專利名稱：多發性骨髓瘤易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種多發性骨髓瘤易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估多發性骨髓瘤發病的風險級別，并作為預防和治療多發性骨髓瘤的方向指導。
背景技術：
多發性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是漿細胞異常增生的惡性腫瘤。一種進行性的腫瘤性疾病。其特征為骨髓漿細胞瘤和一株完整性的單克隆免疫球蛋白(IgG，IgD或 IgE)或Bence Jones蛋白質過度增生。多發性骨髓瘤常伴有多發性溶骨性損害，高鈣血癥， 貧血，腎臟損害，而且對細菌性感染的易感性增高，正常免疫球蛋白的生成收到阻抑。發病率估計為2-3/10萬，男女比例為1.6 1，大多患者年齡> 40歲。MTHFR全稱5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸可以進一步進入甲基傳遞通路，通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程間接為DNA甲基化和蛋白質甲基化提供并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一個較低的水平。此外葉酸的中間代謝產物在核苷酸合成過程中也有重要的作用，通過一碳單位代謝為嘌呤環的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷將導致機體多個基礎生化過程的紊亂，包括細胞周期調控、DNA 復制、DNA以及蛋白質甲基化修飾等，并進而引發神經管缺陷、癌癥、心腦血管疾病等多種病癥。NQOl基因編碼還原型輔酶/醌氧化還原酶，又稱為DT-硫辛酰胺脫氫酶，是一種黃素酶，NQOl在器官中分布廣泛，但在肝臟、腎臟、胃腸道中水平最高。NQOl酶可受到各種化學物的誘導，如多環芳烴、氫醌、丙烯酸鹽、花莖甘藍等。NQOl酶屬于II相代謝酶，在體內與其他I、II相代謝酶一起構成了體內對外源毒性物質的代謝網絡，在機體的解毒代謝中發揮著重要作用。NQOl的多態性會降低NQOl酶對化學物質的解毒能力，增加了患多發性骨髓瘤等疾病的風險。GSTTl即谷胱甘肽硫轉移酶Tl，是負責多種致癌物質代謝的酶類家族GSTs中的一員。GSTTl的功能是使各類親電子化合物，如藥物、環境毒素、氧化鏈產物等與谷胱甘肽結合并進入下一步的代謝步驟。GSTTl具有一種多態型一 null基因型，即缺失GSTTl基因。國內外的眾多研究表明GSTTl基因的這種多態現象與很多類型的癌癥發病相關。這可能是因為GSTTl基因的缺失會使得機體解毒能力發生下降，致癌物質在體內積蓄，將大大提高罹患各種癌癥的風險度。綜上所述，鑒于MTHFR基因，NQOl基因，GSTTl基因在多發性骨髓瘤癌變過程中有著不可忽視的作用，可以將上述基因作為遺傳易感因素來檢測出受檢者在多發性骨髓瘤發生相關的基因單核苷酸位點基因型，及時篩查出易患多發性骨髓瘤的高危人群，從而有針對性的預防和治療多發性骨髓瘤，這對于降低多發性骨髓瘤的發病率有非常重要的意義。

發明內容
基于MTHFR基因上C677T位點及A1298C位點多態性，NQOl基因上C609T位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的4個單核苷酸多態性位點基因型可作為評估多發性骨髓瘤發病的危險因子的基礎上，本發明提供一種多發性骨髓瘤易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測MTHFR基因上C677T位點及A1298C位點多態性，NQOl基因上C609T位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)； PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10 X PCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 O. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各O. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 O. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 O. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應體系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 測序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 lul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例I.檢測試劑盒的使用I、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(1)MTHFR(C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(2)MTHFR(A1298C)正向引物5' GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT3'MTHFR(A1298C)反向引物5' CCACTCCAGCATCACTCACTTT3'(3)NQ01(C609T)正向引物5' TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3'
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NQ01(C609T)反向引物5' TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC3'(4)GSTT1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3;PCR擴增的反應體系為10 X PCR反應緩沖液2. 5μ I ;25mM的dNTP混合液O. 2 μ I、 5U/ul Taq酶O. 125 μ 1、DNA模板 I μ I (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各 O. 25 μ I、 ddH20 19. 175μ I ；反應條件為94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I 分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul, lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，去離子水 3. 875ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(1)MTHFR(C677T)測序引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(2)MTHFR(A1298C)測序引物5' GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT3'(3) NQOl (C6OOT)測序引物5' TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3;(4)GSTTl (Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物lul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA 測序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.對人們進行預防多發性骨髓瘤發病的基因無創檢測的服務I.采樣及抽提DNA由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。2.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的MTHFR基因上C677T位點及 A1298C位點多態性，NQOl基因上C609T位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null) 位點多態性的4個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這4個SNPs位點的基因型。3.多發性骨髓瘤發病高危人群風險評估通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具多發性骨髓瘤易感基因風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者MTHFR基因上C677T位點及A1298C位點多態性，NQOI基因上C609T位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的4個基因上SNP 位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀多發性骨髓瘤易感基因無創檢測報告單。
權利要求
1.一種檢測多發性骨髓瘤易感基因無創檢測試劑盒，其特征在于檢測MTHFR基因上 C677T位點及A1298C位點多態性，NQOl基因上C609T位點多態性，GSTTl基因缺失與否 (Present/Nu11)位點多態性的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對MTHFR 基因上C677T位點及A1298C位點多態性，NQOl基因上C609T位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的4個單核苷酸多態性位點，能特異性擴增出包含這4個 SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是針對MTHFR基因上C677T位點及A1298C位點多態性，NQOl基因上C609T位點多態性，GSTTl基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的4個單核苷酸多態性位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述4個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求I所示的試劑盒，其特征在于，所含的4對特異性引物序列如下(1)MTHFR(C677T)正向引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR (C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'(2)MTHFR(A1298C)正向引物5'GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT3'MTHFR(A1298C)反向引物5' CCACTCCAGCATCACTCACTTT3'(3)NQ01(C609T)正向引物5'TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3'NQOl (C609T)反向引物5' TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC3'(4)GSTTl(Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTTl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3;。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的4條DNA測序引物序列如下(1)MTHFR(C677T)測序引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(2)MTHFR(A1298C)測序引物5'GCCTCCAGACCAAAGAGTTACAT3'(3)NQ01(C609T)測序引物5'TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG3'(4)GSTTl(Null/Present)測序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(I)PCR反應體系10XPCR 反應緩沖液 2. 5ul，25mM dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 O. 125ul， 20uM特異性引物對，每條引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 O. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
全文摘要
本發明提供了一種檢測多發性骨髓瘤易感基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測MTHFR基因上C677T位點及A1298C位點多態性，NQO1基因上C609T位點多態性，GSTT1基因缺失與否(Present/Null)位點多態性的4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與多發性骨髓瘤發生密切相關的4個單核苷酸多態性位點的基因型來評估受檢者多發性骨髓瘤患病的風險級別，并最終根據每一位受檢者的基因檢測結果從基因層面指導受檢者有針對性的預防多發性骨髓瘤的發生，降低多發性骨髓瘤的發病幾率。
文檔編號C12Q1/68GK102605080SQ20121008669
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者姜麗, 潘加奎 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司