專利名稱：嗜酸性喜溫硫桿菌的基因無痕敲除和整合方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種嗜酸性喜溫硫桿菌的基因無痕敲除和整合方法，尤其涉及一種無痕敲除嗜酸性喜溫硫桿菌染色體基因或?qū)⑼庠椿虿迦胧人嵝韵矞亓驐U菌染色體的方法， 以及一種染色體基因無痕敲除和整合中用于同源重組的自殺型質(zhì)粒載體PSDUDI，和一種嗜酸性喜溫硫桿菌中表達(dá)大范圍核酸內(nèi)切酶的質(zhì)粒pSDUl-1-SceI。
背景技術(shù)：
嗜酸性喜溫硫桿菌(Acidithiobacillus caduls,簡稱A. caldus),是一類革蘭氏陰性專性自養(yǎng)硫氧化細(xì)菌，在細(xì)菌浸礦中發(fā)揮十分重要的作用，能夠顯著提高鐵氧化細(xì)菌如 Acidithiobacillus ferroxidans、Leptospirillum ferrooxidans 等的浸礦效率。近年來研究發(fā)現(xiàn)A.可從下述3個方面提高鐵氧化細(xì)菌caldus 的浸礦效率(I)A. caldus 的生長，能利用附著在礦物表面的固體硫，暴露出礦物表面，從而使近況細(xì)菌充分接觸到礦物并起作用；(2)A. caldus生長產(chǎn)生的有機(jī)物有助于促進(jìn)異養(yǎng)或混合營養(yǎng)型浸礦細(xì)菌的生長；(3)A. caldus的代謝物具有表面活性作用，促進(jìn)單質(zhì)硫溶解[1] (Dopson M, Lindstorm EB. ；Appl Environ Microbiol. ;1999 ;Vol. 65 ;Νο· I ;36_40)。因此,A. caldus 的生長對細(xì)菌浸礦效率具有重要影響，引起了人們的廣泛關(guān)注。但是，作為自養(yǎng)細(xì)菌，A. caldus具有生長緩慢，代時長，細(xì)胞得率低等特點(diǎn)，而且浸礦液中常常含有毒性重金屬離子，也抑制了其生長。因此，用遺傳學(xué)的方法深入研究A. caldus的生長代謝和改造A. caldus，提高其生長速率，是當(dāng)前該領(lǐng)域的一個重要課題。對于嗜酸性喜溫硫桿菌的遺傳操作方法，研究進(jìn)展比較緩慢，發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室在國際上率先使用接合轉(zhuǎn)移方法將外源基因通過大腸桿菌轉(zhuǎn)移到A. caldus菌內(nèi)[2](Liu X， Lin J, Zhang Z,et al. , J. Microbiol. Biotechnol. , 2007, Vol. 17,No. 1,162-167)。之后發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室又在國際上率先使用電轉(zhuǎn)化方法將外源基因轉(zhuǎn)入A. caldus菌內(nèi)，提高了轉(zhuǎn)化效率，簡化了操作[3] (Chen L, Lin J, Li B, Lin J, Liu X. , J Microbiol Biotechnol.， 2010，Vol. 20，No. 1，39-44)?；蚯贸驼鲜巧钊胙芯考?xì)菌基因功能、細(xì)菌生長代謝和細(xì)菌分子改造的重要方法，Rawlings所在的實(shí)驗(yàn)室曾報道利用A. caldus自身同源重組系統(tǒng)，將A. caldus的arSB和tetH基因置換為Km基因，從而達(dá)到基因敲除的目的[4] (Leonardo J. van Zyl,Jolanda M. van Munster,and Douglas E. Rawlings. ,Appl Environ Microbiol. ,2008, Vol. 74, No. 18，5686-5694)，但是此敲除方法的效率不穩(wěn)定，從23株菌中篩到I株arsB敲除菌株，從249株菌中篩到I株tetH敲除菌株，而且此敲除方法每敲除一個基因，需要引入一個抗生素抗性基因，鑒于在A. caldus能夠使用的有效抗生素數(shù)目有限，所以此敲除方法無法在同一株菌中敲除多個基因，除此之外沒有在A. caldus中敲除基因的報道。因此，國際上尚無聞效無痕敲除A. caldus基因或?qū)⑼庠椿虿迦階. caldus染色體方法的報道
發(fā)明內(nèi)容
針對基因敲除和整合是深入研究細(xì)菌基因功能、生長代謝和細(xì)菌分子改造的重要方法，而國際上尚無高效無痕敲除A. caldus基因或?qū)⑼庠椿虿迦階. caldus染色體方法的報道，本發(fā)明提出了一種無痕敲除嗜酸性喜溫硫桿菌染色體基因或?qū)⑼庠椿虿迦胧人嵝韵矞亓驐U菌染色體的方法，以及一種A. caldus基因無痕敲除和整合中用于同源重組的自殺型質(zhì)粒載體PSDUDI，和一種用于酶切染色體的大范圍核酸內(nèi)切酶的表達(dá)質(zhì)粒 pSDUl-1-SceI。本發(fā)明所述無痕敲除嗜酸性喜溫硫桿菌染色體基因或?qū)⑼庠椿虿迦胧人嵝韵矞亓驐U菌染色體的方法，步驟包括構(gòu)建同源重組的自殺型質(zhì)粒載體，在載體的多克隆位點(diǎn)處插入同源臂得到同源重組質(zhì)粒，將構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌 SMlO菌株，通過接合轉(zhuǎn)移法將同源重組質(zhì)粒從E. coliSMlO菌轉(zhuǎn)入嗜酸性喜溫硫桿菌中， 平板篩選單交換子并進(jìn)一步鑒定，構(gòu)建大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI的表達(dá)質(zhì)粒并用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入單交換子中，平板篩選雙交換子并進(jìn)一步鑒定；其中所述自殺型質(zhì)粒載體是pSDUDI，質(zhì)粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；所述同源重組質(zhì)粒是pSDUDI-Λ soxYZ，將其從E. coliSMlO菌轉(zhuǎn)入嗜酸性喜溫硫桿菌中的方法是將收集到的E. coliSMlO和嗜酸性喜溫硫桿菌(A. caldus)菌液按照I : 3 的比例混合后，取50ul滴到接合平板上的濾菌膜上，37°C放置48h后，用5mL洗滌液洗滌濾膜，得到的細(xì)胞懸液梯度稀釋后涂布加入卡那霉素的Starky-Na2S2O3固體培養(yǎng)基上，37°C， 培養(yǎng)7 10天；其中用于接合轉(zhuǎn)移的A. caldus培養(yǎng)條件和收集方法是菌株于Starky_S° 液體培養(yǎng)基中39°C，125r/min培養(yǎng)4 7天后，低速低溫離心去除細(xì)胞懸液中Starky_S°培養(yǎng)基帶入的硫粉，取上清12000r/min離心5min收集細(xì)胞,并用洗漆液清洗三次；所述平板篩選單交換子并進(jìn)一步鑒定的方法是挑取篩選平板上的菌落，溶于無菌水中，取菌液為模板，使用引物oriT EcoR sen和oriT Sal ant特異性擴(kuò)增自殺型質(zhì)粒載體上接合轉(zhuǎn)移基因oriT，并以野生型菌株染色體為模板作為陰性對照，以質(zhì)粒 pSDUDI-AsoxYZ為模板作為陽性對照，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，正對照所在的泳道會產(chǎn)生740bp的PCR產(chǎn)物條帶；負(fù)對照在相應(yīng)的區(qū)域則無PCR產(chǎn)物條帶；挑取的驗(yàn)證樣品中，若在相應(yīng)區(qū)域產(chǎn)生與正對照相似的條帶，為單交換子，若無條帶產(chǎn)生與負(fù)對照相似，為假陽性；對單交換子進(jìn)一步鑒定方法是提取單交換子染色體，在被敲除基因的同源臂外側(cè)設(shè)計(jì)引物2520YANZH sen和2520YANZH ant用PCR擴(kuò)增，并以野生型菌株染色體為陰性對照，如果瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示以單交換子染色體為模板PCR擴(kuò)增得到的條帶比陰性對照大7 8Kb，則進(jìn)一步確定是單交換子，若無，則為假陽性；上述引物序列是oriT EcoR sen ATTCCGGAATTCGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGoriT Sal ant TCACGCGTCGACCGGGATTCAACCCACTCG2520YANZH sen CCGGGTTCCTGGTAAGTC2520YANZH ant GCTTACTGGCACTGCGATTA所述大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI的表達(dá)質(zhì)粒是pSDUl-I-Scel,質(zhì)粒pSDUl-I-Sce I 的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI的表達(dá)質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入單交換子中的方法
5是單交換菌株于Starky-S°液體培養(yǎng)基中，125r/min, 39 °C振蕩培養(yǎng)4 7天至指數(shù)生長后期，低速低溫離心去除細(xì)胞懸液中Starky-S°培養(yǎng)基帶入的硫粉,取上清12000r/min,離心 5min收集細(xì)胞，并用滲透壓逐漸降低的清洗液重復(fù)清洗細(xì)胞，制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取 pSDUl-1-SceI質(zhì)粒并與收集到的細(xì)胞以體積比為I : 40 55混合，電壓10，500V/cm,電阻400 Ω，電容25 μ F進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；上述去除細(xì)胞懸液中Starky_S°培養(yǎng)基帶入的硫粉優(yōu)選的方法是收集到的菌液
4。。，800 X g，離心 IOmin ；所述平板篩選雙交換子方法是電轉(zhuǎn)化后將菌懸液加入到Starky_S°液體培養(yǎng)基中，37°C，50 60rpm過夜培養(yǎng)后加入氯霉素，轉(zhuǎn)速提高到100 120r/min再培養(yǎng)36_60h 后，梯度稀釋涂布于加入氯霉素的篩選平板上，37°C倒置培養(yǎng)10 15天；在篩選平板上挑取菌落，在被敲除基因上下游150 250bp處設(shè)計(jì)引物2520test sen和2520test ant,用菌落PCR擴(kuò)增，如果瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示只在300 500bp處有目的條帶，則初步判斷是雙交換子；上述引物序列是2520test sen AAATTGCGGAAAGTCTCG2520test ant TGGGTATCGGTGATGTGC所述雙交換子的進(jìn)一步鑒定方法是將篩選到的雙交換子菌落培養(yǎng)后提取染色體，在被敲除基因同源臂的外側(cè)設(shè)計(jì)引物2520YANZH sen和2520YANZH ant PCR擴(kuò)增驗(yàn)證被敲除基因上下游區(qū)域，以雙交換子染色體為模板用PCR擴(kuò)增，并以野生型菌株染色體為陰性對照，如果瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示以雙交換子染色體為模板擴(kuò)增得到的產(chǎn)物比陰性對照小，且差值是被敲除基因的大小，則進(jìn)一步確定是雙交換子。一種應(yīng)用于嗜酸性喜溫硫桿菌染色體基因無痕敲除和整合的同源重組自殺型質(zhì)粒載體，其特征在于，所述質(zhì)粒載體命名為PSDUDI，質(zhì)粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示；其中所述質(zhì)粒載體必須包含接合轉(zhuǎn)移基因oriT，大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI酶切位點(diǎn)，用于篩選的卡那霉素抗性基因Km和氨芐青霉素抗性基因Amp，以及適于同源臂插入的多克隆位點(diǎn)MCS。其中，所述插入的同源臂核苷酸片段必須大于1Kb，優(yōu)選的，所述插入的同源臂核苷酸片段為1.5Kb。上述同源重組的自殺型質(zhì)粒載體pSDUDI包含接合轉(zhuǎn)移基因oriT，使質(zhì)粒可以從大腸桿菌SMlO菌株成功轉(zhuǎn)入喜溫硫桿菌中；包含大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI酶切位點(diǎn)，使大范圍核酸內(nèi)切酶可以成功切斷插入同源重組質(zhì)粒的染色體，提高了同源臂發(fā)生第二次交換的效率；包含卡那霉素抗性基因Km，作為單交換子的篩選標(biāo)記；包含氨芐青霉素抗性基因 AmpR，為同源重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌SMlO菌株提供了篩選標(biāo)記；設(shè)計(jì)了多克隆位點(diǎn)MCS，為同源臂的插入提供了便利。上述同源重組的自殺型質(zhì)粒載體pSDUDI的構(gòu)建方法是第一設(shè)計(jì)載體上用于插入同源臂的多克隆位點(diǎn)的DNA序列MCSl rTTrrTACTAGTCTAGAGCTCGGATCCACGCGT Sail SpeI XbaI SacI BamHl MluI MCS2 C ATATGCAATTGAAGCTTGGTACCGCGGCTAGCGGCCGC NdeI MfeI HindIII KpnI SacII NheI NotI第二以質(zhì)粒 pSIMPLE-19EcoR V/BAP Vector (購自 TAKARA 公司)為模板，使用引物pMD19Sal sen、pMD19EcoR ant, PCR擴(kuò)增獲得質(zhì)粒的復(fù)制子(ColElori)及氨節(jié)青霉素抗性基因(AmpR)部分，以質(zhì)粒 RP4 (Datta, N.，R. ff. Hedges ;J. Bacteriol. ； 1971 ； 108 1244-1249.)為模板，使用引物oriT EcoR sen,oriT Sal ant，PCR擴(kuò)增獲得接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT，將兩次PCR得到的產(chǎn)物用EcoRI和SalI雙酶切，純化后，用T4DNA連接酶連接， RKE. coliDH 5 α，利用氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行驗(yàn)證，該質(zhì)粒為構(gòu)建過程中的中間質(zhì)粒，命名為PMD-or iT。第二以質(zhì)粒pMD-oriT為模板,使用引物MCS sen和oriT MCS ant擴(kuò)增質(zhì)粒復(fù)制部分ColElori、氨芐青霉素抗性基因AmpR和接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT，以pJRD215 (Davison， J.，M. Heusterspreute ；Gene ；1987 ；51 :275-280.)為模板，使用引物 Km MCS sen 和 Km MCS ant擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，同時合成多克隆位點(diǎn)，將兩次PCR得到的產(chǎn)物使用BamHI 和HindIII雙酶切，純化后，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH 5α，利用卡那霉素和氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行驗(yàn)證，該質(zhì)粒為構(gòu)建過程中的中間質(zhì)粒，命名為 PMD-oriT-Km-MCS ；第三以中間質(zhì)粒PMD-oriT-Km-MCS為模板，使用弓丨物MCS BamHI sen和oriT ApaIant擴(kuò)增多克隆位點(diǎn)MCS2、質(zhì)粒復(fù)制部分ColElori、氨芐青霉素抗性基因AmpR和接合轉(zhuǎn)移基因oriT,以pJRD215為模板，使用引物I-SceI ApaI sen和Km BamHI ant擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，同時合成大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI酶切位點(diǎn)，將兩次PCR得到的產(chǎn)物使用 BamHI和ApaI雙酶切，純化后，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH 5 α，利用卡那霉素和氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行驗(yàn)證，該質(zhì)粒即為A. caldus基因無痕敲除和整合中用于同源重組的自殺型質(zhì)粒載體PSDUDI，大小為3. 9Kb，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所
/Jn ο
上述大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI酶切位點(diǎn)的DNA序列是
TAGGGATAACAGGGTAAT
上述引物序列是
pMD19Sal sen
TCACGCGTCGACGCGGTAATACGGTTATCCAC
pMD19EcoR ant
TCCGGAATTCAATGGTTTCTTAGACGTCAGGT
MCS sen
CCCAAGCTTGGTACCGCGGCTAGCGGCCGCGCGGTAATA
oriT MCS ant
CGGGATCCGAGCTCTAGACTAGTCGACCGGGATTCAACC
Km MCS sen
CGCGGATCCATCGATACGCGTCGGATGAATGTCAGCTACTKm MCS ant CCCAAGCTTCAATTGCATATGGGCGGTGGAATCGAAATCMCS BamHI sen CGTGGATCCACGCGTCCGCCCATATGCAATTGAoriT ApaI ant TATAGGGCCCCGACCGGGATTCAACCCAI-SceI ApaI sen GTGAGGGCCCATAGGGATAACAGGGTAATATGAATGTCAGCTACTGGKm BamHI ant CTGGATCCGAGCTCTAGACTAGTCGACAATCGAAATCTCGTGATGG一種應(yīng)用于嗜酸性喜溫硫桿菌中表達(dá)大范圍核酸內(nèi)切酶的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒命名為pSDUl-1-SceI，質(zhì)粒pSDUl-1-Sce I的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；其中所述質(zhì)粒pSDUl-1-SceI由質(zhì)粒載體pSDUl，啟動子tac，大范圍核酸內(nèi)切酶表達(dá)基因I-SceI構(gòu)成。上述用于酶切染色體的大范圍核酸內(nèi)切酶的表達(dá)質(zhì)粒pSDUl-1-SceI的構(gòu)建方法是第一以質(zhì)粒pACBSR(C. D. Herring, J. D. Glasner, F. R. Blattner. ；2003 ；331 153-163.)上氯霉素抗性基因開放閱讀框?yàn)榛A(chǔ)，通過兩輪PCR，將原來的啟動子替換為可以在A. caldus MTH-04中使用的質(zhì)粒pBR322(購自TAKARA公司)上的四環(huán)素抗性基因啟動子P2。第一輪PCR:以質(zhì)粒pACBSR為模板，引物Cm Slsen, Cm ant擴(kuò)增氯霉素抗性基因開放閱讀框；第二輪PCR 以第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物切膠回收后作為模板，使用引物CmS2sen、 Cm ant進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物816bp，獲得了含有啟動子P2的氯霉素抗性基因。上述引物序列是Cm Slsen GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGGAGAAAAAAATCACTGGCmS2sen CTGAGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCATCCATAAGGTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGCm ant CTTCGTGCACATTCATCCGCTTATTATCACTT第二以質(zhì)粒PJRD215 為模板，引物 P215sen、P215ant 擴(kuò)增 pJRD215 的 oriV、 mob及rep部分，將獲得的pJRD215擴(kuò)增部分與優(yōu)化啟動子的氯霉素抗性基因部分，分別用 Alw44I、EcoT22I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH 5α，利用氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行驗(yàn)證，，該質(zhì)粒即為中間質(zhì)粒PSDU。上述引物序列是P215sen CTTCGTGCACTCCTTGCAATACTGTGTTP215ant CTTCATGCATCCCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCA第三以質(zhì)粒pSDU 為模板，引物 pSDU-EcoT sen 和 pSDU-XhoI ant 擴(kuò)增 oriV,mob，rep及氯霉素抗性部分，以質(zhì)粒載體pMMB6為模板,引物tac_XhoI sen和tac_EcoT ant擴(kuò)增tac啟動子部分，將兩次PCR得到的產(chǎn)物使用EcoT22I和XhoI雙酶切，純化后，用T4DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH 5 α，利用氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行驗(yàn)證，該質(zhì)粒即為中間質(zhì)粒pSDUl-tac。上述引物序列是pSDU-EcoT sen CTTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCpSDU-XhoI ant ACTCCTCGAGAGAGCATACATCTGGAAGCAtac-XhoI sen ACTCCTCGAGATCGACTGCACGGTGtac-EcoT ant CTTCATGCATTGTTTCCTGTGTGAAATTG第四以質(zhì)粒pSDUl-tac 為模板，使用引物 pSDUlEcoT-Xba sen 和 tac Bam-Pst ant擴(kuò)增質(zhì)粒載體和啟動子部分pSDUl-tac，以質(zhì)粒pACBSR為模板，使用引物0F131Bamsen 和 0F132XbaI ant[5] (C. D. Herring, J. D. Glasner,F. R. Blattner. ；2003 ；331 :153-163.)擴(kuò)增I-SceI表達(dá)基因，將兩次PCR得到的產(chǎn)物使用BamHI和XbaI雙酶切，純化后，用T4DNA 連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH 5 α，利用氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行驗(yàn)證，該質(zhì)粒即為用于酶切染色體的大范圍核酸內(nèi)切酶的表達(dá)質(zhì)粒pSDUl-1-SceI。上述引物序列是pSDUlEcoT-Xba sen CTTCATGCATTCTAGATCATGTTTGACAGCTTATCtac Bam-Pst I ant TCGCGGATCCTCCTGCAGTGTTTCCTGTGTGAAATTGOFl31 Bam sen TTACGCGGATCCAGGAGGGTACCTATATGCATATGAAAAACATCAAAAAAAACC0F132XbaI ant TTCTTCTCTAGAACGTCGGGCCCTTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGAG上述平板篩選雙交換子優(yōu)選的方法是電轉(zhuǎn)后將菌懸液加入到Starky_S°液體培養(yǎng)基中，37°C，50r/min過夜培養(yǎng)后加入氯霉素，加入氯霉素的量是使其終濃度為30 μ g/ mL ;所述轉(zhuǎn)速提高到100r/min后，再培養(yǎng)48h (時間太短I-SceI酶的酶切效果不明顯，時間太長，野生菌的生長占優(yōu)勢)。上述菌落PCR篩選雙交換子的方法中(以基因敲除為例說明)，在被敲除基因上下游150 250bp處設(shè)計(jì)引物，該引物應(yīng)符合以下要求以野生型菌株染色體為模板時PCR 擴(kuò)增出目的條帶，而以單交換子染色體為模板，使用該對引物PCR擴(kuò)增，除在相同大小處有條帶，在300 500bp處也有條帶。本發(fā)明將含有大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI酶切位點(diǎn)的同源重組質(zhì)粒采用接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)入A. caldus中，同時利用細(xì)胞自身的同源重組系統(tǒng)，將同源重組質(zhì)粒定向插入到 A. caldus染色體中，篩選到的單交換子電轉(zhuǎn)入I-SceI表達(dá)質(zhì)粒，在I-SceI酶切斷染色體的壓力下，單交換子染色體發(fā)生第二次同源重組，優(yōu)化篩選方法，最終篩選到雙交換菌株，從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除或插入。本發(fā)明在實(shí)施的過程中，同時構(gòu)建了用于同源重組的自殺型質(zhì)粒載體pSDUDI，可以作為A. caldus基因敲除或整合的通用載體，以及在A. caldus中有效表達(dá)I-SceI酶的質(zhì)粒pSDUl-1-SceI，為A. caldus中基因的無痕敲除或整合提供了便利，為
9A. caldus的深入研究和改造提供了新的途徑。本發(fā)明在國際上首次創(chuàng)建了在嗜酸性喜溫硫桿菌中高效無痕敲除或整合基因的方法，并成功敲除A. caldus的硫代謝相關(guān)基因soxYZ，而且在雙交換子篩選平板上，平均每 25個菌落可篩到I個雙交換子。


圖I.雙交換子的PCR驗(yàn)證結(jié)果。PCR模板分別為W，野生型菌株的染色體；D，單交換子的染色體；S，雙交換子的染色體；M，DNA Marker，從上到下大小依次是 15, OOObp, 10, OOObp, 7, 500bp, 5, OOObp, 3,OOObp0圖2.自殺型質(zhì)粒載體pSDUDI的物理圖譜。圖3.質(zhì)粒pSDUl-1-SceI的物理圖譜。圖4 :嗜酸性喜溫硫桿菌基因無痕敲除和整合原理。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I敲除嗜酸性喜溫硫桿菌硫代謝相關(guān)基因soxYZI.質(zhì)粒 pSMPLE-19EcoR V/BAP Vector (購自 TAKARA 公司)，pJRD215[7](購自 Biovector Co. , LTD Davison J. , M. Heusterspreute, N.Chevalie；Gene ；51 ;275_280)的提取使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. O 質(zhì)粒小提試劑盒(購自TaKaRa公司，貨號DV801A)，具體操作如下(I) 20ml LB培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抗生素，接種I %活化的菌種，37°C，200r/min,振蕩培養(yǎng)12 14h。(2)取5ml培養(yǎng)好的菌液倒入離心管中，12, 000r/min離心3min,吸凈上清。(3)向收集的菌體中加入250 μ I的SolutionI (含RNaseAl) ,Vortex,充分懸浮細(xì)胞沉淀后的菌液轉(zhuǎn)移到I. 5ml的EP管中。(4)加入250 μ I的Solutionll，輕輕地上下翻轉(zhuǎn)5 6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液。注菌體裂解一定要充分，形成透明溶液，且操作要迅速，此步不宜超過5min。(5)加入400 μ L的4°C SolutionIII,輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5 6次,直至形成緊實(shí)凝集塊，然后室溫靜置2min。(6) 12, 000r/min 離心 IOmin0(7)將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(8)取上清輕柔地轉(zhuǎn)移至Spin Column中，然后12，000r/min離心Imin,棄濾液。(9)將 500 μ I 的 RinseA 加入 Spin Column 中，12，000r/min 離心 30sec,棄濾液。(10)將 700 μ I 的 RinseB 加入 Spin Column 中，12, 000r/min 離心 30sec,棄濾液。(11)重復(fù)(9)，傾倒殘液后，再 I, 2000r/min 離心 Imin0(12)將Spin Column安裝于新的I. 5ml的離心管上,在Spin Column膜中央處加入30 μ L的65°C預(yù)熱的滅菌ddH20，室溫靜置3min。
(13) 12, 000r/min 離心 Imin 洗脫 DNA。
2. PCR擴(kuò)增質(zhì)粒復(fù)制部分ColElori、氨芐青霉素抗性基因AmpR
以質(zhì)粒 pSMPLE-19EcoR V/BAP Vector 為模板，使用引物 pMD19Sal sen、pMD19EcoR ant，PCR擴(kuò)增獲得質(zhì)粒的復(fù)制子(ColElori)及氨芐青霉素抗性基因(AmpR)部分。
(I)上述引物序列如下
pMD19 Sal sen
TCACGCGTCGACGCGGTAATACGGTTATCCAC
pMD19 EcoR ant
TCCGGAATTCAATGGTTTCTTAGACGTCAGGT
(2)反應(yīng)體系的配制
ddH20 21 μ I ； Premi X PrimerSTAR HS 25μ L ；引物 MCS sen I. 5 μ L (O. 3 μ Mfinalconc.)；引物 oriT MCS ant I. 5 μ L (O. 3 μ M final conc.);模板 DNA(質(zhì)粒pMD-oriT-sor-Km) :1 μ L。(Premix PrimerSTAR HS 購自 TaKaRa 公司，貨號DR040A)
(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)程序94°C 2min ;之后98°C 10s, 55 °C 15s，72°C 3min，共 29 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0
(4) DNA凝膠電泳檢測。
3. PCR擴(kuò)增獲得接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT
以質(zhì)粒RP4為模板，使用引物oriT EcoR sen,oriT Sal ant，PCR擴(kuò)增獲得接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT。
上述引物序列如下
oriT EcoR sen ATTCCGGAATTCGCTCGTCCTGCTTCTCTTCG
oriT Sal ant TCACGCGTCGACCGGGATTCAACCCACTCG
4.將2和3中得到的PCR產(chǎn)物純化后，EcoRI (TaKaRa Code :D1040A) 37°C酶切后純化回收，再 SalUTaKaRa Code :D1080A) 37°C酶切
EcoRI 酶切體系EcoRI I μ L ；10XH Buffer 2 μ L ;DNA < I μ g ;滅菌水 up to20 μ L0
Sail 酶切體系Sail I μ L ；10XH Buffer 2 μ L ;DNA 彡 I μ g ;滅菌水 up to20 μ L0
5.酶切液純化后利用T4DNA連接酶(TaKaRa Code :D2011A) 16°C過夜連接
連接體系10XT4 DNA Ligase Buffer 2. 5 μ L ；DNA 片段約 0. 3pmol ；
載體 DNA 約 O. 03pmol ；T4DNALigase I μ L ；dH20 up to 25 μ L
6.連接液轉(zhuǎn)入E. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞中
(I)取50 μ L冰浴上融化的感受態(tài)細(xì)胞，加入連接液，輕輕混勻，在冰浴中放置30mino
(2) 42°C水浴中熱激45s，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中2min，該過程不要搖動離心管。
(3)向每個離心管中加入500 μ L無菌的LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于
37°C，200r/min培養(yǎng)lh，使細(xì)菌復(fù)蘇。
(4)吸取50 μ L已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加入含卡那霉素和氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于37°C至液體被吸收，倒置平板，37°C過夜培養(yǎng)。7.挑取篩選平板上的菌落，溶于10 μ L無菌水中，菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子菌懸液接種于20mL LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，該質(zhì)粒為中間質(zhì)粒 PMD-oriT。菌落PCR 反應(yīng)體系模板 2 μ 1，引物各 I μ I (10 μ Μ)，Premix Taq (TaKaRa Code DRR003A) 12. 5 μ 1，超純水 8· 5μ I。菌落PCR 反應(yīng)程序94°C IOmin ;之后 98°C 10s, 55°C 15s, 72°C lmin/Kb,共 34 個循環(huán)；最后72°C IOmin08. PCR擴(kuò)增質(zhì)粒復(fù)制部分ColElori、氨芐青霉素抗性基因AmpR和接合轉(zhuǎn)移基因 oriT 利用引物MCS sen和oriT MCS ant,以質(zhì)粒PMD-oriT為模板，PCR擴(kuò)增出質(zhì)粒復(fù)制部分ColElori、氨芐青霉素抗性基因AmpR和接合轉(zhuǎn)移基因oriT。上述引物序列如下MCS sen CCCAAGCTTGGTACCGCGGCTAGCGGCCGCGCGGTAATAoriT MCS ant CGGGATCCGAGCTCTAGACTAGTCGACCGGGATTCAACC9. PCR擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，同時合成多克隆位點(diǎn)利用引物Km MCS sen和Km MCS ant,以質(zhì)粒pJRD215為模板，PCR擴(kuò)增出卡那霉素抗性基因，同時合成多克隆位點(diǎn)。上述引物序列如下Km MCS sen CGCGGATCCATCGATACGCGTCGGATGAATGTCAGCTACTKm MCS ant CCCAAGCTTCAATTGCATATGGGCGGTGGAATCGAAATC10.將 8 和 9 中得到的 PCR 產(chǎn)物純化后，BamHI (TaKaRa Code D1010A) 30°C酶切后純化回收，再 HindIII (TaKaRa Code :D1060A) 37°C酶切BamHI 酶切體系BamHI I μ L ；10XK Buffer 2 μ L ;DNA < I μ g ;滅菌水 up to 20 μ L0HindIII 酶切體系HindIII I μ L ; 10XM Buffer 2 μ L ;DNA 彡 I μ g ;滅菌水 up to 20 μ L。11.酶切液純化后利用T4DNA連接酶(TaKaRa Code :D2011A) 16°C過夜連接。12.連接液轉(zhuǎn)入E. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞中。13.挑取篩選平板上的菌落，溶于10 μ L無菌水中，菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子菌懸液接種于20mL LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，該質(zhì)粒為中間質(zhì)粒 PMD-oriT-Km-MCS。14. PCR擴(kuò)增多克隆位點(diǎn)MCS2、質(zhì)粒復(fù)制部分ColElori、氨芐青霉素抗性基因AmpR 和接合轉(zhuǎn)移基因oriT
12
利用引物MCSBamHI sen和oriT ApaI ant，以質(zhì)粒PMD-oriT-Km-MCS為模板，PCR 擴(kuò)增出多克隆位點(diǎn)MCS2、質(zhì)粒復(fù)制部分ColElori、氨芐青霉素抗性基因AmpR和接合轉(zhuǎn)移基因 oriT。上述引物序列如下MCS BamHI sen CGTGGATCCACGCGTCCGCCCATATGCAATTGAoriT ApaI ant TATAGGGCCCCGACCGGGATTCAACCCA15. PCR擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，同時合成大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI酶切位點(diǎn)利用引物I-SceI ApaI sen和Km BamHI ant,以質(zhì)粒pJRD215為模板,PCR擴(kuò)增出卡那霉素抗性基因，同時合成大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI酶切位點(diǎn)。上述引物序列如下I-SceI ApaI sen GTGAGGGCCCATAGGGATAACAGGGTAATATGAATGTCAGCTACTGGKm BamHI ant CTGGATCCGAGCTCTAGACTAGTCGACAATCGAAATCTCGTGATGG16.將14和15中得到的PCR產(chǎn)物純化后，BamHI和ApaI雙酶切。17.酶切液純化后利用T4DNA連接酶16°C過夜連接。18.連接液轉(zhuǎn)入E. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，吸取50 μ L涂布在含卡那霉素和氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h。19.挑取篩選平板上的菌落，溶于10 μ L無菌水中，菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子菌懸液接種于20mL LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，并測序確認(rèn)，該質(zhì)粒即為自殺型質(zhì)粒載體pSDUDI，所述質(zhì)粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示。20. PCR擴(kuò)增soxYZ上下游同源臂利用引物2520up Sail sen 和 2520up XbaI ant，以 A. caldus 染色體為模板，PCR 擴(kuò)增 soxYZ 上游同源臂；利用引物 2520down Hind III sen 和 2520 down NotI ant,以 A. caldus染色體為模板，PCR擴(kuò)增soxYZ下游同源臂。上述引物序列如下2520 up Sail sen TCAACGGTCGACCTATGGCGTGCTGAGTTATC2520 up XbaI ant CTAGTCTAGATATCCGTAGGGAACCACTC2520 down Hind III sen TCCCAAGCTTTTAGAACAGGAGTGTAGCCG2520 down NotI ant CAAAGCGGCCGCGACACGCAGGTCTGTGATAC21.質(zhì)粒pSDUDI和soxYZ上游同源臂Sail和XbaI雙酶切，酶切液純化后利用 T4DNA連接酶過夜連接。22.連接液轉(zhuǎn)入E. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，吸取50 μ L涂布在含卡那霉素和氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h。23.挑取篩選平板上的菌落，溶于10 μ L無菌水中，菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子菌懸液接種于20mL LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，該質(zhì)粒為中間質(zhì)粒 pSDUDI-ΛsoxYZ(UP)。24.質(zhì)粒 pSDUDI-Λ soxYZ (UP)和 soxYZ 下游同源臂 Hind III 和 NotI 雙酶切，酶切液純化后利用T4DNA連接酶過夜連接。25.連接液轉(zhuǎn)入E. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，吸取50 μ L涂布在含卡那霉素和氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h。26.挑取篩選平板上的菌落，溶于10 μ L無菌水中，菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子菌懸液接種于20mL LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，并測序確認(rèn)，該質(zhì)粒即為同源重組質(zhì)粒pSDUDI-AsoxYZ027.制備 E.coli SMlO 感受態(tài)細(xì)胞，將質(zhì)粒 pSDUDI-Λ soxYZ 轉(zhuǎn)入 Ε· coliSMlO 感受態(tài)細(xì)胞中(I)將E. coli SMlO接種 20mL LB培養(yǎng)基，卡那霉素濃度80 μ g/mL，37°C，200r/min 培養(yǎng)16h，取200 μ L活化的菌株轉(zhuǎn)入20mL LB培養(yǎng)基中，37°C，200r/min培養(yǎng)I 2h (使OD
達(dá)到0. 4左右，空培養(yǎng)基作對照)；(2)菌液冰浴 20min,取 I. 5mL 于 I. 5mLEppendorf 管中,4°C，10000r/min 離心 30s, 吸出上清，倒置Imin (殘留液流盡)；(3)用預(yù)冷的800yL100mmol/L CaCl2溶液重懸細(xì)胞，冰浴lOmin，離心(4 °C, 10000r/min 30s)吸出上清,倒置Imin (殘留液流盡)；(4)用預(yù)冷的100 μ LIOOmmoI/L CaCl2溶液重懸細(xì)胞，冰浴4h左右；(5)向100 μ L細(xì)胞懸液中加入5-10 μ L的DNA質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30min ；(6)混合液42°C水浴90s，不要搖動，再冰浴2min，立即加入500 μ L LB培養(yǎng)液， 37°C,200r/min培養(yǎng)lh，吸取50 μ L涂布在含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng) 24h。28.挑取篩選平板上的菌落，溶于10 μ L無菌水中，菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子菌懸液接種于20mL LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，證實(shí)質(zhì)粒 pSDUDI-AsoxYZ 已轉(zhuǎn)入 Ε· coliSMlO 中。29.將嗜酸性喜溫硫桿菌MTH-04 (本實(shí)驗(yàn)室從云南騰沖溫泉酸性水樣分離得到， 保藏編號為CGMCC NO. 1742 ;劉纓，齊放軍，林建群等；一株中度嗜熱嗜酸硫氧化桿菌的分離和系統(tǒng)發(fā)育分析；微生物學(xué)報；2004 ；44(3) =382-385)接種于Starky_S°液體培養(yǎng)基中， 39°C, 125r/min培養(yǎng)5. 5天后,4°C, 800 X g,離心IOmin去除細(xì)胞懸液中Starky-Sci培養(yǎng)基帶入的硫粉，取上清12000r/min,離心5min收集細(xì)胞,無機(jī)鹽洗漆液重懸細(xì)胞，12，000r/min, 離心5min，收集細(xì)胞，再重復(fù)洗滌兩次，最后用無機(jī)鹽洗滌液重懸細(xì)胞，使OD6tltl達(dá)到20。30.將轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pSDUDI-Λ soxYZ的E. coliSMlO菌株接種于20mL含氨芐青霉素 80 μ g/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200r/min過夜培養(yǎng)后，取200 μ L活化的菌株轉(zhuǎn)入20mL 含氨芐青霉素80 μ g/mL的LB培養(yǎng)基中，37°C，200r/min培養(yǎng)至指數(shù)生長中期，12000r/min, 離心5min收集細(xì)胞,無機(jī)鹽洗漆液重懸細(xì)胞，12，000r/min,離心5min,收集細(xì)胞,再重復(fù)洗滌兩次，最后用無機(jī)鹽洗滌液重懸細(xì)胞，使0D_達(dá)到20。
14
31.將孔徑O. 22 μ m的濾膜正面朝上放置在E. coli和A. caldus的接合培養(yǎng)基上， 將收集到的E. coliSMlO和A. caldus菌液按照I : 3的比例混合后，取50 μ L滴到濾菌膜上，輕輕涂均勻，37°C放置48h后，用5mL洗滌液洗滌濾膜，得到的細(xì)胞懸液梯度稀釋后涂布含卡那霉素80 μ g/mL的Starky-Na2S2O3固體培養(yǎng)基上，37 °C，培養(yǎng)7 10天。32.挑取篩選平板上的菌落,溶于10μ L無菌水中，取2μ L菌液為模板，使用引物 oriT EcoR sen和oriT Sal ant菌落PCR，并以野生型菌株染色體為模板作為陰性對照，以質(zhì)粒pSDUDI-Λ soxYZ為模板作為陽性對照，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，正對照所在的泳道會產(chǎn)生740bp的PCR產(chǎn)物條帶；負(fù)對照在相應(yīng)的區(qū)域則無PCR產(chǎn)物條帶；挑取的驗(yàn)證樣品中，若在相應(yīng)區(qū)域產(chǎn)生與正對照相似的條帶，說明為單交換子，若無條帶產(chǎn)生與負(fù)對照相似，說明為假陽性；上述引物序列是oriT EcoR sen ATTCCGGAATTCGCTCGTCCTGCTTCTCTTCGoriT Sal ant TCACGCGTCGACCGGGATTCAACCCACTCG。33.將單交換子菌懸液接到20mL Starky-S0液體培養(yǎng)基中39°C，125r/min培養(yǎng) 6-9天，再全部轉(zhuǎn)接到150mLStarky-S°液體培養(yǎng)基中39°C 125r/min培養(yǎng)6d后，提取染色體使用TIANamp Bacteria DNA Kit(購自 TIANGEN BIOTECH, Code :DP302)，具體操作如下(I)取細(xì)菌培養(yǎng)液601^，41，800\8，離心IOmin去除細(xì)胞懸液中Starky-Sci培養(yǎng)基帶入的硫粉，取上清12000r/min,離心5min收集細(xì)胞,盡量吸盡上清。(2)向菌體沉淀中加入200 μ L緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。(3)向管中加入20 μ L蛋白酶K溶液，混勻。(4)加入220 μ L緩沖液GB，振蕩15s，70°C放置lOmin，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以
去除管內(nèi)壁的水珠。(5)加入220 μ L無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心去除管內(nèi)壁的水珠。(6)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入500 μ L緩沖液GD, 12，000r/min離心30s,倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。(8)向吸附柱CB3中加入600 μ L漂洗液Pff, 12，000r/min離心30s,倒掉廢液，將
吸附柱放入收集管中。(9)重復(fù)操作步驟8。(10)將吸附柱CB3放回收集管中，12，000r/min離心2min，倒掉廢液。將吸附柱 CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。(11)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50 μ L洗脫緩沖液TE，12，000r/min離心2min，將溶液收集到離心管中。
34.在soxYZ同源臂外側(cè)設(shè)計(jì)引物2520YANZH sen和2520YANZH ant PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，并以野生型菌株染色體為陰性對照，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，陰性對照所在的泳道會產(chǎn)生4. 8Kb的PCR產(chǎn)物條帶，挑取的驗(yàn)證樣品所在的泳道若產(chǎn)生12. 5Kb的PCR產(chǎn)物條帶，說明為單交換子，若無，說明為假陽性。上述引物序列是2520YANZH sen CCGGGTTCCTGGTAAGTC2520YANZH ant GCTTACTGGCACTGCGATTA35.以質(zhì)粒pACBSR上氯霉素抗性基因開放閱讀框?yàn)榛A(chǔ)，通過兩輪PCR，將原來的啟動子替換為可以在A. caldusMTH-04中使用的質(zhì)粒pBR322 (購自TAKARA公司)上的四環(huán)素抗性基因啟動子P2:第一輪PCR 以質(zhì)粒pACBSR為模板，引物Cm Slsen, Cm ant擴(kuò)增氯霉素抗性基因開放閱讀框；第二輪PCR :以第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物切膠回收后作為模板，使用引物CmS2Sen、Cm ant進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物816bp，獲得了含有啟動子P2的氯霉素抗性基因。上述引物序列是Cm Slsen GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGGAGAAAAAAATCACTGGCmS2sen CTGAGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCATCCATAAGGTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGCm ant CTTCGTGCACATTCATCCGCTTATTATCACTT36.擴(kuò)增 pJRD215 的 oriV> mob 及 rep 部分以質(zhì)粒pJRD215 為模板，引物 P215sen、P215ant 擴(kuò)增 pJRD215 的 oriV、mob 及 r印部分。上述引物序列是P215sen CTTCGTGCACTCCTTGCAATACTGTGTTP215ant CTTCATGCATCCCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCA37.將獲得的PJRD215擴(kuò)增部分與優(yōu)化啟動子的氯霉素抗性基因部分，分別用 Alw44I、EcoT22I雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH 5 α，利用氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行驗(yàn)證，，該質(zhì)粒即為中間質(zhì)粒pSDU。38.擴(kuò)增oriV, mob, rep及氯霉素抗性部分以質(zhì)粒pSDU 為模板，引物 pSDU-EcoT sen 和 pSDU-XhoI ant 擴(kuò)增 oriV, mob, rep 及氯霉素抗性部分。上述引物序列是pSDU-EcoT sen CTTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCpSDU-XhoI ant ACTCCTCGAGAGAGCATACATCTGGAAGCA
39. PCR擴(kuò)增tac啟動子部分
部分。以質(zhì)粒載體pMMB6為模板，引物tac-XhoI sen和tac_EcoT ant擴(kuò)增tac啟動子
tac-XhoI sen ACTCCTCGAGATCGACTGCACGGTG
tac-EcoT ant CTTCATGCATTGTTTCCTGTGTGAAATTG
40.將38和39中兩次PCR得到的產(chǎn)物使用EcoT22I和XhoI雙酶切，純化后，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH 5 α，利用氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行驗(yàn)證，該質(zhì)粒即為中間質(zhì)粒pSDUl-tac。
41. PCR擴(kuò)增質(zhì)粒載體和啟動子部分pSDUl-tac
使用引物pSDUlEcoT-Xba sen 和 tac Bam-Pst ant,以質(zhì)粒 pSDUl-tac 為模板,PCR擴(kuò)增出質(zhì)粒載體和啟動子部分pSDUl-tac。
上述引物序列是
pSDUlEcoT-Xba sen
CTTCATGCATTCTAGATCATGTTTGACAGCTTATC
tac Bam-Pst I ant
TCGCGGATCCTCCTGCAGTGTTTCCTGTGTGAAATTG
42. PCR擴(kuò)增I-SceI表達(dá)基因
使用引物0F131Bam sen和0F132XbaI ant,以質(zhì)粒pACBSR為模板，PCR擴(kuò)增出I-SceI表達(dá)基因。
上述引物序列是
OFl3IBam sen
TTACGCGGATCCAGGAGGGTACCTATATGCATATGAAAAACATCAAAAAAAACC
0F132XbaI ant
TTCTTCTCTAGAACGTCGGGCCCTTATTTCAGGAAAGTTTCGGAGGAG
43.將29和30中得到的PCR產(chǎn)物純化后，BamHI和XbaI雙酶切。
44.酶切液純化后利用T4DNA連接酶16°C過夜連接。
45.連接液轉(zhuǎn)入E. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，吸取50 μ L涂布在含氯霉素30 μ g/
mL的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h。46.挑取篩選平板上的菌落，溶于10 μ L無菌水中，菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子菌懸液接種于20mL LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，并測序確認(rèn)，該質(zhì)粒即為pSDUl-1-SceI，所述質(zhì)粒pSDUl-1-SceI的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。47.將單交換子接種于Starky-S0液體培養(yǎng)基中，120r/min，39°C振蕩培養(yǎng)5. 5d， 12，000r/min, lOmin, 4°C離心收集細(xì)胞；無機(jī)鹽洗漆液重懸細(xì)胞，2，000r/min, 5min, 4°C離心除去細(xì)胞懸液中Starky-Sci培養(yǎng)基帶入的硫粉；取上清,5，000r/min, 5min, 4°C收集細(xì)胞； 無機(jī)鹽洗滌液再次重懸細(xì)胞，5，000r/min，5min，4°C收集細(xì)胞；高pH磷酸緩沖液重懸細(xì)胞， 4，000r/min, 5min,4°C收集細(xì)胞；冰浴的超純水重懸清洗細(xì)胞，4，000r/min, 5min,4°C收集細(xì)胞；冰浴的超純水再次重懸清洗細(xì)胞，3，000r/min，5min，4°C收集細(xì)胞，最后用冰浴的超純水稀釋細(xì)胞，使0D_達(dá)到I. O。48.取8 μ I質(zhì)粒pSDUl-1-SceI與400 μ I菌體混合，冰上放置lOmin，然后加入
17到O. 2cm冰浴的電轉(zhuǎn)化杯中，使用Bio-Rad MicroPulser 型電擊儀，設(shè)置電轉(zhuǎn)化參數(shù)電壓10，500V/cm ;電阻400 Ω ;電容25 μ F，將冰浴的電轉(zhuǎn)化杯放到電轉(zhuǎn)化槽中，按照設(shè)置的電轉(zhuǎn)化參數(shù)，進(jìn)行電擊。49.取出電轉(zhuǎn)化杯，吸出菌懸液，加入到ZOmLStarky-Sc^f體培養(yǎng)基中，37°C，60r/ min過夜培養(yǎng)后加入氯霉素使其終濃度達(dá)30 μ g/ml，提高轉(zhuǎn)速至120r/min，再培養(yǎng)48h。50.取50 μ L培養(yǎng)液，涂布于含有氯霉素30 μ g/mL的Starky-Na2S2O3固體篩選平板。37°C倒置培養(yǎng)10 15d。51.在 soxYZ 上下游 150_250bp 處設(shè)計(jì)引物 2520test sen 和 2520test ant，挑取篩選平板上的菌落，溶于10 μ L無菌水中，取2 μ L菌液為模板菌落PCR篩選，并以野生型菌株染色體為陰性對照，以單交換子染色體為陽性對照，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，陰性對照所在的泳道會產(chǎn)生I. 2Kb的PCR產(chǎn)物條帶，陽性對照所在的泳道會產(chǎn)生I. 2Kb和320bp 兩條PCR產(chǎn)物條帶，挑取的樣品所在的泳道若只有一條PCR產(chǎn)物條帶，且為320bp，說明為雙交換子，若無，說明為假陽性。上述引物序列是2520 test sen AAATTGCGGAAAGTCTCG2520 test ant TGGGTATCGGTGATGTGC52.將篩選到的雙交換子菌懸液接到20mL Starky-S0液體培養(yǎng)基中39°C，125r/ min培養(yǎng)6-9d，再全部轉(zhuǎn)接到150mL Starky-Sci液體培養(yǎng)基中39°C 125r/min培養(yǎng)6d后，提取染色體。53.使用引物2520YANZH sen和2520YANZH ant PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，并以野生型菌株染色體為陰性對照，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，陰性對照所在的泳道會產(chǎn)生4. 8Kb的PCR 產(chǎn)物條帶，挑取的驗(yàn)證樣品所在的泳道若產(chǎn)生3. 9Kb的PCR產(chǎn)物條帶，說明為雙交換子，若無，說明為假陽性。上述LB培養(yǎng)基配方蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl :10g,用2N NaOH溶液調(diào)pH至7. O 7. 5,加蒸懼水至IOOOmL,固體培養(yǎng)基加I. 8%瓊脂粉，15磅/cm2高壓蒸汽滅菌20min。 上述喜溫硫桿菌Starky_S°液體培養(yǎng)基配方(NH4)2SO4 2g ；KH2PO4 3g ；MgS04 · 7H20 :0. 5g ；FeS04 · 7H20 :0. Olg ；CaCl2 · 2H20 0.25g;加800mL自來水溶解，用濃H2SO4調(diào)pH 2. 5 3. 5，用自來水補(bǔ)足體積至1000mL。15 磅/cm2，蒸汽滅菌20min。硫磺粉放于干燥的三角瓶中，用塑料膜將瓶口封緊，常壓蒸煮滅菌 2h以上。臨用前，用滅菌的藥匙取一定量的硫磺粉加入Starky無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，至終濃度 20g/L。上述喜溫硫桿菌Starky-Na2S2O3固體培養(yǎng)基配方A (NH4)2SO4 0. 6g ；KH2PO4 :0. 6g ；MgS04 ·7Η20 :0. Ig ；CaCl2 ·2Η20 :0. 05g ;加蒸餾水至 10OmT,η 自然 pH 4. 8,15 磅/cm2,滅菌 20min。B :瓊脂粉2g ;蒸懼水IOOmL ；15 磅 /cm2,滅菌 20min。C =Na2S2O3 2g ；FeS04 · 7H20 :0. 006g ;蒸餾水 10ml，過濾除菌。
A和B分別煮沸后冷卻至80°C混合，然后加入C混勻，制備固體平板。上述大腸桿菌和喜溫硫桿菌的接合固體培養(yǎng)基配方在喜溫硫桿菌 Starky-Na2S2O3固體培養(yǎng)基的A液中加入O. 05%酵母粉。上述無機(jī)鹽洗滌液配方(NH4) 2S04 0. 6g ；KH2PO4 :0. 6g ；MgS04 · 7H20 :0. Ig ；CaCl2 · 2H20 :0. 05g ;加蒸餾水至 200mL,自然 pH, 15 磅 /cm2,滅菌 2Omin0 上述高pH磷酸緩沖溶液配方 NaCl 8g, KCl O. 2g, Na2HPO4 :1. 44g, KH2PO4 :0. 24g，溶于 800ml 高純水中，HCl 調(diào) pH至7. 4，用純水定容至IL ;高壓滅菌，4°C保存。
19
權(quán)利要求
1.一種無痕敲除嗜酸性喜溫硫桿菌染色體基因或?qū)⑼庠椿虿迦胧人嵝韵矞亓驐U菌染色體的方法，步驟包括構(gòu)建同源重組的自殺型質(zhì)粒載體，在載體的多克隆位點(diǎn)處插入同源臂得到同源重組質(zhì)粒，將構(gòu)建的同源重組質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌SMlO菌株， 通過接合轉(zhuǎn)移法將同源重組質(zhì)粒從E. coli SMlO菌轉(zhuǎn)入嗜酸性喜溫硫桿菌中，平板篩選單交換子并進(jìn)一步鑒定，構(gòu)建大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI的表達(dá)質(zhì)粒并用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入單交換子中，平板篩選雙交換子并進(jìn)一步鑒定；其中所述自殺型質(zhì)粒載體是pSDUDI，質(zhì)粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示； 所述同源重組質(zhì)粒是pSDUDI- Δ soxYZ,將其從E. coli SMlO菌轉(zhuǎn)入嗜酸性喜溫硫桿菌中的方法是將收集到的E. coli SMlO和嗜酸性喜溫硫桿菌菌液按照I : 3的比例混合后， 取50ul滴到接合平板上的濾菌膜上，37°C放置48h后，用5mL洗滌液洗滌濾膜，得到的細(xì)胞懸液梯度稀釋后涂布加入卡那霉素的Starky-Na2S2O3固體培養(yǎng)基上，37 °C，培養(yǎng)7 10天； 所述平板篩選單交換子并進(jìn)一步鑒定的方法是挑取篩選平板上的菌落，溶于無菌水中，取菌液為模板，使用引物oriT EcoR sen和oriT Sal ant特異性擴(kuò)增自殺型質(zhì)粒載體上接合轉(zhuǎn)移基因oriT，并以野生型菌株染色體為模板作為陰性對照，以質(zhì)粒pSDUDI-Λ soxYZ 為模板作為陽性對照，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，正對照所在的泳道會產(chǎn)生740bp的 PCR產(chǎn)物條帶；負(fù)對照在相應(yīng)的區(qū)域則無PCR產(chǎn)物條帶；挑取的驗(yàn)證樣品中，若在相應(yīng)區(qū)域產(chǎn)生與正對照相似的條帶，為單交換子，若無條帶產(chǎn)生與負(fù)對照相似，為假陽性；對單交換子進(jìn)一步鑒定方法是提取單交換子染色體，在被敲除基因的同源臂外側(cè)設(shè)計(jì)引物 2520YANZH sen和2520YANZH ant用PCR擴(kuò)增，并以野生型菌株染色體為陰性對照，如果瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示以單交換子染色體為模板PCR擴(kuò)增得到的條帶比陰性對照大7 8Kb，則進(jìn)一步確定是單交換子，若無，則為假陽性；上述引物序列是oriT EcoR sen ATTCCGGAATTCGCTCGTCCTGCTTCTCTTCG oriT Sal ant TCACGCGTCGACCGGGATTCAACCCACTCG 2520YANZH sen CCGGGTTCCTGGTAAGTC 2520YANZH ant GCTTACTGGCACTGCGATTA所述大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI的表達(dá)質(zhì)粒是pSDUl-I-Scel，質(zhì)粒pSDUl-I-Sce I的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；所述表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入單交換子中的電轉(zhuǎn)化參數(shù)是電壓10，500V/cm ;電阻 400 Ω ;電容25μ F ；所述平板篩選雙交換子方法是電轉(zhuǎn)化后將菌懸液加入到Starky-Sci液體培養(yǎng)基中， 37°C，50 60rpm過夜培養(yǎng)后加入氯霉素，轉(zhuǎn)速提高到100 120r/min再培養(yǎng)36_60h后， 梯度稀釋涂布于加入氯霉素的篩選平板上，37°C倒置培養(yǎng)10 15天；在篩選平板上挑取菌落，在被敲除基因上下游150 250bp處設(shè)計(jì)引物2520test sen和2520test ant,用菌落 PCR擴(kuò)增，如果瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示只在300 500bp處有目的條帶，則初步判斷是雙交換子；上述引物序列是2520test sen AAATTGCGGAAAGTCTCG2520test ant TGGGTATCGGTGATGTGC所述雙交換子的進(jìn)一步鑒定方法是將篩選到的雙交換子菌落培養(yǎng)后提取染色體，在被敲除基因同源臂的外側(cè)設(shè)計(jì)引物2520YANZH sen和2520YANZH ant PCR擴(kuò)增驗(yàn)證被敲除基因上下游區(qū)域，以雙交換子染色體為模板用PCR擴(kuò)增，并以野生型菌株染色體為陰性對照，如果瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示以雙交換子染色體為模板擴(kuò)增得到的產(chǎn)物比陰性對照小，且差值是被敲除基因的大小，則進(jìn)一步確定是雙交換子。
2.一種應(yīng)用于嗜酸性喜溫硫桿菌染色體基因無痕敲除和整合的同源重組自殺型質(zhì)粒載體，其特征在于，所述質(zhì)粒載體命名為pSDUDI，質(zhì)粒pSDUDI的核苷酸序列如SEQ IDNo. I 所示；其中所述質(zhì)粒載體必須包含接合轉(zhuǎn)移基因oriT，大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI酶切位點(diǎn)，用于篩選的卡那霉素抗性基因Km和氨芐青霉素抗性基因Amp，以及適于同源臂插入的多克隆位點(diǎn)MCS。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用于嗜酸性喜溫硫桿菌染色體基因無痕敲除和整合的同源重組自殺型質(zhì)粒載體，其特征在于，所述插入的同源臂核苷酸片段必須大于IKb。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用于嗜酸性喜溫硫桿菌染色體基因無痕敲除和整合的同源重組自殺型質(zhì)粒載體，其特征在于，所述插入的同源臂核苷酸片段為I. 5Kb。
5.一種應(yīng)用于嗜酸性喜溫硫桿菌中表達(dá)大范圍核酸內(nèi)切酶的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于， 所述質(zhì)粒命名為pSDUl-1-SceI，質(zhì)粒pSDUl-1-Sce I的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示; 其中所述質(zhì)粒pSDUl-1-SceI由質(zhì)粒載體pSDUl，啟動子tac，大范圍核酸內(nèi)切酶表達(dá)基因 I-SceI 構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無痕敲除嗜酸性喜溫硫桿菌染色體基因或?qū)⑼庠椿虿迦肴旧w的方法，是將含有大范圍核酸內(nèi)切酶I-SceI酶切位點(diǎn)的同源重組質(zhì)粒采用接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)入喜溫硫桿菌中，同時利用細(xì)胞自身的同源重組系統(tǒng)，將同源重組質(zhì)粒定向插入到喜溫硫桿菌染色體中，篩選到的單交換子用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入I-SceI表達(dá)質(zhì)粒，在I-SceI酶切斷染色體的壓力下，單交換子染色體發(fā)生第二次同源重組，優(yōu)化篩選到雙交換菌株，實(shí)現(xiàn)了基因的敲除或插入。本發(fā)明同時構(gòu)建了用于同源重組的自殺型質(zhì)粒載體pSDUDI，和有效表達(dá)I-SceI酶的質(zhì)粒pSDU1-I-SceI，為喜溫硫桿菌中染色體基因的無痕敲除或整合提供了便利。本發(fā)明方法為喜溫硫桿菌的深入研究和改造提供了新的途徑。
文檔編號C12N15/09GK102604929SQ201210089108
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者吳燕, 張成家, 林建強(qiáng), 林建群 申請人:山東大學(xué)