專利名稱：一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用四環素菌渣的方法，尤其是涉及一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法。
背景技術：
中國是四環素類抗生素生產大國，年產量居世界首位。然而在四環素生產過程中， 會產生大量的廢棄菌渣，這些菌渣主要是發酵醪液進行固液分離時形成的菌餅部分，其主要成分是微生物菌絲體、未代謝利用完的有機物、無機鹽等。長期以來，抗生素菌渣多采用簡單晾曬或烘干后，作為動物飼料或肥料使用，經濟附加值較低。更重要的是，菌渣在晾曬或烘干過程中，會散發出一種特殊異味，而且，菌渣因有機質含量高，易引起二次發酵，顏色變黑，產生惡臭味，給周圍環境帶來危害。酵母浸膏是以酵母為原料，利用現代生物技術通過酵母細胞自溶破壁和酵母自身的酶系對酵母細胞質進行水解或以酶制劑進行水解，再經一系列的抽提、濃縮等工序得到的粉狀或膏狀或液體的產品，營養豐富，富含有18種以上氨基酸、功能性多肽、抗衰老活性因子、膳食纖維和甘露糖，還含有人體不可缺少的核酸、核苷酸和鈣，富含B族維生素及磷、 鎂、錳、鋅、硒等多種微量元素。酵母浸膏被廣泛應用于生物發酵、生物工程、生物醫藥等領域，具體地說，可廣泛用于發酵法生產抗生素、氨基酸、有機酸、酶制劑、生物防腐劑、生物材料、維生素、透明質酸等的培養基配制以及生物工程、生物醫藥等領域。我國目前生產酵母浸膏的廠家較少，但市場需求量較大。由于酵母浸膏生產原料主要是以小麥等糧食作物為原料，價格偏高，因而造成酵母浸膏的生產成本還處在一個比較高的水平，難以達到實際且實惠的應用。目前還沒有一種能利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種生產成本低、制備工藝簡單獨特、 生產周期短、使四環素菌渣得以高效轉化、有效避免四環素菌渣不合理使用對環境造成危害的一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法。本發明通過如下方式實現
一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法，其特征在于該方法包括如下步驟
a.種子活化培養分別從釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露保存管中挑取一環，分別接入種子活化培養基中，30 35°C，10(Tl40r/min下好氧培養36 48h，可分別得到活化的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露種子；
b.一級種子制備將上述步驟a制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露種子按質量百分比為1 5%的接種量，分別接種于種子擴大培養基中，3(T35°C，10(Tl40r/min下好氧培養36 48h，可分別得到釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露一級種子；
c.二級種子制備將上述步驟b制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露一級種子按質量百分比為廣5%的接種量，分別接種于種子擴大培養基中，3(T35°C，10(Tl40r/min下好氧培養36 48h，可分別得到釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子；
d.菌渣培養基制備按下述重量比的原料混合即可得菌渣培養基四環素菌渣 11 13kg，玉米面粉0. 2 0. 5kg，酶制劑0. 4 0. 8kg，(NH4)2SO4 0. I 0. 3kg，加水使菌渣培養基中水分含量為75 85% ;
e.將上述步驟c制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子，分別按質量百分比為I 10%接種量接入上述步驟d制備的菌渣培養基中，30 35°C，4(T80r/min下好氧培養4 6d，然后調節pH為6. 5^7. 0，在55°C水浴中按質量百分比為0. 03%的量加入酵母抽提酶，水解16 24h，升溫到80°C使酶失活，待其冷卻后，離心、微濾膜過濾，濾液經減壓濃縮控制其水分為15 25%，即為酵母浸膏；
所述種子活化培養基，種子擴大培養基，霉菌培養基，產酶培養基，酶制劑制備方法分別是
1)種子活化培養基制備按下述重量比的原料混合即可得種子活化培養基蛋白胨 10g，酵母浸膏10g，葡萄糖20g，水IOOOml ；
2)種子擴大培養基制備按下述重量比的原料混合即可得種子擴大培養基蛋白胨 IOg,酵母浸膏5g，葡萄糖5g，水IOOOml ；
3)霉菌培養基制備按下述重量比的原料配制即可得霉菌培養基取新鮮去皮土豆 200g，切碎后，加IOOOml水煮沸20分鐘，過濾后濾液用水稀釋至1000ml，然后再加入葡萄糖 20g即可；
4)產酶培養基制備按下述重量比的原料配制即可得產酶培養基四環素菌渣700g， 麩皮300g，再加水使產酶培養基水分含量為6(T65% ；
5)酶制劑制備從黑曲霉、康寧木霉、綠色木霉保存管中挑取一環，分別接入霉菌培養基中，菌株經活化和擴大培養后，分別以5%的接種量接種于產酶培養基中，28 35°C好氧培養6(T72h后，可得生產酵母浸膏所用的酶制劑。 本發明有如下效果
1)制備工藝簡單獨特本發明提供的一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法， 包括種子活化培養、一級種子制備、二級種子制備、菌渣培養基制備，然后將制備的二級種子，按質量百分比為I 10%的接種量接種于菌渣培養基中，經好氧發酵、酶解、離心、微濾膜過濾、濃縮等步驟，即可得酵母浸膏；
2)生產的酵母浸膏中蛋白質含量高利用本發明提供的方法制得的酵母浸膏具有較高的蛋白質、氨基酸和核苷酸含量，本發明產品的真蛋白，氨基酸態氮及核苷酸含量相對較高，同時氨基酸種類較多，不僅適用于生物發酵行業，而且還適用于生物工程、生物醫藥等領域；
3)降低環境污染變廢為寶、生產成本低本發明在原料的選擇上主要是以四環素生產過程中產生的廢棄菌渣為主，配以少量玉米面粉、(NH4)2SO4為輔料，不僅來源豐富而且價格低廉。本發明可以有效的利用四環素菌渣，減少其大量堆放對環境造成的危害。此外，本發明實現了好氧發酵工藝條件的優化，降低了生產酵母浸膏的成本，增加了投產后的產品競爭力；
4)安全可靠本發明生產酵母浸膏所使用的發酵原料均不含任何有毒有害物質，具有安全性和補充營養的特點，對環境無直接或間接的污染作用；
5)生產的產品質量高本發明針對目前大量四環素菌渣利用現狀，以選育優化的釀酒酵母、熱帶假絲酵母、EM原露為酵母浸膏生產菌株，所產生的酵母浸膏中蛋白質、氨基酸與核苷酸含量較高，其中氨基酸種類較多，同時還提高四環素菌渣資源化利用的經濟附加值， 本發明酵母浸膏中水分含量15 25%，銨鹽含量I 3%，pH 6. 0 7. 0，真蛋白含量35 50%，氨基酸態氮含量4. 5^7. 5%，核苷酸含量8 15呢/g ；
6)采用本發明提供的方法得到的酵母浸膏，可以達到以下指標
I.感官指標棕黃色膏狀，有特殊的酵母香味。2.衛生指標(每千克成品中含)
總菌落，浸膏為陰性。重金屬未檢出。
具體實施例方式實施例I :
一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法，該方法包括如下步驟
a.種子活化培養分別從釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露保存管中挑取一環，分別接入種子活化培養基中，35°C，140r/min下好氧培養36h，可分別得到活化的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露種子；
b.一級種子制備將上述步驟a制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露種子按質量百分比為5%的接種量，分別接種于種子擴大培養基中，35°C，140r/min下好氧培養36h，可分別得到釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露一級種子；
c.二級種子制備將上述步驟b制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露一級種子按質量百分比為5%的接種量，分別接種于種子擴大培養基中，35°C，140r/min下好氧培養 36h，可分別得到釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子；
d.菌渣培養基制備按下述重量比的原料混合即可得菌渣培養基四環素菌渣11kg， 玉米面粉0.2kg，酶制劑0.4kg，(NH4)2SO4 0.3kg，適當加水使菌渣培養基中水分含量為 80% ；
e.將上述步驟c制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子，分別按質量百分比為1%接種量接入上述步驟d制備的菌渣培養基中，300C，80r/min下好氧培養6d，然后調節pH為6. 5，在55°C水浴中按質量百分比為0. 03%的量加入酵母抽提酶，水解16h，升溫到 80°C使酶失活，待其冷卻后，離心、微濾膜過濾，濾液經減壓濃縮控制其水分為15 25%，即為
酵母浸膏。經測定酵母浸膏中水分含量22%，銨鹽含量2. 3%，pH 6. 3，真蛋白含量43. 8%，氨基酸態氮含量5. 9%，核苷酸含量9. 7/g。。實施例2:
一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法，該方法包括如下步驟
a.種子活化培養分別從釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露保存管中挑取一環，分別接入種子活化培養基中，33°C，120r/min下好氧培養42h，可分別得到活化的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露種子；b.一級種子制備將上述步驟a制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露種子按質量百分比為3%的接種量，分別接種于種子擴大培養基中，33°C，120r/min下好氧培養42h，可分別得到釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露一級種子；
c.二級種子制備將上述步驟b制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露一級種子按質量百分比為3%的接種量，分別接種于種子擴大培養基中，33°C，120r/min下好氧培養 42h，可分別得到釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子；
d.菌渣培養基制備按下述重量比的原料混合即可得菌渣培養基四環素菌渣12kg， 玉米面粉0.3kg，酶制劑0.6kg，(NH4)2SO4 0.2kg，適當加水使菌渣培養基中水分含量為 75% ；
e.將上述步驟c制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子，分別按質量百分比為5%接種量接入上述步驟d制備的菌渣培養基中，330C，60r/min下好氧培養5d，然后調節pH為6. 8，在55°C水浴中按質量百分比為0. 03%的量加入酵母抽提酶，水解20h，升溫到 80°C使酶失活，待其冷卻后，離心、微濾膜過濾，濾液經減壓濃縮控制其水分為15 25%，即為
酵母浸膏。經測定酵母浸膏中水分含量24%，銨鹽含量2. 1%，pH 6. 8，真蛋白含量44. 6%，氨基酸態氮含量6. 5%,核苷酸含量11. 4Mg /go實施例3
一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法，該方法包括如下步驟
a.種子活化培養分別從釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露保存管中挑取一環，分別接入種子活化培養基中，30°C，100r/min下好氧培養48h，可分別得到活化的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露種子；
b.一級種子制備將上述步驟a制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露種子按質量百分比為1%的接種量，分別接種于種子擴大培養基中，30°C，lOOr/min下好氧培養48h，可分別得到釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露一級種子；
c.二級種子制備將上述步驟b制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露一級種子按質量百分比為1%的接種量，分別接種于種子擴大培養基中，3(TC，100r/min下好氧培養 48h，可分別得到釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子；
d.菌渣培養基制備按下述重量比的原料混合即可得菌渣培養基四環素菌渣13kg， 玉米面粉0.5kg，酶制劑0.8kg，(NH4)2SO4 0. 1kg，適當加水使菌渣培養基中水分含量為 85% ；
e.將上述步驟c制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子，分別按質量百分比為10%接種量接入上述步驟d制備的菌渣培養基中，35°C，40r/min下好氧培養4d，然后調節PH為7. 0，在55°C水浴中按質量百分比為0. 03%的量加入酵母抽提酶，水解24h，升溫到80°C使酶失活，待其冷卻后，離心、微濾膜過濾，濾液經減壓濃縮控制其水分為15 25%， 即為酵母浸膏。經測定酵母浸膏中水分含量21%，銨鹽含量2%，pH 7. 0，真蛋白含量44. 4%，氨基酸態氮含量6. 4%,核苷酸含量10. 6I^g /go上述種子活化培養基，種子擴大培養基，霉菌培養基，產酶培養基，酶制劑制備方法分別是1)種子活化培養基制備按下述重量比的原料混合即可得種子活化培養基蛋白胨 10g，酵母浸膏10g，葡萄糖20g，水IOOOml ；
2)種子擴大培養基制備按下述重量比的原料混合即可得種子擴大培養基蛋白胨 10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，水IOOOml ；
3)霉菌培養基制備按下述重量比的原料配制即可得霉菌培養基取新鮮去皮土豆 200g，切碎后使其粒度小于5mmX 5mmX 5mm，加1000ml水煮沸20分鐘，過濾后濾液用水稀釋至1000ml,然后再加入葡萄糖20g即可；
4)產酶培養基制備按下述重量比的原料配制即可得產酶培養基四環素菌渣700g， 麩皮300g，再適當加水使產酶培養基水分含量為60飛5% ；
5)酶制劑制備從黑曲霉、康寧木霉、綠色木霉保存管中挑取一環，分別接入霉菌培養基中，菌株經活化和擴大培養后，分別以5%的接種量接種于產酶培養基中，28 35°C好氧培養6(T72h后，可得生產酵母浸膏所用的酶制劑。上述酵母抽提酶是由木瓜蛋白酶和5’ -磷酸二酯酶組成，其中木瓜蛋白酶活力 900000U/g，5，-磷酸二酯酶活力 120U/g。采用本發明提供的方法得到的酵母浸膏，可以達到以下指標
I.感官指標棕黃色膏狀，有特殊的酵母香味。2.衛生指標(每千克成品中含)
總菌落，浸膏為陰性。重金屬未檢出。 本發明產品的真蛋白，氨基酸態氮及核苷酸含量相對較高，此外，本發明可以有效的利用四環素菌渣，減少其大量堆放對環境造成的危害。本發明生產酵母浸膏所用菌種是釀酒酵母{Saccharomyces Cerevisiae CGMCC 2. 1418)、熱帶假絲酵母{Candida tropicalis CGMCC 2. 587)、EM 原露、黑曲霉 (Aspergillus niger CGMCC 3. 4628)、綠色木霉{Trichoderma viride CGMCC 3.2942)和康寧木霉koningii CGMCC 3. 4033),均保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
權利要求
1.一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法，其特征在于該方法包括如下步驟a.種子活化培養分別從釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露保存管中挑取一環，分別接入種子活化培養基中，30 35°C，10(Tl40r/min下好氧培養36 48h，可分別得到活化的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露種子；b.一級種子制備將上述步驟a制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露種子按質量百分比為1 5%的接種量，分別接種于種子擴大培養基中，3(T35°C，10(Tl40r/min下好氧培養36 48h，可分別得到釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露一級種子；c.二級種子制備將上述步驟b制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露一級種子按質量百分比為廣5%的接種量，分別接種于種子擴大培養基中，3(T35°C，10(Tl40r/min下好氧培養36 48h，可分別得到釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子；d.菌渣培養基制備按下述重量比的原料混合即可得菌渣培養基四環素菌渣 11 13kg，玉米面粉O. 2 O. 5kg，酶制劑O. 4 O. 8kg，(NH4)2SO4 O. Γθ. 3kg，加水使菌渣培養基中水分含量為75 85% ;e.將上述步驟c制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子，分別按質量百分比為I 10%接種量接入上述步驟d制備的菌渣培養基中，30 35°C，4(T80r/min下好氧培養4 6d，然后調節pH為6. 5^7. 0，在55°C水浴中按質量百分比為O. 03%的量加入酵母抽提酶，水解16 24h，升溫到80°C使酶失活，待其冷卻后，離心、微濾膜過濾，濾液經減壓濃縮控制其水分為15 25%，即為酵母浸膏。
2.如權利要求I所述的一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法，其特征在于 所述種子活化培養基，種子擴大培養基，霉菌培養基，產酶培養基，酶制劑制備方法分別是O種子活化培養基制備按下述重量比的原料混合即可得種子活化培養基蛋白胨 10g，酵母浸膏10g，葡萄糖20g，水IOOOml ；2)種子擴大培養基制備按下述重量比的原料混合即可得種子擴大培養基蛋白胨 10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，水IOOOml ；3)霉菌培養基制備按下述重量比的原料配制即可得霉菌培養基取新鮮去皮土豆 200g，切碎后，加IOOOml水煮沸20分鐘，過濾后濾液用水稀釋至1000ml，然后再加入葡萄糖 20g即可；4)產酶培養基制備按下述重量比的原料配制即可得產酶培養基四環素菌渣700g， 麩皮300g，再加水使產酶培養基水分含量為6(Γ65% ；5)酶制劑制備從黑曲霉、康寧木霉、綠色木霉保存管中挑取一環，分別接入霉菌培養基中，菌株經活化和擴大培養后，分別以5%的接種量接種于產酶培養基中，28 35°C好氧培養6(T72h后，可得生產酵母浸膏所用的酶制劑。
全文摘要
本發明涉及一種利用四環素菌渣的方法，尤其是涉及一種利用四環素菌渣好氧生產酵母浸膏的方法，其特征在于該方法包括如下步驟a.種子活化培養、b.一級種子制備、c.二級種子制備、d.菌渣培養基制備、e.取步驟c制備的釀酒酵母、熱帶假絲酵母和EM原露二級種子，分別按質量百分比為1～10%接種量接入步驟d制備的菌渣培養基中，經好氧發酵、酶解、離心、微濾膜過濾、濃縮等步驟，可得酵母浸膏；本發明可使四環素生產企業排放的大量廢棄菌渣得以高效轉化，同時其產品可廣泛用于生物發酵、生物工程、生物醫藥等領域，且工藝簡單，成本低廉。
文檔編號C12N1/06GK102586115SQ20121008454
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者惠興育, 王敏, 馬志強, 馬玉龍 申請人:寧夏大學