧化碳)。結果，在絲膠終濃度為10 200 μ g/ml的范圍內，血清終濃度可以低至O. 5%，細胞生長正常。可見使用絲膠代替部分血清培養細胞。實施例5實驗條件同實施例2，將上述絲膠儲存液加入細胞培養基(1640、I-DM)和MEM培養基中，使絲膠蛋白的終濃度在一定范圍內，完全不加血清。使用人宮頸癌細胞系(Hela)、 人T淋巴細胞系(H9)、人羊膜細胞系(Wish)、中國倉鼠卵巢細胞系(CHO-Kl)、人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)、人肺癌細胞系(SPC-Al)和豬腎細胞系(PK-15)。放置于正常環境培養 (37°C，5%二氧化碳)。結果，絲膠終濃度為20 2000 μ g/ml，完全不加血清，細胞生長正常。由此可知，使用絲膠能夠全部取代血清培養細胞。應理解，在閱讀了本發明的上述內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種細胞培養基，包括基礎培養基和營養添加劑，其特征在于，所述的營養添加劑是 20 2000 μ g/ml絲膠蛋白。
2.如權利要求I所述的細胞培養基，其特征在于，所述的細胞培養基還包括 O. 5wt% _15界1:%牛血清。
3.如權利要求I所述的細胞培養基，其特征在于，該細胞培養基由基礎培養基、 5wt% _15界1:%牛血清和10 500 μ g/ml絲膠蛋白組成。
4.如權利要求I所述的細胞培養基，其特征在于，該細胞培養基由基礎培養基、 O. 5wt% -IOwt %牛血清和10 200 μ g/ml絲膠蛋白組成。
5.如權利要求I所述的細胞培養基，其特征在于，該細胞培養基由基礎培養基和20 2000 μ g/ml絲膠蛋白組成。
6.如權利要求I所述的細胞培養基，其特征在于，所述的基礎培養基是RPMI1640、 DME、MEM、DMEM、或者 HAM F12。
7.如權利要求I所述的細胞培養基，其特征在于，所述的絲膠蛋白包括家蠶絲膠蛋白、 昨蠶絲膠蛋白、蓖麻蠶絲膠蛋白、天蠶絲膠蛋白、琥拍蠶絲膠蛋白、柳蠶絲膠蛋白、烏桕大蠶蛾絲膠蛋白中的一種或多種。
8.如權利要求1-7所述的細胞培養基在細胞培養中的應用。
9.絲膠蛋白在配制細胞培養基中作為細胞培養基用血清的替代物的應用。
10.絲膠蛋白在配制細胞培養基中作為促進細胞生長調節劑的應用。
全文摘要
本發明公開了絲膠蛋白替代血清作為細胞培養基添加劑的新用途以及含有絲膠蛋白替換血清的細胞培養基，其包括基礎培養基和營養添加劑，所述的營養添加劑是20～2000μg/ml絲膠蛋白。傳統細胞培養中通常添加牛血清，但是牛血清大多靠進口，價格高，批次之間質量穩定性差，無法高溫滅菌，可能含有嚴重病毒如支原體和瘋牛病毒等，對細胞培養具有重大風險。本發明使用絲膠替代血清，極大地降低了成本，提高了細胞培養體系的穩定性，避免了血清帶來的污染，具有重要的應用價值。
文檔編號C12N5/07GK102604885SQ20121007840
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者段子淵, 王文, 王金煥, 董揚, 陳壘 申請人:王文, 董揚