專利名稱：一種鑒定鼠尾藻性別的方法
技術領域：
本發明屬于海洋生物技術領域，具體涉及一種鑒定鼠尾藻性別的方法。
背景技術：
鼠尾藻iSargassum thunbergii)是我國沿海一種常見的褐藻,生活在中潮帶和低潮帶的巖石上，其營養豐富、均衡，富含海藻多糖、甘露醇、礦物質及其他活性物質，可用作食品、餌(飼)料、藥用及工業用原料，具有重要的開發價值。另外，鼠尾藻在潮間帶生態系統中占有重要地位,對近海環境修復具有重要作用。近年來，隨著海參養殖業的快速發展，鼠尾藻作為海參天然優質餌料，被大規模采收，致使其野生資源銳減甚至枯竭，進而威脅到潮間帶生態系統平衡。因此，為從根本上解決鼠尾藻的供需矛盾，進行鼠尾藻人工養殖勢在必行。而優良苗種是鼠尾藻人工養殖的基礎和前提。當前，基于有性繁殖的規模化人工育苗技術被認為是解決鼠尾藻養殖苗種需求的關鍵技術。在利用鼠尾藻有性繁殖規律進行人工育苗時，需要提前準備種藻、并控制雌雄個體的合適比例。但是由于未成熟鼠尾藻雌雄個體外觀相似，很難區分雌雄個體，目前尚無有效的鑒定方法，只有待其性成熟后，根據雌、雄生殖托的形態差異來鑒別雌雄個體，這就需要專業知識和豐富經驗，費時耗力且準確率不高。因此，建立鼠尾藻尤其是未成熟鼠尾藻雌雄鑒定的有效方法，在鼠尾藻人工育苗過程中具有重要的應用價值；另外，也對鼠尾藻群體遺傳結構、性別決定與分化等基礎研究具有重要意義。

發明內容
針對現有技術中以生殖托的形態差異來鑒定鼠尾藻性別的方法存在的費時費力且準確率不高的缺點,本發明提供了一種基于PCR (Polymerase Chain Reaction)的鑒定鼠尾藻性別的方法，可應用于鼠尾藻尤其是未成熟鼠尾藻的雌雄個體鑒別中，可顯著提高鼠尾藻性別鑒定的準確度和效率。為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現
一種鑒定鼠尾藻性別的方法，所述方法包括以下步驟
鼠尾藻基因組DNA的提取和純化；利用特異性分子標記S64對基因組DNA進行PCR擴增；所述S64能擴增出特異性標記F289即為雌性鼠尾藻，不能擴增出的即為雄性鼠尾藻， 所述特異性分子標記S64為5' -CCTCCAGTGT-3/ ；
所述特異性標記F289序列如SEQ ID No: I所示。對技術方案的進一步改進選取鼠尾藻的幼嫩組織提取基因組DNA。對技術方案的進一步改進所述幼嫩組織為嫩葉、生殖托或次生小枝。對技術方案的進一步改進PCR擴增體系為10 μ I反應體積中含有50 mM Tris-HCl, I. 5 mM MgCl2,0. 2 mM DNTP,0. 8% 聚蔗糖400，I mM 酒石黃，5 μ M BSA, 30 ng 引物，5 ng模板DNA，O. 5單位Taq DNA聚合酶。對技術方案的進一步改進所述Tris-HCl的pH為8. 3。
對技術方案的進一步改進PCR擴增程序為94 V 4分鐘，按94 V 20秒，36 V 20秒，72 V 60秒，進行40個循環，最后72 °C保溫5分鐘。與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是本發明不僅可對性成熟的鼠尾藻進行有效的性別鑒定，還可對其他發育階段的鼠尾藻進行高效的性別鑒定，不受時間限制， 可實現鼠尾藻整個發育過程中的性別鑒定；而且應用本發明所述鑒定方法可以提高鼠尾藻性別鑒定的準確度和效率，解決未成熟鼠尾藻性別無法鑒定的技術難題。結合附圖閱讀本發明的具體實施方式
后，本發明的其他特點和優點將變得更加清
λ·Μ
/E. ο


圖I是本發明中特異性分子標記S64在雌、雄鼠尾藻基因池及個體中的PCR擴增電泳圖，其中M代表是分子量標準；FP代表雌性鼠尾藻基因池；MP代表雄性鼠尾藻基因池； F1-F5分別代表5個雌性鼠尾藻個體；M1-M5分別代表5個雄性鼠尾藻個體。圖2是本發明中特異性分子標記S64在雌、雄鼠尾藻個體中的PCR擴增電泳圖，其中M代表是分子量標準；F1-F12分別代表12個雌性鼠尾藻個體;M1-M12分別代表12個雄性鼠尾藻個體。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的技術方案作進一步詳細的說明。實施例I
I、鼠尾藻基因組DNA的快速提取和純化
因為鼠尾藻幼嫩組織細胞分裂較為旺盛，DNA復制頻率較高，次生代謝物質累積量較少，有益于DNA的提取和純化，故選取鼠尾藻的幼嫩組織，如嫩葉、生殖托或次生小枝等作為DNA提取實驗材料。由于本發明對基因組DNA模板要求不高，只要正確選取了實驗材料，具體的DNA提取和純化方法可參考植物基因組DNA常規提取方法(例如CTAB法)，或者使用商品化的植物 DNA提取試劑盒提取基因組DNA。2、鼠尾藻雌性個體特異性分子標記的獲得
本發明在鼠尾藻性成熟后取樣，根據雌性鼠尾藻其生殖托相對粗短、雄性鼠尾藻其生殖托相對細長的特點來區分雌性和雄性鼠尾藻，分別將雌、雄鼠尾藻各10個體的基因組 DNA混合，形成雌性和雄性鼠尾藻基因組DNA混合池，應用100條長度為10 bp的寡核苷酸為隨機引物，對兩個基因組DNA混合池分別進行PCR擴增。PCR擴增及其產物檢測方法如下PCR擴增體系10 μ I反應體積中含有50 mM Tris-HCl (pH 8. 3)，I. 5 mM MgCl2,0. 2 mM DNTP,0. 8% 聚蔗糖 400，I mM 酒石黃，5 μ M BSA, 30 ng引物，5 ng模板DNA，O. 5單位Taq DNA聚合酶。PCR擴增程序參數條件94 V 4分鐘，接著按照94 V 20秒，36 V 20秒，72 V 60秒，進行40個循環，最后72 °C保溫5分鐘。PCR產物直接在I. 5% Agarose膠上進行電泳分離，溴化乙錠染色,紫外照相記錄結果。
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根據照相結果，篩選在兩個基因組DNA混合池間具有多態性性的RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA)標記。結果在617條RAPD標記中，本發明篩選出一條僅在雌性鼠尾藻基因組DNA混合池中出現的RAH)標記，如附圖I中所示，箭頭所示為僅在雌性鼠尾藻中擴增出的特異性標記F289。該標記經切膠回收、分離純化后測得其序列，其長度為289 bp，故此將之命名為F289，標記F289的DNA序列如SEQ ID No:l所示。多態性標記 F289是由隨機弓丨物S64 (5' -CCTCCAGTGT-3')擴增得到。標記F289序列如下 CCGCATCTACTTTCAACGCAGGTGGGGGCAATATAATTCTCAATACGGAATCAATTACTGCCCTAAATGACA
GTCAAGTTACTGCCGAAACTCAAGGAGAAGGTAAAGCAGGTTCAATTGAAGTTGTTACAGATAACTTTAATCTTGAA
AGTGGCGCATTGTTTAGCACTAGTACGAATAATATTGGAGATGGAGGAACAATCAATGTCTCAGCTGATAACATCGA
TTTAACAGGAGAAAATACGGGAATATTCAGCCAAGCTACGGCTGATTCGTCTGGTAGATGCGGo3、基于分子標記的鼠尾藻性別鑒定
以S64為引物、應用上述相同的PCR擴增體系和程序，對不同的雌雄個體進行大規模擴增，結果顯示標記F289僅在雌性個體中出現，如附圖2所示，箭頭指示為僅在雌性鼠尾藻中擴增出的特異性標記F289，標記F289僅在12個雌個體中出現，而12個雄性個體中沒有出現標記F289，即標記F289是鼠尾藻雌性個體特異的分子標記，可作為鼠尾藻性別鑒別的分子標記。所以，對于鼠尾藻尤其是未成熟的鼠尾藻，可按照本發明建立的PCR反應體系和程序，應用S64引物對樣本進行PCR擴增，能擴增出標記F289的樣本即為雌性鼠尾藻。對應地，不能擴增出標記F289的樣本即為雄性鼠尾藻。以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
權利要求
1.一種鑒定鼠尾藻性別的方法，其特征是所述方法包括以下步驟鼠尾藻基因組DNA 的提取和純化；利用特異性分子標記S64對基因組DNA進行PCR擴增；所述S64能擴增出特異性標記F289即為雌性鼠尾藻，不能擴增出的即為雄性鼠尾藻，所述特異性分子標記S64引物序列為5' -CCTCCAGTGT-3/ ；所述特異性標記F289序列如SEQ ID No: I所示。
2.根據權利要求I中所述的一種鑒定鼠尾藻性別的方法，其特征在于選取鼠尾藻的幼嫩組織提取基因組DNA。
3.根據權利要求2中所述的一種鑒定鼠尾藻性別的方法，其特征在于所述幼嫩組織為嫩葉、生殖托或次生小枝。
4.根據權利要求I中所述的一種鑒定鼠尾藻性別的方法，其特征在于PCR擴增體系為10 μ I 反應體積中含有 50 mM Tris-HCl，I. 5 mM MgCl2,0. 2 mM DNTP,0. 8% 聚蔗糖 400， I mM酒石黃,5 μ M BSA, 30 ng引物,5 ng模板DNA, O. 5單位Taq DNA聚合酶。
5.根據權利要求4中所述的一種鑒定鼠尾藻性別的方法，其特征在于所述Tris-HCl 的pH為8. 3。
6.根據權利要求I中所述的一種鑒定鼠尾藻性別的方法，其特征在于PCR擴增程序為94 V 4分鐘，按94 V 20秒，36 V 20秒，72 V 60秒，進行40個循環，最后72 V 保溫5分鐘。
全文摘要
本發明提供了一種鑒定鼠尾藻性別的方法，它包括以下步驟鼠尾藻基因組DNA的提取和純化；利用特異性分子標記引物S64對基因組DNA進行擴增；引物S64能擴增出特異性標記F289即為雌性鼠尾藻，不能擴增出的即為雄性鼠尾藻，所述特異性分子標記S64引物序列為5′-CCTCCAGTGT-3′；所述特異性標記F289序列如SEQIDNo:1所示。應用本發明所述鑒定方法可以提高鼠尾藻性別鑒定的準確度和效率，解決未成熟鼠尾藻性別無法鑒定的技術難題。
文檔編號C12Q1/68GK102605086SQ201210089750
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月30日 優先權日2012年3月30日
發明者劉福利, 孫修濤, 汪文俊, 王飛久 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所