本發明屬于生物領域，特別涉及基因的甲基化檢測。

背景技術：

本發明涉及基因檢測領域，特別是涉及一種能夠提高基因甲基化檢測靈敏度的方法及其試劑盒。DNA甲基化與腫瘤的發生發展密切相關，它是腫瘤發生的一個早期事件，由于CPG島的高度甲基化早于腫瘤增生，故檢測某些DNA位點的甲基化可以作為腫瘤標志物，是腫瘤早期輔助診斷、患病預測及療效評估的一個潛在指標。DNA甲基化分析通常需要對DNA進行高溫硫化轉化修飾。高溫硫化轉化后，雙鏈DNA會解離成兩條不互補的單鏈。目前在現有的甲基化檢測技術中還沒有同時檢測同一基因兩條單鏈的甲基化總體水平的先例，現有的基因甲基化檢測技術都是針對一條單鏈進行PCR反應，從而檢測基因甲基化情況。在某類腫瘤檢測中，DNA甲基化的程度不是很明顯，單鏈檢測基因甲基化的靈敏度較低，必須采用定量法才可確定基因甲基化的程度，進而區分癌與非癌。定量法分析較為麻煩復雜，遠不如定性法分析簡單。單鏈檢測基因甲基化沒有充分考慮基因兩條鏈甲基化的總體水平。例如申請號為201610264899.7《一種人體外周血游離DNA中septin9基因甲基化檢測試劑盒及檢測方法》。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明其中一個目的在于提高基因甲基化檢測靈敏度，能夠充分檢測基因兩條鏈的甲基化總水平。以內參基因為標準衡量本發明方法的準確性和有效性。

本發明提供了一種基因甲基化檢測方法，該方法首先針對目的基因設計目的基因甲基化正義鏈的引物對和目的基因甲基化反義鏈的引物對，以及設計檢測目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針，目的基因甲基化正義鏈的引物對為目的基因甲基化正義鏈的正向引物和目的基因甲基化正義鏈的反向引物，目的基因甲基化反義鏈的引物對為目的基因甲基化反義鏈的正向引物和目的基因甲基化反義鏈的反向引物，目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針分別為目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針。由于該方法考慮基因兩條鏈甲基化的情況設計相關引物和探針，使用設計的引物和探針可以檢測目的基因甲基化的整體水平。以內參基因為標準衡量本發明方法的準確性和有效性。

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，目的基因為septin9基因，所述septin9甲基化位點為啟動子區的CpG島，序列為轉錄起始位點上游的-670～-555bp區；

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，

目的基因septin9甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’

目的基因septin9甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’

目的基因septin9甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’

目的基因septin9甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，

目的基因septin9甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’

目的基因septin9甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，目的基因septin9甲基化正義鏈探針、目的基因septin9甲基化反義鏈探針5'端報告熒光基團為FAM，目的基因septin9甲基化正義鏈探針、目的基因septin9甲基化反義鏈探針3'端的猝滅基團為BHQ1。

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，使用內參基因甲基化的引物對和內參基因甲基化探針，內參基因為ACTB，

內參基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

內參基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

內參基因甲基化探針序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，方法步驟為：

A、從待測樣本中提取DNA，

B、對提取的DNA進行硫化轉化修飾，

C、對修飾后的DNA進行純化，得到樣本模板，

D、將所述目的基因甲基化正義鏈的正向引物、目的基因甲基化正義鏈的反向引物、目的基因甲基化反義鏈的正向引物序、所述目的基因甲基化反義鏈的反向引物、目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針、內參基因甲基化的引物對和內參基因甲基化探針以及所述樣本模板同時加到同一孔中進行PCR擴增反應，

E、計算目的基因正、反義雙鏈熒光累積法中septin9基因CP值；以內參基因為標準衡量本發明方法的準確性和有效性。

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，PCR擴增反應體系的終濃度組成為：1～10×PCR緩沖液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM目的基因甲基化正義鏈的引物對、0.1～1uM目的基因甲基化反義鏈的引物對、0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～1uM目的基因甲基化正義鏈探針、0.1～1uM目的基因甲基化反義鏈探針、0.01～0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化鎂，0.1～1uM內參基因甲基化引物對，0.1～1uM內參基因甲基化探針。

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測方法，目的基因為HOXA9基因，

目的基因HOXA9甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.10：

5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’

目的基因HOXA9甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.11：

5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’

目的基因HOXA9甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.12：

5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’

目的基因HOXA9甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.13：

5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’

目的基因HOXA9甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.14：

5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’

目的基因HOXA9甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.15：

5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’；

根據本發明的一方面，還提供了一種直腸癌檢測方法，使用上述的基因甲基化檢測方法檢測目的基因甲基化程度判斷是否患有直腸癌；

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測試劑盒，包含目的基因甲基化正義鏈的正向引物、目的基因甲基化正義鏈的反向引物、目的基因甲基化反義鏈的正向引物、目的基因甲基化反義鏈的反向引物、目的基因甲基化正義鏈探針和目的基因甲基化反義鏈探針；

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測試劑盒，

目的基因甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’，

所述目的基因甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’，

所述目的基因甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’，

所述目的基因甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’，

所述目的基因甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’，

所述目的基因甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’，上述的目的基因為septin9。

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測試劑盒，

目的基因甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.10：

5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’

目的基因甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.11：

5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’

目的基因甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.12：

5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’

目的基因甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.13：

5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’

目的基因甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.14：

5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’

目的基因甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.15：

5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’，上述的目的基因為HOXA9。

根據本發明的一些方面，還提供了一類基因甲基化檢測試劑盒，目的基因甲基化正義鏈探針、目的基因甲基化反義鏈探針5'端報告熒光基團為FAM，目的基因甲基化正義鏈探針、目的基因甲基化反義鏈探針3'端的猝滅基團為BHQ1；

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含內參基因甲基化的引物對和內參基因甲基化探針，所述內參基因為ACTB，

內參基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

所述內參基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

所述內參基因甲基化探針序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’

根據本發明的一方面，還提供了一種基因甲基化檢測試劑盒的應用，基因甲基化檢測試劑盒用于直腸癌檢測。

本發明的整體思路如下：

本發明主要解決的技術問題是提供一種可以提高基因甲基化檢測靈敏度的方法，該檢測方法充分利用基因甲基化的兩條鏈，操作簡便、特異性強且檢測靈敏度高。

本發明采用的一個技術方案是：利用雙鏈檢測提高基因甲基化檢測的靈敏度，本發明的方法中包含目的基因甲基化正義鏈的引物對和目的基因甲基化反義鏈的引物對，作為衡量標準的內參基因ACTB甲基化的通用引物對和探針，以及檢測目的基因甲基化的正、反義鏈的兩條探針。

本發明的一個目的基因為septin9基因；septin9甲基化位點為啟動子區的CpG島，序列為轉錄起始位點上游的-670～-555bp區。針對該位點，本發明設計的目的基因甲基化正、反義鏈的引物對序列如下所示。

目的基因甲基化正義鏈的正向引物：5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’；

目的基因甲基化正義鏈的反向引物：5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’；

目的基因甲基化反義鏈的正向引物：5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’；

目的基因甲基化反義鏈的反向引物：5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

本發明的septin9甲基化基因的正、反義鏈探針5'端報告熒光基團為FAM，septin9甲基化基因的正、反義鏈探針3'端的猝滅基團為BHQ1。針對septin9甲基化位點設計的檢測目的基因甲基化正、反義鏈的兩個探針序列如下所示。

目的基因甲基化正義鏈探針序列：5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’；

目的基因甲基化反義鏈探針序列：5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’；

本發明的內參ACTB甲基化基因的引物對和探針，序列如下：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’

本發明所述的方法還包括其他PCR擴增的常規試劑，主要包括：DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、PCR buffer等。所述PCR擴增反應體系的終濃度組成為：1～10×PCR緩沖液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM septin9甲基化正義鏈引物對、0.1～1uM septin9甲基化反義鏈引物對、0.1～1uM ACTB甲基化通用引物對、0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～1uM septin9甲基化正義鏈探針、0.1～1uM septin9甲基化反義鏈探針、0.1～1uM ACTB甲基化通用探針、0.01～0.10U/ul TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化鎂。

本發明的一種檢測步驟如下：

(1)從待測樣本中提取DNA。

(2)將提取后的DNA進行硫化轉化修飾。

(3)對修飾后的DNA進行純化，得到樣本模板。

(4)對樣本模板進行PCR擴增，擴增條件為：95℃預變性20分鐘，聚合酶鏈式反應擴增階段，95℃變性20s，56℃退火35s，并進行50個循環。

(5)比對正、反義雙鏈熒光累積法中septin9基因CP值和單用一條鏈檢測septin9基因的CP值，或者比對雙鏈檢測法和單鏈檢測法中腸癌樣本septin9基因甲基化的陽性檢出率判斷兩種檢測方法樣本模板中甲基化的檢測程度。以內參基因ACTB的擴增曲線和CP值判斷實驗的準確性和有效性。

本發明使用的DNA提取試劑和DNA硫化轉化試劑均為蘇州工業園區為真生物醫藥有限公司自主生產的試劑，提取及硫化試劑對外銷售。

本發明首次使用同一基因的兩條鏈，即正、反義鏈甲基化熒光累積方法提高基因甲基化檢測靈敏度。與現有的甲基化檢測技術相比，本發明中的利用雙鏈檢測基因甲基化程度的方法具有較高的基因甲基化檢測靈敏度的優點，本發明方法充分利用DNA的兩條鏈，增加熒光信號值，使甲基化熒光雙重累積，提高基因甲基化的檢測靈敏度，能在(95％)非甲基化DNA存在的背景下檢測到目的基因的甲基化，即甲基化DNA含量僅為5％時本發明的方法也能準確檢出。本發明方法采用定性法即可區分甲基化程度高低，根據擴增曲線和Cp值即可區分甲基化程度高低。除此之外，本發明的利用雙鏈檢測提高基因甲基化檢測靈敏度的方法還具有以下優點：(1)檢測過程為閉管同孔反應，即在一個孔中可同時檢測到兩條鏈的甲基化情況，操作簡單快速，減少污染的可能性；(2)雙重反應：目的基因與內參基因處于不同的熒光通道，通過內參基因可對整個實驗的準確性和有效性進行監測和評估。(3)安全，整個體系不包含有毒有害物質，無需PCR產物的開管，對試驗人員以及環境都無危害。

本發明根據該雙鏈檢測法發明了相關的試劑盒，同時優化了PCR擴增條件，進一步提高了擴增反應效率。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：

圖1為本發明的原理示意圖；

圖2為在1例腸癌血漿樣本中使用本發明和常規方法的對比結果圖；

圖3為使用本發明檢測甲基化靈敏度的實驗結果圖；

圖4為使用本發明檢測1例肺癌血漿樣本(三個復孔)的檢測擴增結果圖。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。

實施例1

下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明保護的范圍。

材料：待檢血漿樣本、濃度為2ng/ul的甲基化陽性DNA、濃度為2ng/ul的甲基化陰性DNA。

儀器：Lightcycler 480、旋轉混勻器、水浴鍋、漩渦震蕩儀、冰箱。

試劑：DNA聚合酶(羅氏公司)、10×PCR Buffer(羅氏公司)、MgCl₂(羅氏公司)、dNTP(TaKaRa)、純化水。

引物和探針：所有引物的純度應達到電泳級(PAGE)或HPLC級，不含雜帶。所有探針5'端報告熒光基團為FAM，3'端的猝滅基團為BHQ1。所有引物和探針的序列由本發明研究人員自主設計，然后由供應商提供，濃度為10μmol/L備用。

septin9甲基化正義鏈的正向引物序列如SEQ No.1：

5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’

septin9甲基化正義鏈的反向引物序列如SEQ No.2：

5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’

septin9甲基化反義鏈的正向引物序列如SEQ No.3：

5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’

septin9甲基化反義鏈的反向引物序列如SEQ No.4：

5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；

septin9甲基化正義鏈探針序列如SEQ No.5：

5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’

septin9甲基化反義鏈探針序列如SEQ No.6：

5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。

使用內參基因甲基化的引物對和內參基因甲基化探針，內參基因為ACTB，

內參基因引物序列如SEQ No.7：

ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，

內參基因引物序列如SEQ No.8：

ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，

內參基因甲基化探針序列如SEQ No.9：

ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。

對待測樣本進行處理，所述待測樣本為正常人血漿或腸癌血漿。

A.從待測樣本中提取DNA(蘇州為真公司)。

B.對提取的DNA進行硫化轉化修飾(蘇州為真公司)。

C.對修飾后的DNA進行純化，得到樣本模板。

將自主設計的septin9正義鏈引物對和正義鏈探針、反義鏈引物對和反義鏈探針以及DNA模板、內參基因甲基化的引物對和內參基因甲基化探針同時加到同一孔中進行PCR擴增反應。

PCR反應體系和條件

PCR擴增反應體系的終濃度組成為：1×PCR緩沖液、0.25mM dNTPs、350nM septin9甲基化正義鏈引物對、350nM septin9甲基化反義鏈引物對、0.05ng/ul模板DNA、70nM septin9甲基化正義鏈探針、70nM septin9甲基化反義鏈探針、1.5U TaqDNA聚合酶、2.5mM氯化鎂。

PCR擴增反應的具體過程為：95℃預變性20分鐘，聚合酶鏈式反應擴增階段，95℃變性20s，56℃退火35s，并進行50個循環。若有擴增信號，且呈S型擴增曲線，則為陽性樣本，說明有甲基化出現；若無擴增曲線升起，說明為陰性樣本，即未發生甲基化。擴增的Cp值小于等于40時，結果為有效值。

收集北京協和醫院結直腸癌血漿87例，健康人血漿107例。用上述雙鏈檢測法對血漿樣本進行septin9基因甲基化檢測，以QIAGEN公司的血漿游離DNA提取、硫化純化試劑盒的單鏈檢測法檢測septin9基因甲基化作對比實驗。統計檢測結果，所有血漿樣本的內參基因ACTB均有擴增且Cp值均小于40，證明該實驗準確有效。觀察目的基因通道，87例結直腸癌血漿樣本，雙鏈檢測法檢出陽性的為67例，陽性符合率為77.01％；單鏈檢測法檢出的陽性為59例，陽性符合率為67.82％。對陰性樣本進行分析，107例健康人血漿樣本，雙鏈檢測法中9例檢測結果為陽性，陰性符合率為91.59％；單鏈檢測法中4例檢測結果為陽性，陰性符合率為96.26％。圖2為其中1例腸癌血漿樣本的兩種檢測方法的對比結果，如圖所示，雙鏈檢測法檢出的septin9基因甲基化的Cp值(曲線1)為29.71，熒光值為33左右；單鏈檢測法檢出的septin9基因甲基化的Cp值(曲線2)為33.37，熒光值為18左右。由此可見，雙鏈檢測法比單鏈檢測法檢出的septin9基因甲基化的Cp值高1-2個，且雙鏈檢測法檢出的熒光值也是單鏈檢測法檢出的2倍。

將甲基化陽性DNA和甲基化陰性DNA稀釋成相同濃度，即2ng/ul，分別在95％、85％、50％、30％的非甲基化DNA存在的背景下，用雙鏈檢測法檢測含量為5％、15％、50％、70％的甲基化DNA，所有檢測樣本的內參基因ACTB均有擴增且Cp值均小于40，證明該實驗準確有效。進而觀察目的基因通道，統計檢測結果如圖3所示，曲線1為甲基化含量為70％的擴增曲線，CP值為23.90；曲線2為甲基化含量為50％的擴增曲線，CP值為25.23；曲線3為甲基化含量為15％的擴增曲線，CP值為26.71；曲線4為甲基化含量為5％的擴增曲線，CP值為27.28，根據結果可得，雙鏈檢測法能在(95％)非甲基化DNA存在的背景下檢測到目的基因的甲基化，可大大的提高甲基化檢測靈敏度。

當基因甲基化程度不高，樣本中目的基因甲基化的Cp值超過40時，單鏈檢測法定義為陰性，而此時雙鏈檢測法可充分利用兩條鏈，累積甲基化熒光，增加甲基化的檢出，從而提高目的基因甲基化的靈敏度和甲基化陽性檢出率。

實施例2

發明人還做了HOXA9基因甲基化的雙鏈檢測。

正義鏈的探針：AAATTACCGACGCCCGCG

正義鏈的正向引物：TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG

正義鏈的反向引物：AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG

反義鏈的探針：AAACGAACACGTAACGCG

反義鏈的正向引物：CGTTCGCGTTTTTATTGGTC

反義鏈的反向引物：CGAACCATTAATAACGTACGAA

檢測20例肺癌血漿樣本和13例健康人血漿樣本。用上述雙鏈檢測法對血漿樣本進行HOXA9基因甲基化檢測。所有血漿樣本的內參基因ACTB均有擴增且Cp值均小于40，證明該實驗準確有效。觀察目的基因通道，統計檢測結果，所有血漿樣本的內參基因ACTB均有擴增且Cp值均小于40，證明該實驗準確有效。觀察目的基因通道，20例肺癌血漿樣本，雙鏈檢測法檢出陽性的為15例，陽性符合率為75％；對陰性樣本進行分析，13例健康人血漿樣本，雙鏈檢測法中1例檢測結果為陽性，陰性符合率為92.31％。圖4為其中1例肺癌血漿樣本(三個復孔)的檢測擴增結果圖。由此可見，雙鏈檢測法不僅適用于septin9基因甲基化的檢測，對肺癌標志物HOXA9基因的甲基化檢測也有較高的檢出靈敏度和特異性。

<110> 江蘇為真生物醫藥技術股份有限公司

<120> 基因甲基化檢測方法和檢測試劑盒及其應用

<160> 15

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 1

tcgttgttta ttagttatta tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 2

tccgaaataa tcccatccc at 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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ttcgaaatga ttttatttag ttg 23

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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cgctacccac caaccatc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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taaccgcgaa atccgacata 20

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tataccgaac cccgcgatca 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gaatttgtgt ttgttattgt gtgttgggt 29

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<212> DNA

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cctactcctc ccttaaaaat tacaa 25

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

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accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttattgtttt gttggacggg tacg 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aatttcatat aacaacttaa taacaccg 28

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cgttcgcgtt tttattggtc 20

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cgaaccatta ataacgtacg aa 22

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aaattaccga cgcccgcg 18

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aaacgaacac gtaacgcg 18