專利名稱：小麥抗白粉病基因Pm45的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子遺傳學領域，涉及小麥抗白粉病基因Pm45的分子標記及其應用。
背景技術：
小麥是全球最主要的糧食作物，在中國也是僅次水稻的第二大糧食作物。目前，世界小麥每年的產量約為6. 2億噸，提供了人類所需的1/5能量，小麥的生產關乎著人類生存。普通小麥是一個異源六倍體物種，含有A、B、D三個不同的染色體組，與小麥基因組具有同源或部分同源的野生種及原始種中蘊含了豐富的基因資源。利用小麥種質資源中優異的等位變異是實現小麥穩產、增產的關鍵因素。小麥白粉病是由子囊菌綱中高度專性寄生的禾谷白粉菌小麥?；虰lumeria graminis f. sp. tritici侵染而引起的一種氣傳病。它引起的小麥白粉病是由一種嚴重的小麥葉部病害。病菌侵染小麥后，吸收植株營養，使小麥植株的光合能力下降甚至完全喪失，最終導致成穗數、穗粒數和千粒重下降，能夠導致小麥產量損失5% 34%，嚴重時能達到45 %甚至絕收。在眾多的的小麥白粉病防治措施中，培育和推廣抗病品種最為經濟有效并且環保。當前生產上抗白粉病利用的主要是質量抗性基因。但是，由于白粉病質量抗性具有小種?；?，病原菌的無毒基因與抗性基因進行協同進化，在生產上大面積推廣使用單一抗病品種很容易導致產生新的毒性小種，從而使所攜帶的抗病基因喪失其抗性。從小麥種質資源中發掘與利用新的抗白粉基因是小麥遺傳學家和育種家們的一個長期目標與挑戰。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供小麥抗白粉病基因Pm45的分子標記。本發明的另一目的是提供該小麥抗白粉病基因Pm45的分子標記應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現小麥抗白粉病基因Pm45的分子標記，所述的分子標記選自MAG6139、MAG6140或 BARC123中的任意一種；所述的分子標記MAG6139 :左端引物序列為SEQ ID NO. 1，右端引物序列為SEQ ID NO. 2，擴增產物為880bp，此分子標記來自普通小麥種質D576DS染色體，為共顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2. O測得與Pm45基因的遺傳距離為O. 7cM ；所述的分子標記MAG6140 :左端引物序列為SEQ ID NO. 3,右端引物序列為SEQ ID NO. 4,擴增片段495bp，此分子標記來自普通小麥種質D576DS染色體，MAG6140為顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2. O測得與Pm45基因的遺傳距離為2. 7cM ；所述的分子標記BARC123 左端引物序列為SEQ ID NO. 5,右端引物序列為SEQ ID NO. 6,擴增片段420bp，此分子標記來自普通小麥種質D576DS染色體，BARC123為顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2. O測得與Pm45基因的遺傳距離為5. 2cM。所述的分子標記在小麥種質資源中抗白粉病基因的鑒定中的應用。小麥抗白粉病基因Pm45的分子標記方法，用以下的任意一對分子標記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產物I)分子標記 MAG6139 左端引物序列為SEQ ID NO. 1，右端引物序列為SEQ ID NO. 2 ；2)分子標記 MAG6140 左端引物序列為SEQ ID NO. 3，右端引物序列為SEQ ID NO. 4 ；3)分子標記 BARC123 左端引物序列為SEQ ID NO. 5,右端引物序列為SEQ ID NO. 6 ；如果用引物MAG6139能夠擴增出880bp的擴增片段，或者用引物MAG6140能夠擴增出495bp的擴增片段，或者用引物BARC123能夠擴增出420bp的擴增片段，則標志著待檢小麥存在抗白粉病基因Pm45。一種篩選抗白粉病小麥的方法，用上述的引物對之一擴增待檢小麥基因組0嫩，如果用引物MAG6139能夠擴增出880bp的擴增片段，或者用引物MAG6140能夠擴增出495bp 的擴增片段，或者用引物BARC123能夠擴增出420bp的擴增片段，則標志該待檢小麥為存在抗白粉病Pm45的抗白粉病小麥。上述小麥抗白粉病基因Pm45的分子標記可通過以下方法獲得(一)D57與揚麥158F2代的創建與表型鑒定(I)普通小麥種質D57 (61)與揚麥158(早)進行雜交得到雜種F1,F1自交產生F2 群體。(2)F2代群體單株種植于穴盤，放置溫室，白天22度14小時，晚上18度10小時。 一葉一心期接種白粉病，接種7天后進行抗性調查。鑒定結果見表I。(3)F2代單株調查后移苗大田，自交所得種子為F3家系。每個F3家系中選擇18粒進行子代測驗。鑒定結果間表I。(4)通過對F2及F2 : 3進行遺傳分析，推定抗病種質中攜帶的抗病基因的個數。( 二)多態性分子標記篩選(5)將6株抗病F2單株的葉片等量混合成抗池，6株感病F2單株的葉片等量混合成感池。用SDS法(Ma and Sorrells, 1995)提取抗病親本D57、感病親本揚麥158、抗池和感池的DNA,應用簡單重復序列標記SSR與BSA (Bulk segregant analysis)結合的方法進行多態性篩選。
(6)首先利用412對SSR引物對D57、揚麥158、抗池和感池進行多態性篩選。PCR 反應體積為 25 微升，其中 IOXbuffer 2. 5 微升，25mM MgC121. 5 微升，2. 5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5單位/微升)O. 2微升，10 μ M引物(F/R)各O. 5微升，模板DNA20 納克，加水至25微升；SSR反應體系為DNA 94°C預變性3min后，94°C變性lmin，50_65°C (視引物而定) 退火lmin，72°C延伸展lmin，循環35次，最后72°C延伸IOmin ；在PCR擴增儀上進行PCR擴增，擴增產物在8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，然后在紫外透射儀上照相，記錄結果選擇在親本間和F2代群體的R、S池間擴增出相同有多態型的引物，與Pm45連鎖的候選分子標記4對；(7)選擇分離比為3 I的F2 : 3家系D57-1和D57-2，擴大為分離群體并進行抗性鑒定及子代測驗，將上述4對分子標記在F3 : 4群體中擴增獲取群體各單株的基因型資料；(三)分子標記獲得(8)根據連鎖交換規律，利用擴增獲得的F3 : 4群體各單株基因型資料與抗性鑒定獲得的抗性資料構建4對分子標記與D57-6D基因的連鎖圖，所用軟件為Mapmaker Macintosh V 2. 0，獲得了與 Pm45 緊密連鎖的分子標記 BARC123、CFD80、CFD190 和 GDM108， 利用Mapmaker Macintosh V 2. O測得它們與Pm45基因的遺傳距離分別為5. 2cM、0. 7cM、
2.4cM 和 5. 5cM ；(9)分子標記的開發，由于上述四個標記都被定位于小麥6D染色體的6DS2bin上， 利用位于其中的EST BG262421和BE44520轉化為STS標記MAG6139和MAG6140，它們的PCR 產物分別經過RsaI和TaqI酶切后，在抗感親本及抗感池中有一致的多態，被定位到Pm45 兩側，分別距Pm450. 7cM和2. 7cM ；(四)抗譜的獲得，對含有Pm45的純系接種不同的白粉菌生理小種，結果顯示對 15個白粉病生理小種表現抗病，具有優良的抗病表現。有益效果本發明在國際上首次鑒定了一個位于小麥6DS上的抗白粉病基因Pm45，拓寬了小麥抗白粉病基因的多樣性。Pm45優異的抗病表現使得其在抗白粉病育種中有重要的價值。 并獲得了與其緊密連鎖的分子標記MAG6139、MAG6140和BARC123，可以加速抗病基因Pm45 在小麥抗病育種中的應用。I、首次鑒定了位于小麥6D染色體上的抗白粉病基因Pm45。在目前發現40個位點七十多個小麥抗白粉病基因中，還沒有位于小麥6D上的抗白粉病基因，Pm45的發現拓寬了小麥白粉病基因的多樣性。2、對Pm45的抗譜進行測定，結果顯示Pm45抗本實驗室全部15個白粉病生理小種，具有優異的抗性，是白粉病育種中優良的抗病基因。3、獲得了與小麥抗白粉病基因Pm45緊密連鎖的分子標記MAG6139、MAG6140和 BARC12 3。在所有已知的分子標記中與Pm4 5連鎖最為緊密的是MAG613 9，遺傳距離僅為
O.7cM，同時也是唯一的共顯性分子標記，能夠幫助該基因向推廣品種中轉移以及與其它抗
病基因聚合。4、鑒定方便。分子標記具有檢測方便、擴增穩定、簡便等優點。用標記MAG6139檢
5測小麥抗白粉病基因Pm45，可以確定Pm45的存在與否以及存在狀態，并預測白粉病抗性， 進而加快轉移Pm45的利用。5、本發明提出了利用小麥種質資源中抗白粉病基因的方法。


圖I分子標記擴增帶型a :BARC123擴增帶型，其中1，2，3，4分別為抗病品種D57、推廣品種揚麥158、抗池和感池，M :pUC19/MspI，箭頭所指為420bp特異擴增條帶；b :MAG6139擴增帶型，其中1，2，3，4分別為抗病品種D57、推廣品種揚麥158、抗池和感池，M :pUC19/MspI，泳道I中箭頭所指為880bp特異擴增條帶；c :MAG6140擴增帶型，其中1，2，3，4分別為抗病品種D57、推廣品種揚麥158、抗池和感池，M :pUC19/MspI，箭頭所指為495bp特異擴增條帶；圖2MAG6139、MAG6140和BARC123與小麥抗白粉病基因Pm45的遺傳連鎖圖，左邊為標記間的圖距。
具體實施例方式實施例I(一)D57與揚麥158F2代的創建與表型鑒定(I)普通小麥種質D57 (3)與揚麥158(早)進行雜交得到雜種F1, F1自交產生F2 群體。(2)F2代群體單株種植于穴盤，放置溫室，白天22度14小時，晚上18度10小時。 一葉一心期接種白粉病，接種7天后進行抗性調查。鑒定結果見表I。(3)F2代單株調查后移苗大田，自交所得種子為F3家系。每個F3家系中選擇18粒進行子代測驗。鑒定結果間表I。表lBgtl8和Bgtl9接種后揚麥158XD57F2及F2 : 3家系的抗性分離
權利要求
1.小麥抗白粉病基因Prn45的分子標記，其特征在于所述的分子標記選自MAG6139、 MAG6140或BARC123中的任意一種；所述的分子標記MAG6139 左端引物序列為SEQ ID NO. 1，右端引物序列為SEQ ID NO. 2，擴增產物為880bp，此分子標記來自普通小麥種質D576DS染色體，為共顯性分子標記， 利用Mapmaker Macintosh V 2. O測得與Pm45基因的遺傳距離為O. 7cM ；所述的分子標記MAG6140 左端引物序列為SEQ ID NO. 3，右端引物序列為SEQ ID NO. 4，擴增片段495bp，此分子標記來自普通小麥種質D576DS染色體，MAG6140為顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2. O測得與Pm45基因的遺傳距離為2. 7cM ；所述的分子標記BARC123 左端引物序列為SEQ ID NO. 5，右端引物序列為SEQ ID NO. 6，擴增片段420bp，此分子標記來自普通小麥種質D576DS染色體，BARC123為顯性分子標記，利用Mapmaker Macintosh V 2. O測得與Pm45基因的遺傳距離為5. 2cM。
2.權利要求I所述的分子標記在小麥種質資源中抗白粉病基因的鑒定中的應用。
3.小麥抗白粉病基因Pm45的分子標記方法，其特征在于用以下的任意一對分子標記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產物1)分子標記MAG6139左端引物序列為SEQ ID NO. 1，右端引物序列為SEQ ID NO. 2 ；2)分子標記MAG6140左端引物序列為SEQ ID NO. 3，右端引物序列為SEQ ID NO. 4 ；3)分子標記BARC123左端引物序列為SEQ ID NO. 5，右端引物序列為SEQ ID NO. 6 ;如果用引物MAG6139能夠擴增出880bp的擴增片段，或者用引物MAG6140能夠擴增出495bp的擴增片段，或者用引物BARC123能夠擴增出420bp 的擴增片段，則標志著待見小麥存在抗白粉病基因Pm45。
4.一種篩選抗白粉病小麥的方法,其特征在于用權利要求I所述的引物對之一擴增待檢小麥基因組DNA，如果用引物MAG6139能夠擴增出880bp的擴增片段，或者用引物 MAG6140能夠擴增出495bp的擴增片段，或者用引物BARC123能夠擴增出420bp的擴增片段，則標志該待檢小麥為存在抗白粉病Pm45的抗白粉病小麥。
全文摘要
本發明屬于分子遺傳學領域，涉及小麥抗白粉病基因Pm45的分子標記及其應用。所述的分子標記選自MAG6139、MAG6140或BARC123中的任意一種，與Pm45基因的遺傳距離分別為0.7cM、2.7cM、5.2cM。通過分子標記MAG6139、MAG6140和BARC123選擇含有Pm45單株，可以選育出含有Pm45但遺傳背景不同的抗病品種。利用本發明與Pm45緊密連鎖的分子標記，可以簡便快捷的篩選含有Pm45的植株，分子標記MAG6139、MAG6140和BARC123的應用，可以大大節省抗病材料的篩選時間和勞力，并加強預測的準確性。
文檔編號C12N15/11GK102604942SQ20121008293
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月26日 優先權日2012年3月26日
發明者付必勝, 馬宏棋, 馬正強 申請人:南京農業大學