體外軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種體外軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括：獲取軟骨細(xì)胞樣本；將軟骨細(xì)胞樣本進(jìn)行原代培養(yǎng)；將原代培養(yǎng)所得的軟骨細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并在待傳代培養(yǎng)至軟骨細(xì)胞匯合度達(dá)到70～80％時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基并加入萊菔硫烷(SFN)對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行處理。采用本發(fā)明的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，先通過原代培養(yǎng)在初期使其形態(tài)和特異分子表達(dá)水平最大化地維持與機(jī)體內(nèi)相同，使其能更好地顯示與親體組織緊密結(jié)合的形態(tài)學(xué)特征；之后再通過傳代培養(yǎng)進(jìn)行大量增殖，并且在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)采用SFN進(jìn)行退化抑制，有效緩解軟骨細(xì)胞體外單層培養(yǎng)時(shí)的退化現(xiàn)象，為臨床用軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)提供一種新的優(yōu)良方法。
【專利說明】體外軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于體外組織細(xì)胞定向培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種體外軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在機(jī)體中，軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞類型，其主要功能是通過分泌II型膠原(type II collagen)及蛋白多糖(aggrecan，Acan)等保持關(guān)節(jié)軟骨的功能。在正常生理?xiàng)l件下，軟骨細(xì)胞的合成和分解代謝維持著動(dòng)態(tài)平衡；而發(fā)生軟骨缺損和骨關(guān)節(jié)炎(OA)時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨組織受到多種因子的作用，關(guān)節(jié)軟骨損傷和修復(fù)之間的穩(wěn)態(tài)被破壞，軟骨的分解代謝明顯大于合成代謝，表現(xiàn)為二型膠原和蛋白多糖的降解大于合成，其中二型膠原通常被基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)所降解，而蛋白多糖則由ADAMTS家族所降解。
[0003]對(duì)于軟骨缺損的治療方法中，現(xiàn)有較為理想的是采用自體軟骨細(xì)胞移植(ACI)以及基質(zhì)介導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)(MACI)，將選自體內(nèi)的正常軟骨細(xì)胞在體外進(jìn)行定向(細(xì)胞)培養(yǎng)后，再移植至機(jī)體內(nèi)的軟骨損傷處。而其中的難點(diǎn)在于，軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)過程中，由于失去了機(jī)體內(nèi)特定的增殖環(huán)境以及本身細(xì)胞的全能性因素，所以軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖速度較慢以及伴隨著退變現(xiàn)象，如二型膠原COLII表達(dá)下降、一型膠原COLI表達(dá)上升、MMPs表達(dá)上升及COLX表達(dá)上升等，使得體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞回植后常常形成纖維軟骨，使得軟骨的機(jī)械性能下降，導(dǎo)致進(jìn)行透明軟骨修復(fù)的效果達(dá)不到預(yù)期，成為影響治療的長期效果的一個(gè)主要問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能在體外維持與機(jī)體內(nèi)軟骨細(xì)胞特異性分化和表達(dá)水平相同的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下:
[0006]一種體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0007]獲取軟骨細(xì)胞樣本；
[0008]將所述軟骨細(xì)胞樣本進(jìn)行原代培養(yǎng)；
[0009]將原代培養(yǎng)所得的軟骨細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并在待傳代培養(yǎng)至軟骨細(xì)胞匯合度達(dá)到70?80%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基并加入萊菔硫烷對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行處理。
[0010]采用本發(fā)明的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，先通過原代培養(yǎng)在初期使其形態(tài)和特異分子表達(dá)水平等最大化地維持與機(jī)體內(nèi)相同，使其能更好地顯示與親體組織緊密結(jié)合的形態(tài)學(xué)特征；之后再通過傳代培養(yǎng)進(jìn)行大量增殖，并且在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)采用SFN進(jìn)行退化抑制，有效緩解軟骨細(xì)胞體外單層培養(yǎng)時(shí)的退化現(xiàn)象，為臨床用軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)提供一種新的優(yōu)良方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中:
[0012]圖1為本發(fā)明實(shí)施例原代培養(yǎng)細(xì)胞PO顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)圖；
[0013]圖2為本發(fā)明實(shí)施例第一次傳代培養(yǎng)細(xì)胞Pl顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)圖；
[0014]圖3為本發(fā)明實(shí)施例第二次傳代培養(yǎng)細(xì)胞P2顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)圖；
[0015]圖4為本發(fā)明實(shí)施例原代培養(yǎng)細(xì)胞PO甲苯胺藍(lán)染色后的形態(tài)結(jié)果圖；
[0016]圖5為本發(fā)明實(shí)施例第一次傳代培養(yǎng)細(xì)胞Pl甲苯胺藍(lán)染色后的形態(tài)結(jié)果圖；
[0017]圖6為本發(fā)明實(shí)施例第二次傳代培養(yǎng)細(xì)胞P2甲苯胺藍(lán)染色后的形態(tài)結(jié)果圖；
[0018]圖7為本發(fā)明實(shí)施例傳代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞SFN處理后Col2al蛋白基因的表達(dá)水平結(jié)果圖；
[0019]圖8為本發(fā)明實(shí)施例傳代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞SFN處理后Collal蛋白基因的表達(dá)水平結(jié)果圖；
[0020]圖9為本發(fā)明實(shí)施例傳代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞SFN處理后C0L2A1/C0L1A1表達(dá)結(jié)果圖；
[0021]圖10為本發(fā)明實(shí)施例中分別選用不同濃度SFN的培養(yǎng)基培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞MMP13的表達(dá)差異對(duì)比圖；
[0022]圖11為本發(fā)明實(shí)施例中采用8 μ M的SFN對(duì)傳代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞處理后C0L2A1/COLlAl表達(dá)差異對(duì)比圖；
[0023]圖12為本發(fā)明實(shí)施例不同濃度SFN處理軟骨細(xì)胞后I型膠原免疫熒光染色結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0025]本發(fā)明實(shí)施例提供一種體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，培養(yǎng)方法的細(xì)節(jié)實(shí)施過程，包括如下步驟:
[0026]S10，獲取軟骨細(xì)胞樣本；
[0027]S20，將軟骨細(xì)胞樣本用培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)；
[0028]S30，將原代培養(yǎng)所得的軟骨細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
[0029]S40，待傳代培養(yǎng)中軟骨細(xì)胞匯合度達(dá)到70?80%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基并加入SFN ；
[0030]S50，在SFN下傳代培養(yǎng)至軟骨細(xì)胞匯合度為80?90%時(shí)，收集細(xì)胞。
[0031]在本發(fā)明中，采用將獲取的軟骨細(xì)胞樣本先進(jìn)行原代培養(yǎng)，在該階段內(nèi)獲取的軟骨細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)。因此在這一時(shí)期進(jìn)行原代培養(yǎng)，使其形態(tài)和表達(dá)水平等最大化地維持與機(jī)體內(nèi)相同，使其能更好地顯示與親體組織緊密結(jié)合的形態(tài)學(xué)特征。
[0032]在步驟S20的原代培養(yǎng)過程之后，步驟S30中進(jìn)一步進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過在其細(xì)胞的形態(tài)和特異結(jié)合性等方面的維持下，進(jìn)行大量傳代。同時(shí)，在傳代的過程中對(duì)于細(xì)胞的特異性分化形態(tài)的定向維持通過步驟S40中的時(shí)機(jī)和SFN處理進(jìn)行。
[0033]本身SFN(l-1soth1cyanato-4_methylsulphinylbutane，萊菔硫燒)是一種從十字花科植物中提取的異硫氰酸酯，在西蘭花中尤為豐富，具有抗炎癥、抗腫瘤等作用。SFN能抑制軟骨細(xì)胞中的MMPs的表達(dá)，降低其對(duì)軟骨基質(zhì)的降解作用，亦有體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明SFN能保護(hù)軟骨組織，具有阻止或減緩OA的發(fā)生發(fā)展的作用。本發(fā)明中，重點(diǎn)在于SFN對(duì)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞特性的維持，培養(yǎng)過程中加入SFN用于抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，從而進(jìn)一步抑制II型膠原的降解；在這一情形下，傳代細(xì)胞在增殖的過程中由于II型膠原的降解被抑制，會(huì)進(jìn)一步影響軟骨細(xì)胞本身的兩種膠原的表達(dá)量比，抑制體外原本應(yīng)當(dāng)大量表達(dá)的I型膠原C0LI，從而使細(xì)胞的分化維持于與原始機(jī)體內(nèi)最為接近的程度。同時(shí)，在培養(yǎng)的過程中需要對(duì)退化的程度進(jìn)行控制，在本發(fā)明選為70?80%匯合成時(shí)機(jī)，因?yàn)樵谘绣持蠹?xì)胞一代中約能倍增3?6次，相鄰的上下代間最容易發(fā)生退化，傳代越長退化程度越高。因此在本發(fā)明中選擇在約70?80%匯合成時(shí)對(duì)其進(jìn)行，使其未達(dá)到退化發(fā)生程度即進(jìn)行誘導(dǎo)，大大降低其脫分化的可能。
[0034]最后步驟S50中在誘導(dǎo)中繼續(xù)培養(yǎng)，直至軟骨細(xì)胞匯合度為80?90%時(shí)，增殖的細(xì)胞數(shù)量足夠下，即可收集細(xì)胞。或者在數(shù)量不夠的情形下，可以繼續(xù)于添加有SFN的新鮮培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
[0035]同時(shí)，在本發(fā)明上述步驟的實(shí)施過程中，為了避免在培養(yǎng)過程中有其他的雜菌的生長，采用原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為DMEM/F12 (Hyclone)培養(yǎng)基，并且在該DMEM/F12 (Hyclone)培養(yǎng)基中還添加有培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清FBS、I %雙抗及I % a -MEM非必需氨基酸。本發(fā)明采用的該培養(yǎng)基，添加有胎牛血清FBS其有利于細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上，維持傳代過程中細(xì)胞的局部生長密度，避免在增殖過程中細(xì)胞的分散不均勻?qū)е戮植勘Ｃ芏雀撸霈F(xiàn)傳代生長慢和退化的情形；同時(shí)其本身還能有結(jié)合蛋白質(zhì)能與熱原質(zhì)結(jié)合的能力，因此在培養(yǎng)過程能與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等結(jié)合，從而降低軟骨細(xì)胞的II型膠原的降解水平，維持分化的程度。同時(shí)，添加雙抗(青霉素和鏈霉素)抑制其它的雜菌的生長，保證培養(yǎng)過程中細(xì)胞的單純性。
[0036]并且，在上述實(shí)施方式中，傳代培養(yǎng)過程中按照1:3的比例進(jìn)行傳代，因?yàn)楸旧韽臋C(jī)體內(nèi)獲取的軟骨細(xì)胞在原代培養(yǎng)之后，本身具有一定程度的密度依賴性，如果細(xì)胞密度不夠，細(xì)胞就不容易生長，甚至很快會(huì)死亡；而如果傳代的比例大于1:3之后，本身密度太大，細(xì)胞生長太快，會(huì)降低每一代中的增殖倍數(shù)。
[0037]進(jìn)一步在上述實(shí)施方式中，在步驟S20和步驟S30之間還包括將原代培養(yǎng)的細(xì)胞用胰蛋白酶處理的步驟，細(xì)胞在原代培養(yǎng)之后，會(huì)貼壁生長，其形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，采用胰蛋白酶的處理可以使細(xì)胞變回最佳的圓形狀態(tài)，從顯微鏡下觀察為細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增加，從培養(yǎng)瓶壁上脫落，從而進(jìn)行傳代。
[0038]為了保證培養(yǎng)的準(zhǔn)確性，在步驟S50之后還包括S60:對(duì)體外培養(yǎng)獲得的細(xì)胞進(jìn)行檢測的過程，除了普通傳統(tǒng)的軟骨細(xì)胞形態(tài)顯微鏡觀察之外，還可以采用如下手段進(jìn)行:具體可以包括采用根據(jù)軟骨細(xì)胞的特異標(biāo)志分子基因表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，以及軟骨細(xì)胞特異性的分子的蛋白(即上述C0L2al/C0Llal等等)表達(dá)含量的特異標(biāo)志蛋白免疫熒光檢測；可以分別采用如下步驟進(jìn)行。
[0039]S60a，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測驗(yàn)證:
[0040]S61a，收集步驟S50培養(yǎng)獲得的細(xì)胞體；
[0041]S62a，用Trizol裂解細(xì)胞，提取待測RNA ；
[0042]S63a，以待測RNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，檢測Col2al、Collal、Coll0al、MMP13等相關(guān)基因的表達(dá)水平。
[0043]以及，
[0044]S60b，蛋白免疫熒光染色法檢測:
[0045]S61b，收集步驟S50培養(yǎng)獲得的細(xì)胞體；
[0046]S62b，用4 %多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定；
[0047]S63b，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測特異標(biāo)志分子的蛋白表達(dá)情況。
[0048]采用本發(fā)明的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，先通過原代培養(yǎng)在初期使其在體內(nèi)的形狀和特異分子表達(dá)最大化地維持與機(jī)體內(nèi)相同，使其能更好地顯示與親體組織緊密結(jié)合的形態(tài)學(xué)特征；之后再通過傳代培養(yǎng)進(jìn)行大量增殖，并且在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)采用SFN進(jìn)行退化抑制，有效緩解軟骨細(xì)胞體外單層培養(yǎng)時(shí)的退化現(xiàn)象，為臨床用軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)提供一種新的優(yōu)良方法。
[0049]為使本領(lǐng)域技術(shù)人員能更進(jìn)一步明確知悉本發(fā)明上述方法的細(xì)節(jié)實(shí)施過程以及使體外培養(yǎng)過程中抑制退化的效果能真實(shí)體現(xiàn)，以下通過實(shí)施例進(jìn)行舉例說明。
[0050]實(shí)施例1
[0051]在該實(shí)施例1中基于實(shí)施過程需要，實(shí)施中使用的儀器設(shè)備如下:蘇州凈化二級(jí)安全柜、Thermal Scientific Series II細(xì)胞培養(yǎng)箱、Miulab MTH-100恒溫混勾儀、Leica DMIL LED 倒置顯微鏡、Thermal Scientific Multiscan GO 化學(xué)發(fā)光儀、AppliedB1systems Veriti 96-well Thermal Cycler PCR儀、Applied B1systems ViiA7 焚光定量PCR儀、Eppendorf 5804 R離心機(jī)。實(shí)施過程按如下步驟進(jìn)行:
[0052]S11，經(jīng)倫理委員會(huì)同意及患者知情，取關(guān)節(jié)置換患者膝關(guān)節(jié)軟骨組織作為培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞；
[0053]S12，將獲取的軟骨組織于添加雙抗(青霉素、鏈霉素)的生理鹽水中(50ml離心管)振蕩清洗3次后；倒入1cm的培養(yǎng)皿中，以手術(shù)刀片將片狀軟骨組織切成Immxlmm大小，轉(zhuǎn)移至15cmEP管中；
[0054]S13，向步驟S12的EP管中加入2.25ml無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基及250ull0mg/mL的II型膠原酶，使終濃度達(dá)到lmg/ml，于恒溫混勻儀上37°C震蕩(700r/min)消化6小時(shí)，得消化產(chǎn)物；
[0055]S14，用40 μΜ過濾網(wǎng)篩過濾去除步驟S13的消化產(chǎn)物中的碎肩及未消化的軟骨殘?jiān)蝗缓笥?5mL離心管收集濾過細(xì)胞，在離心機(jī)上離心(1000r/min，5min)棄上清液，所獲得的離心沉淀即為細(xì)胞體；
[0056]將細(xì)胞體用ImL軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞懸液均勻，觀察并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；其中在該步驟中采用的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液即為液體DMEM/F12 (Hyclone)培養(yǎng)基，并且在該DMEM/F12(Hycl0ne)培養(yǎng)基中還添加有培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 %胎牛血清FBS、I %雙抗及1% a -MEM非必需氨基酸；同時(shí)之后的傳代培養(yǎng)中也采用該培養(yǎng)基。
[0057]S20，通過步驟S14的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，調(diào)整細(xì)胞密度，以5 X 14/孔細(xì)胞密度接種于6孔板中，置于37°C、5% 0)2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；72小時(shí)后視細(xì)胞貼壁情況更換培養(yǎng)液，以后每隔3天換培養(yǎng)液，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況以及形態(tài)特征，待軟骨細(xì)胞匯合度為80?90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
[0058]S31，將步驟S20的原代培養(yǎng)的細(xì)胞以PBS清洗2遍，吸除PBS后加入0.25%的胰蛋白酶7滴，室溫下靜置消化2?5分鐘，待細(xì)胞變圓形(顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞重新變成圓形，細(xì)胞間隙增加)，此時(shí)迅速而輕柔地吸除胰蛋白酶溶液(不使瓶底細(xì)胞隨胰蛋白溶液流失)；
[0059]S32，將步驟S31的細(xì)胞中用新鮮軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液吹打細(xì)胞使其散開成細(xì)胞懸液，按1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞生長情況并拍照，每3天換液I次；
[0060]S40，當(dāng)步驟S32中傳代培養(yǎng)至軟骨細(xì)胞匯合度達(dá)到約70%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基并加入8 μ M SFN處理細(xì)胞24小時(shí)；
[0061]S50，將步驟S40SFN處理后的軟骨細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞生長情況，隔2天拍照一次記錄；至匯合度為80?90%時(shí)，收集細(xì)胞。
[0062]S61a，將步驟S50中獲得的培養(yǎng)培養(yǎng)產(chǎn)物接種于6孔板中，棄6孔板中細(xì)胞上清后，加入Iml Trizol(Invitrogen)裂解細(xì)胞，吹吸均勻后轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，保存在-20度冰箱待用；
[0063]S62a，以步驟S61中提取的RNA為模板，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測軟骨細(xì)胞特異標(biāo)志分子及相關(guān)基因表達(dá)水平，其中，包括(:012&1、(:011&1、(:0110&1、麗?13的表達(dá)水平。
[0064]或者，S61b，將步驟S50中獲得的培養(yǎng)培養(yǎng)產(chǎn)物接種于6孔板中，棄6孔板中細(xì)胞上清，以PBS清洗3次，加入Iml 4%多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，4度冰箱過夜；第二天，以PBS清洗3次，加入2ml PBS，保存在4度冰箱待用；
[0065]S62b，將步驟S61中多聚甲醛處理后的細(xì)胞，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測特異標(biāo)志分子的蛋白表達(dá)情況。
[0066]按照本發(fā)明的上述方法步驟所進(jìn)行的檢測的過程，用顯微鏡分別觀察步驟S20原代培養(yǎng)細(xì)胞PO的形態(tài)、以及步驟S30傳代培養(yǎng)中中第一次傳代培養(yǎng)Pl和第二次傳代培養(yǎng)P2的細(xì)胞的形態(tài)；觀察的結(jié)果拍照分別如圖1?3所示，原代軟骨細(xì)胞多呈三角形及橢圓形如圖1，隨著傳代次數(shù)增加，軟骨細(xì)胞逐漸呈梭形圖2和圖3。同時(shí)，將上述原代培養(yǎng)細(xì)胞和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞通過甲苯胺藍(lán)染色后的形態(tài)結(jié)果圖如圖4?6所示，原代軟骨細(xì)胞胞漿及基質(zhì)均著色如圖4所示，傳代后的軟骨細(xì)胞著色較弱，并從圖5和圖6中著色程度的差異可以看出，隨著傳代的代數(shù)，著色的程度之間降低。
[0067]同時(shí)，在步驟S62a中熒光PCR檢測的相關(guān)基因的表達(dá)水平如圖7?9所示，其中圖7為Col2al基因的表達(dá)水平結(jié)果、圖8為Collal基因的表達(dá)水平結(jié)果、圖9為C0L2A1/COLlAl表達(dá)結(jié)果。從檢測的結(jié)果中可以明顯看出，C0L2A1隨傳代顯著下降，COLlAl則顯著上升。
[0068]同時(shí)，在步驟S40中采用SFN處理后通過對(duì)SFN濃度的篩選，對(duì)匯合度約70%的軟骨細(xì)胞添加5?8 μΜ的SFN進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行了 MMP13、C0L2A1/C0L1A1表達(dá)水平檢測及COLII, COLI免疫熒光檢測，其檢測的數(shù)據(jù)圖表如圖10-11所示；從圖10-11的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶ΜΜΡ13的表達(dá)水平顯著降低，C0L2A1/C0L1A1顯著高于未處理組。同時(shí)，采用橫向?qū)Ρ龋瑢FN添加的濃度進(jìn)行改變，分別選用8 μ Μ、5 μ Μ，對(duì)比處理后的MMP13的表達(dá)水平差異，其結(jié)果如圖10所示。
[0069]同時(shí)將上述熒光PCR改換成免疫熒光染色法檢測，將不同濃度SFN處理軟骨細(xì)胞后一型膠原的染色免疫熒光染色結(jié)果如圖12所示。從圖12的靶蛋白的顏色檢測結(jié)果圖中COLII熒光檢測均過低，而COLI的蛋白水平與SFN的處理濃度有一定的關(guān)系，結(jié)果顯示8 μ MSFN處理后COLI的蛋白水平最低。
[0070]從上述的真實(shí)檢測的數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)隨著傳代而逐漸退化，表現(xiàn)為細(xì)胞由圓形及三角形逐漸向長梭形轉(zhuǎn)變，軟骨細(xì)胞特異的多糖及二型膠原表達(dá)顯著降低，而一型膠原表達(dá)顯著上升。但是在本發(fā)明的體外培養(yǎng)的方法過程中，經(jīng)SFN在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)處理后明顯具有非常良好的脫分化抑制的效果。
[0071]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: 獲取軟骨細(xì)胞樣本； 將所述軟骨細(xì)胞樣本進(jìn)行原代培養(yǎng)； 將原代培養(yǎng)所得的軟骨細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并在待傳代培養(yǎng)至軟骨細(xì)胞匯合度達(dá)到70?80%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基并加入萊菔硫烷對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行處理。
2.如權(quán)利要求1所述的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述新鮮培養(yǎng)基中添加的萊菔硫燒為5 μ M?8 μ M。
3.如權(quán)利要求1或2所述的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述傳代培養(yǎng)過程中按照1:3的比例進(jìn)行傳代。
4.如權(quán)利要求1或2所述的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)過程中采用的培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，且該DMEM/F12培養(yǎng)基中還添加有DMEM/F12培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清FBS、I %的雙抗及I %的a -MEM非必需氨基酸。
5.如權(quán)利要求1或2所述的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，將所述軟骨細(xì)胞樣本進(jìn)行原代培養(yǎng)之后、以及將原代培養(yǎng)所得的軟骨細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)之前，還包括將所述原代培養(yǎng)細(xì)胞用胰蛋白酶處理。
6.如權(quán)利要求1或2所述的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，將所述軟骨細(xì)胞樣本進(jìn)行原代培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)至軟骨細(xì)胞匯合度為80?90%。
7.如權(quán)利要求3所述的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述萊菔硫烷對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行處理過程之后，還包括: 將軟骨細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度為80?90%時(shí)，收集軟骨細(xì)胞的細(xì)胞體。
8.如權(quán)利要求7所述的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述收集軟骨細(xì)胞的細(xì)胞體步驟之后還包括: 檢測所述細(xì)胞體中Col2al和Collal的表達(dá)水平。
9.如權(quán)利要求8所述的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述檢測所述細(xì)胞體中Col2al和Collal的表達(dá)水平包括: 用Trizol裂解所述細(xì)胞體，提取細(xì)胞體內(nèi)的RNA ； 分別采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測Col2al和Collal基因的表達(dá)水平。
10.如權(quán)利要求8所述的體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，所述檢測所述細(xì)胞體中Col2al和Collal的表達(dá)水平包括: 將所述細(xì)胞體用多聚甲醛進(jìn)行處理； 通過蛋白免疫熒光染色法檢測多聚甲醛處理后的細(xì)胞體中Col2al和Collal的含量。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK104513806SQ201410784100
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】陳潔琳, 王大平, 段莉, 朱偉民, 黃江鴻, 陳磊, 熊建義 申請(qǐng)人:深圳市第二人民醫(yī)院