專利名稱：地貧誘導多能干細胞及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域。具體地，本發明涉及地貧誘導多能干細胞及其制備方法和用途。
背景技術：
地中海貧血(thalassemia，地貧)是一組全球最常見的單基因遺傳病，是由于珠蛋白基因缺陷導致血紅蛋白(hemoglobin, Hb)功能異常的疾病,表現為慢性進行性溶血性貧血。地貧在我國廣東、廣西等地的人群中發病率非常高，目前主要依賴定期輸血進行維持治療，給病人及社會帶來了沉重的負擔。其中，重型P地中海貧血的治療難度更大。異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)是目前根治重型P地中海貧血的惟一臨床手段。但眾所周知，造血干細胞的來源及移植后的排斥極大限制了其臨床應用。多能性干細胞(pluripotent stem cell)是一類能夠維持自我更新并具有多潛能分化能力的干細胞，在再生醫學方面具有廣闊的應用前景。而通過誘導性多能干細胞(iPS細胞)技術，能夠獲得充足的、自體來源的iPS細胞，從而能夠將獲得的iPS細胞應用于疾病治療例如P -地中海貧血的治療，并且能夠有效地避免免疫排斥問題。然而，目前的誘導性多能干細胞技術，尤其是制備地貧誘導多能干細胞的方法，仍有待改進。

發明內容
本發明是基于發明人的下列發現而完成的目前的誘導性多能干細胞技術，具有外源基因整合等問題，可能會影響插入基因的表達調控。本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠有效制備地貧誘導多能干細胞的方法。為此，根據本發明的一個方面，本發明提供了一種地貧誘導多能干細胞。根據本發明的實施例，該地貧誘導多能干細胞衍生自地中海貧血癥患者的體細胞，并且該誘導多能干細胞的基因組中包含正常P珠蛋白基因。根據本發明實施例的地貧誘導多功能干細胞或其衍生物能夠在適當的條件下有效地分化為造血干細胞，并且該造血干細胞能夠表達正常@珠蛋白基因，進一步造血干細胞能夠被引入地中海貧血癥患者體內，從而能夠有效地治療地中海貧血癥。根據本發明的另一方面，本發明提供了一種制備地貧誘導多能干細胞的方法。根據本發明的實施例，該方法包括將多能干細胞誘導因子引入地中海貧血癥患者的體細胞中，其中，地中海貧血癥患者體細胞基因組中的P珠蛋白基因與正常P珠蛋白基因相比，存在選自下列的至少一種突變CD41/42(-4bp)、IVS-11-654(C - T),CD71/72 (+A)、-28 (A — G)、CD17 (A — T)、IVSl-I (G — T)、IVS1-5 (G — C)、CD8/9 (+G)、CD15(G —A)、CD26(G —A)和CD30 (G — C);將引入多能干細胞誘導因子的體細胞在適于重編程的培養基中進行培養，以便獲得原始誘導多能干細胞；以及向原始誘導多能干細胞中引入編碼正常0珠蛋白的核酸，以便獲得地貧誘導多能干細胞，該地貧誘導多能干細胞的基因組中包含正常0珠蛋白基因。利用根據本發明實施例的制備地貧誘導多能干細胞的方法，能夠有效地制備地貧誘導多能干細胞，并且獲得的地貧誘導多能干細胞能夠在適當的條件下有效地分化為造血干細胞，并且該造血干細胞能夠表達正常3珠蛋白基因，進一步造血干細胞能夠被弓I入地中海貧血癥患者體內，從而能夠有效地治療地中海貧血癥。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種載體。根據本發明的實施例，該載體包括第一核酸分子，該第一核酸分子包含編碼正常3珠蛋白的核酸序列；第二核酸分子，該第二核酸分子位于第一核酸分子的5’側，并且第二核酸分子包含編碼篩選基因的核酸序列；兩個IoxP位點，這兩個Ioxp位點分別位于第二核酸分子的5’側和3’側，其中位于第二核酸分子5’側的IoxP位點位于第二核酸分子和第一核酸分子之間。由此，利用該載體轉化地中海貧血癥患者的體細胞，能夠獲得地貧誘導多能干細胞，并且其能夠在適當的條件下有效地分化為能夠表達正常3珠蛋白基因的造血干細胞，從而本發明的載體能夠成功修復地中海貧血癥患者體細胞中的突變。并且在修復成功后，能夠通過ere重組酶將兩個Ioxp位點之間的篩選基因從細胞基因組中刪除，從而能夠避免外源基因的干擾，維持原始細胞的基因組完整性。根據本發明的再一方面，本發明提供了一組載體。根據本發明的實施例，該組載體包含第一載體，該第一載體為前面所述的根據本發明實施例的載體；以及第二載體，該第二載體攜帶編碼鋅指核酸酶的核酸分子，其中鋅指核酸酶特異性識別3珠蛋白基因的3’下游區域，包括任選3’UTR區域以及下游區域。利用本發明的一組載體，能夠方便有效地將地中海貧血癥患者的體細胞轉化誘導為能夠表達正常P珠蛋白基因的多能干細胞，并且轉化過程中對原始細胞基因組剪切的影響最低，細胞基因組中無外源基因的插入。根據本發明的另一方面，本發明提供了前面所述的根據本發明實施例的一種載體，或一組載體在制備地貧誘導多能干細胞中的用途。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種制備造血干細胞的方法。根據本發明的實施例，該方法包括在適于造血分化的條件下，培養根據本發明實施例的地貧誘導多能干細胞，以便獲得造血干細胞。利用根據本發明實施例的制備造血干細胞的方法，能夠有效地制備造血干細胞，進一步獲得的造血干細胞能夠被引入地中海貧血癥患者體內，從而能夠有效地治療地中海貧血癥。根據本發明的再一方面，本發明提供了一種造血干細胞。根據本發明的實施例，該造血干細胞是通過根據本發明實施例的制備造血干細胞的方法得到的。根據本發明實施例的造血干細胞能夠有效地應用于地中海貧血癥治療，具體地，將本發明的造血干細胞引入地中海貧血癥患者體內，即能夠有效地治療地中海貧血癥。根據本發明的另一方面，本發明提供了根據本發明實施例的地貧誘導多能干細胞在制備藥物以及藥物庫篩選中的用途，所述藥物用于治療地中海貧血癥。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種治療地中海貧血癥的方法。根據本發明的實施例，該方法包括分離患者的體細胞；根據本發明實施例的制備地貧誘導多能干細胞的方法，基于體細胞，制備地貧誘導多能干細胞；以及將地貧誘導多能干細胞或其衍生物引入患者體內。利用根據本發明實施例的治療地中海貧血癥的方法，能夠有效地對地中海貧血癥患者進行治療。、
根據本發明的再 一方面，本發明提供了一種試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒包括前面所述的根據本發明實施例的一種載體，或一組載體。根據本發明的實施例，利用該試劑盒能夠有效地對地中海貧血癥患者的體細胞進行轉化，進而能夠有效地獲得包含正常P珠蛋白基因的地貧誘導多能干細胞，且細胞基因組中無外源基因的插入。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。


本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I顯示了根據本發明一個實施例的第一載體的結構示意圖；圖2顯示了根據本發明一個實施例的原始誘導多能干細胞的非整合鑒定結果；圖3顯示了根據本發明一個實施例的地貧誘導多能干細胞的PCR鑒定結果；圖4顯示了根據本發明一個實施例的地貧誘導多能干細胞以及前述的原始誘導多能干細胞的目的片段測序圖譜；以及圖5顯示了根據本發明一個實施例的地貧誘導多能干細胞分化前后的表面標記免疫熒光流式細胞儀檢測圖。
具體實施例方式下面詳細描述本發明的實施例，其中通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。根據本發明的一個方面，本發明提供了一種地貧誘導多能干細胞。根據本發明的實施例，該地貧誘導多能干細胞衍生自地中海貧血癥患者的體細胞，并且該誘導多能干細胞的基因組中包含正常P珠蛋白基因。根據本發明實施例的地貧誘導多功能干細胞或其衍生物能夠在適當的條件下有效地分化為造血干細胞，并且該造血干細胞能夠表達正常3珠蛋白基因，進一步造血干細胞能夠被引入地中海貧血癥患者體內，從而能夠有效地治療地中海貧血癥。根據本發明的實施例，地中海貧血癥患者體細胞基因組中的P珠蛋白基因與正常^珠蛋白基因相比，存在選自下列的至少一種突變CD41/42(-4bp)、IVS-II-654(C —T)、CD71/72 (+A)、-28 (A — G)、CD17 (A — T)、IVSl-I (G — T)、IVS1-5 (G — C)、CD8/9 (+G)、CD15(G — A)、CD26 (G — A)和 CD30 (G — C)。其中，CD41/42 (_4bp)、IVS-11-654 (C — T)、CD71/72(+A)、-28(A —G)和CD17(A —T)等P珠蛋白基因突變為中國南方地中海貧血癥發病率最高的類型。根據本發明的實施例，地貧誘導多能干細胞的基因組中的P珠蛋白基因均為正常@珠蛋白基因。由此，本發明的地貧誘導多能干細胞能夠在適當的條件下有效地分化為造血干細胞，并且該造血干細胞能夠表達正常P珠蛋白基因。根據本發明的實施例，體細胞的類型并不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，體細胞可以為選自地中海貧血癥患者的尿液細胞、血液細胞、皮膚細胞、羊水細胞、角質細胞和臍血細胞的至少一種，優選為選自羊水細胞和尿液細胞的至少一種。根據本發明的實施例，地貧誘導多能干細胞不含有外源基因。由此，本發明的地貧誘導多能干細胞能夠保持地中海貧血癥患者體細胞基因組的完整性，避免了外源基因可能導致的致癌性。根據本發明的另一方面，本發明提供了一種制備地貧誘導多能干細胞的方法。根據本發明的實施例，該方法包括將多能干細胞誘導因子引入地中海貧血癥患者的體細胞中，其中，地中海貧血癥患者體細胞基因組中的P珠蛋白基因與正常P珠蛋白基因相比，存在選自下列的至少一種突變CD41/42(-4bp)、IVS-11-654(C - T),CD71/72 (+A)、-28 (A — G)、CD17 (A — T)、IVSl-I (G — T)、IVS1-5 (G — C)、CD8/9 (+G)、CD15(G —A)、CD26(G —A)和CD30 (G — C);將引入多能干細胞誘導因子的體細胞在適于重編程的培養基中進行培養，以便獲得原始誘導多能干細胞；以及向原始誘導多能干細胞中引入編碼正常P珠蛋白的核酸，以便獲得地貧誘導多能干細胞，該地貧誘導多能干細胞的基因組中包含正常P珠蛋白基因。利用根據本發明實施例的制備地貧誘導多能干細胞的方法，能夠有效地制備地貧誘導多能干細胞，并且獲得的地貧誘導多能干細胞能夠在適當的條件下有效地分化為造血干細胞，并且該造血干細胞能夠表達正常3珠蛋白基因，進一步造血干細胞能夠被弓I入地中海貧血癥患者體內，從而能夠有效地治療地中海貧血癥。根據本發明的實施例，在本發明的制備地貧誘導多能干細胞的方法中，體細胞的類型并不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，體細胞可以為選自地中海貧血癥患者的尿液細胞、血液細胞、皮膚細胞、羊水細胞、角質細胞和臍血細胞的至少一種，優選為選自羊水細胞和尿液細胞的至少一種。根據本發明的實施例，多能干細胞誘導因子引入地中海貧血癥患者的體細胞中的形式并不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，在本發明的制備地貧誘導多能干細胞的方法中，多能干細胞誘導因子是以cDNA或miRNA的形式引入的。根據本發明的實施例，將多能干細胞誘導因子引入地中海貧血癥患者的體細胞中，是利用攜帶上述多能干細胞誘導因子的載體進行的，其中載體的類型并不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，可以利用選自外隨體載體、病毒載體和質粒載體的至少一種作為載體引入多能干細胞誘導因子，優選采用外隨體載體。這是因為，在人細胞中，外隨體(EPIS0ME)能夠有效地表達其所攜帶的基因，但是其在細胞傳代過程中會逐漸丟失，不會整合到細胞的基因組中，從而能夠保持細胞基因組的完整性，并且，利用外隨體載體誘導的多能干細胞，能夠得到非病毒整合的多能干細胞，無病毒插入到多能干細胞基因組，不會引發機體對多能干細胞的免疫反應，從而能夠有效提高后續實驗的安全性。根據本發明的實施例，多能干細胞誘導因子的種類不受特別限制，可以包括現有技術中常采用的以及發現的具有誘導多能干細胞作用的任何誘導因子，如Soxl、Klf5、I-Myc或n_Myc、Esrrb、LRH等，也可以是其他具有該功能的編碼或非編碼RNA(包括micro RNA、長非編碼RNA)、蛋白質、肽、化合物、細胞因子以及任何可能的組織培養基或培養環境(如低氧)。根據本發明的一些具體示例，多能干細胞誘導因子可以為選自0ct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf5、l-Myc、n-Myc、Esrrb> LRH> Nanog、Lin28 和 miR-302-367 的至少一種，優選米用 0ct4、Sox2、Nanog、Lin28 和miR-302-367的組合。其中，miR-302的加入，能夠有效地提高制備非整合地貧誘導多能干細胞的效率。前面所述的多能干細胞誘導因子均是已公開的，本領域技術人員可以方便地獲取其登錄號等信息，例如0ct4，NCBI登錄號為匪013663 ；Sox2, NCBI登錄號為匪011443。根據本發明的一些實施例，多能干細胞誘導因子還可以為前面所述的幾種多能干細胞誘導因子的變體。根據本發明的實施例，將多能干細胞誘導因子引入地中海貧血癥患者的體細胞中的方法不受特別限制，可以是本領域技術人員熟知的任何轉化技術。根據本發明的一些具體示例，可以采用選自核轉染、病毒感染、脂質體轉染、電穿孔和基因槍的至少一種，將多能干細胞誘導因子引入地中海貧血癥病人的體細胞中，優選采用核轉染方法。由此，能夠有效地將多能干細胞誘導因子引入地中海貧血癥患者的體細胞中，進而利用適于重編程的培養基能夠有效地獲得原始誘導多能干細胞。
根據本發明的實施例，向原始誘導多能干細胞中引入編碼正常P珠蛋白的核酸是通過第一載體進行的，其中，第一載體包括第一核酸分子、第二核酸分子和兩個IoxP位點。其中，第一核酸分子包含編碼正常3珠蛋白的核酸序列，第二核酸分子位于第一核酸分子的3’側，并且第二核酸分子包含編碼篩選基因的核酸序列，兩個Ioxp位點分別位于第二核酸分子的5’側和3’側，其中位于第二核酸分子5’側的IoxP位點位于第二核酸分子和第一核酸分子之間。根據本發明的實施例，第一核酸分子的序列如SEQ ID N0:1所不。根據本發明的實施例，第二核酸分子可以進一步包括啟動子。根據本發明的實施例，該啟動子的類型并不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，啟動子為真核細胞啟動子，該真核細胞啟動子優選為選自PGK啟動子、CMV啟動子啟動子、CAG啟動子和EFl a啟動子的至少一種，由此，能夠使誘導的地貧誘導多能干細胞有效表達篩選基因，進而能夠依據篩選基因的表達情況，對地貧誘導多能干細胞進行篩選，從而能夠有效地獲得陽性的含有正常3珠蛋白基因的地貧誘導多能干細胞。根據本發明的實施例，篩選基因的種類并不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，篩選基因可以為選自藥物抗性基因和編碼發光蛋白的基因的至少一種，發光蛋白優選為選自GFP和EGFP的至少一種，藥物抗性基因優選為選自新霉素磷酸轉移酶、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和殺稻瘟菌素抗性基因的至少一種。由此，依據誘導的地貧誘導多能干細胞對相應藥物的抗性或熒光發生情況，能夠方便有效地篩選出陽性細胞，從而有效能夠提高制備地貧誘導多能干細胞的效率。根據本發明的實施例，第一載體可以進一步包括第三核酸分子，第三核酸分子位于第二核酸分子的3’側，并且第三核酸分子為同源重組所需要的P珠蛋白基因下游的序列。根據本發明的實施例，第三核酸分子可以為P珠蛋白基因的3’下游區域。根據本發明的一些具體示例，第三核酸分子可以為P珠蛋白基因的3’ UTR區域以及下游區域。由此，能夠有效地避免剪切對P珠蛋白基因的影響。根據本發明的一個實施例，在本發明的制備地貧誘導多能干細胞的方法中，第一載體具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，并且具有附圖I所示的結構，其中，如圖I所示，第一載體以第一核酸分子(5arm)、第二核酸分子(PGK-Puro-PA)和兩個IoxP位點作為左臂，以第三核酸分子作為右臂(3arm)。根據本發明的實施例，在本發明的制備地貧誘導多能干細胞的方法中，可以進一步包括向原始誘導多能干細胞中引入編碼鋅指核酸酶的核酸分子，其中鋅指核酸酶特異性識別P珠蛋白基因的3’下游區域。根據本發明的一些具體示例，鋅指核酸酶特異性識別3珠蛋白基因的3’ UTR區域以及下游區域。根據本發明的實施例，編碼鋅指核酸酶的核酸分子有兩個，分別具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的所示的序列。由此，利用編碼鋅指核酸酶的核酸分子，能夠將原始誘導多能干細胞在基因組的目的位點進行準確有效地剪切，從而能夠進一步有效地提高第一載體及編碼正常3珠蛋白的核酸序列對基因的修復效率，至少可以使修復效率提高100倍，從而能夠有效地提高制備地貧誘導多能干細胞的效率。
根據本發明的實施例，在本發明的制備地貧誘導多能干細胞的方法中，第一載體可以包括兩個載體，這兩個載體中分別包含不同的篩選基因。根據本發明的一些具體示例，第一載體可以包括兩個載體，這兩個載體中分別包含新霉素磷酸轉移酶和嘌呤霉素抗性基因。由此，能夠顯著提高篩選陽性地貧誘導多功能干細胞的效率。此外，根據本發明的實施例，在本發明的制備地貧誘導多能干細胞的方法中，向所述原始誘導多能干細胞中引入編碼正常0珠蛋白的核酸的步驟，在本文中有時也稱為“對原始誘導多能干細胞進行原位基因修復或基因修復”。根據本發明的一些實施例，在本發明的制備地貧誘導多能干細胞的方法中，對于基因組中等位基因發生雙突變的地中海貧血癥患者體細胞，可以對其進行雙修復，即同時對基因組中兩條染色體上的等位基因均進行修復，從而能夠有效地獲得該地貧重癥患者的地貧誘導多能干細胞，而利用分別包含不同藥 物抗性基因的兩個第一載體，通過分步法雙修復，能夠顯著提高制備所述地貧重癥患者的地貧誘導多能干細胞的效率。需要說明的是，在本文中所使用的術語“第一”、“第二”、“第三”僅為了描述方便，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數量。此外，在本發明的制備地貧誘導多能干細胞的方法中，均不使用來源于動物血清和小鼠飼養層的培養條件，這是因為，動物血清和小鼠飼養層的培養條件會使得干細胞在臨床應用中受到限制。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種載體。根據本發明的實施例，該載體包括第一核酸分子、第二核酸分子和兩個IoxP位點，其中，第一核酸分子包含編碼正常@珠蛋白的核酸序列；第二核酸分子位于第一核酸分子的5’側，并且第二核酸分子包含編碼篩選基因的核酸序列；兩個Ioxp位點分別位于第二核酸分子的5’側和3’側，其中位于第二核酸分子5’側的IoxP位點位于第二核酸分子和第一核酸分子之間。由此，利用本發明的載體轉化地中海貧血癥患者的體細胞，能夠有效地獲得包含正常3珠蛋白基因的地貧誘導多能干細胞，從而能夠成功修復地中海貧血癥患者體細胞中的突變。并且在修復成功后，能夠通過ere重組酶將兩個Ioxp位點之間的篩選基因從細胞基因組中刪除，從而能夠避免外源基因的干擾，維持原始細胞的基因組完整性。根據本發明的實施例，在本發明的載體中，第一核酸分子的序列如SEQ ID N0:1所不。根據本發明的實施例，第二核酸分子可以進一步包括啟動子。根據本發明的實施例，該啟動子的類型并不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，啟動子為真核細胞啟動子，該真核細胞啟動子優選為選自PGK啟動子、CMV啟動子啟動子、CAG啟動子和EFl a啟動子的至少一種，由此，利用本發明的載體轉化誘導地中海貧血癥患者的體細胞，能夠使誘導的地貧誘導多能干細胞有效表達篩選基因，進而能夠依據篩選基因的表達情況，篩選出陽性的地貧誘導多能干細胞。根據本發明的實施例，篩選基因的種類并不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，篩選基因可以為選自藥物抗性基因和編碼發光蛋白的基因的至少一種，發光蛋白優選為選自GFP和EGFP的至少一種，藥物抗性基因優選為選自新霉素磷酸轉移酶、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和殺稻瘟菌素抗性基因的至少一種。由此，依據誘導的地貧誘導多能干細胞對相應藥物的抗性或熒光發生情況，能夠方便有效地對利用本發明的載體獲得的地貧誘導多能干細胞進行篩選。根據本發明的實施例，本發明的載體進一步包括第三核酸分子，第三核酸分子位于第二核酸分子的3’側，并且第三核酸分子為同源重組所需要的P珠蛋白基因下游的序列。根據本發明的實施例，第三核酸分子可以為P珠蛋白基因的3’下游區域。根據本發明的一些具體示例，第三核酸分子可以為P珠蛋白基因的3’UTR區域以及下游區域。由此，在利用本發明的載體修復地貧誘導多能干細胞時，能夠有效地避免對P珠蛋白基因的改變。根據本發明的實施例，本發明的載體可以包括兩個載體，這兩個載體中分別包含不同的篩選基因。根據本發明的一些具體示例，本發明的載體可以包括兩個載體，這兩個載 體中分別包含新霉素磷酸轉移酶和嘌呤霉素抗性基因。根據本發明的再一方面，本發明提供了一組載體。根據本發明的實施例，該組載體包含第一載體，該第一載體為前面所述的根據本發明實施例的載體；以及第二載體，該第二載體攜帶編碼鋅指核酸酶的核酸分子，其中鋅指核酸酶特異性識別3珠蛋白基因的3’下游區域，包括任選3’UTR區域以及下游區域。根據本發明的實施例，編碼鋅指核酸酶的核酸分子有兩個，分別具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的所示的序列。利用本發明的一組載體，能夠方便有效地將地中海貧血癥患者的體細胞轉化誘導為包含正常3珠蛋白基因的多能干細胞，并且轉化過程中對原始細胞基因組剪切的影響最低，細胞基因組中無外源基因的插入。根據本發明的另一方面，本發明提供了前面所述的根據本發明實施例的一種載體，或一組載體在制備地貧誘導多能干細胞中的用途。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種制備造血干細胞的方法。根據本發明的實施例，該方法包括在適于造血分化的條件下，培養根據本發明實施例的地貧誘導多能干細胞，以便獲得造血干細胞。利用根據本發明實施例的制備造血干細胞的方法，能夠有效地制備造血干細胞，進一步獲得的造血干細胞能夠被引入地中海貧血癥患者體內，從而能夠有效地治療地中海貧血癥。根據本發明的再一方面，本發明提供了一種造血干細胞。根據本發明的實施例，該造血干細胞是通過根據本發明實施例的制備造血干細胞的方法得到的。根據本發明實施例的造血干細胞能夠有效地應用于地中海貧血癥治療，具體地，將本發明的造血干細胞引入地中海貧血癥患者體內，即能夠有效地治療地中海貧血癥。根據本發明的另一方面，本發明提供了根據本發明實施例的地貧誘導多能干細胞在制備藥物以及藥物庫篩選中的用途，所述藥物用于治療地中海貧血癥。根據本發明的又一方面，本發明提供了一種治療地中海貧血癥的方法。根據本發明的實施例，該方法包括分離患者的體細胞；根據本發明實施例的制備地貧誘導多能干細胞的方法，基于體細胞，制備地貧誘導多能干細胞；以及將地貧誘導多能干細胞或其衍生物引入患者體內。利用根據本發明實施例的治療地中海貧血癥的方法，能夠有效地對地中海貧血癥患者進行治療。根據本發明的再一方面，本發明提供了一種試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒包括前面所述的根據本發明實施例的一種載體，或一組載體。根據本發明的實施例，利用該試劑盒能夠有效地對地中海貧血癥患者的體細胞進行轉化，進而能夠有效地獲得包含正常P珠蛋白基因的地貧誘導多能干細胞，且細胞基因組中無外源基因的插入。需要說明的是，本發明的地貧誘導多能干細胞及其制備方法和用途，是本申請的發明人通過艱苦的創造性勞動和優化的工作而完成的。
下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例I :I、原始誘導多能干細胞的獲得以及鑒定首先，通過核轉染方法，將包含多能干細胞誘導因子的cDNA或miRNA簇的外隨體導入地中海貧血癥患者的羊水細胞中，其中，與正常P珠蛋白基因相比，該地中海貧血癥患者羊水細胞基因組中的P珠蛋白基因的兩條等位基因均發生了同樣的突變，突變類型為IVS-H-654 ;所采用的多能干細胞誘導因子為0ct4、Sox2、Nanog、Lin28和miR-302-367的組合。然后，將引入多能干細胞誘導因子的羊水細胞直接轉入無血清、無細胞飼養層的人胚胎干細胞培養環境中，培養20天后獲得大量生長典型的原始誘導多能干細胞克隆，將這些克隆挑取后繼續培養。隨機挑取兩個獲得的原始誘導多能干細胞，利用PCR方法擴增其外源的誘導因子，以便對其進行非整合鑒定，結果見圖2。圖2顯示了原始誘導多能干細胞的非整合鑒定結果。如圖2所示，-為陰性對照；+為陽性對照；UC為地貧患者的體細胞(羊水細胞)的泳道；iPSl和iPS2為兩個原始誘導多能干細胞的泳道。由圖2可知，兩個原始誘導多能干細胞，以及地貧患者的體細胞，均無任何外源基因的整合。2、地貧誘導多能干細胞的獲得以及鑒定首先，利用EDTA，將在無血清、無細胞飼養層培養至匯合度為80%，并且非整合鑒定為陽性的原始誘導多能干細胞消化至小團塊；收集上述小團塊并去除上清，然后利用電轉液將其進行重懸后分至兩個Eppendorf離心管中，分別記作第一組和第二組；接著，將兩組反應體系分別添加相應的試劑后進行電轉，其中，第一組加入鋅指核酸酶和第一載體，第二組只加入第一載體和攜帶綠色熒光蛋白基因的質粒，其中，第一載體攜帶的篩選基因為嘌呤霉素(puromycin)(請發明人確認此描述是否正確)；將兩組反應體系的轉化細胞，分別于鋪被有matrigel的培養板中繼續培養；培養第4天時，向培養板中添加相應的藥物進行篩選；在利用藥物篩選3-7天后，可以發現第一組中有大約30個藥物抗性克隆，而第二組沒有克隆生長，表明鋅指核酸酶可以顯著提高同源重組修復的效率。第一組中獲得的克隆即為地貧誘導多能干細胞，將其挑取到單獨的培養孔中培養，備用。其中，需要說明的是，第二組采用帶綠色熒光蛋白基因的質粒是為了表征電轉干細胞的效率，因為這個效率很低，約20%。是質量控制的一部分。利用PCR反應和凝膠電泳對獲得的地貧誘導多能干細胞進行鑒定，其中，PCR反應采用引物I和2，引物序列如下所示引物1ATCTTAGAGGGAGGGCTGAGGGITTG (SEQ ID NO 5),引物2ACTAGGGGAGGAGTAGAAGGTGGCG(SEQ ID NO 6),結果見圖3。圖3顯示了地貧誘導多能干細胞的PCR鑒定結果。如圖3所示，M為marker ;水為陰性對照；6、7、9、10、16、19、24、26、30，分別為本實施例獲得的各地貧誘導多能干細胞的泳道。其中，只有基因組中P珠蛋白基因修復后的地貧誘導多能干細胞，才能產生陽性條帶。由圖3可知，6、9、16、24、26、30地貧誘導多能干細胞為陽性克隆。、
接著，采用引物3和4，分別將地貧誘導多能干細胞9和26以及前述的原始誘導多能干細胞的基因組進行PCR擴增，以便獲得包含有P珠蛋白基因的目的片段，然后采用常規測序方法對目的片段進行測序，以便確定對原始誘導多能干細胞的修復是否成功，部分測序圖譜見圖4。其中，引物3和4的序列如下所示引物3TTAGGCAGAATCCAGATGCTCAA(SEQ ID NO 7),引物4ATCTCTTTCTTTCAGGGCAATAATG(SEQ ID NO:8)。圖4顯示了地貧誘導多能干細胞以及前述的原始誘導多能干細胞的目的片段的測序圖譜。其中，若修復成功，則原始誘導多能干細胞中P珠蛋白基因的突變區域的2個T堿基會變成C堿基。如圖4所示，從左至右，第一個測序圖譜為地貧患者的原始誘導多能干細胞的目的片段測序圖；第二和第三個測序圖譜分別為對原始誘導多能干細胞進行單修復、雙修復獲得的地貧誘導多能干細胞的目的片段測序圖。由圖4可知，原始誘導多能干細胞在如箭頭所指的第3位和倒數第2為堿基T，而單修復的地貧誘導多能干細胞26的測序圖上在該位置可見雙峰，為C和T的疊加，雙修復的地貧誘導多能干細胞9的測序圖上在該位置為單一的堿基C。其中，雙峰代表一個等位基因修復，單峰的C堿基代表雙修復。圖4的結果表明，雙修復的方法可行。3、地貧多能干細胞多能性鑒定將上述獲得并繼續培養的地貧誘導多能干細胞，經過造血分化后，利用流式細胞儀免疫熒光法檢測其分化能力。結果見圖5，其中，CD34和CD43均為造血干細胞的表面標記分子。造血干細胞的標志是流式細胞儀檢測為⑶34陽性。。圖5顯示了地貧誘導多能干細胞分化前后的免疫熒光流式細胞儀檢測圖。如圖5所示，上圖為未分化的地貧誘導多能干細胞的免疫熒光流式細胞儀檢測圖，作為對照；下圖為地貧誘導多能干細胞經造血分化后的細胞的免疫熒光流式細胞儀檢測圖，其中橫坐標為FITC，表征CD43表達量的高低，將10作為陽性的閾值；縱坐標為PE-cy5表征CD34表達量的高低，將10作為陽性的閾值。可以將圖中的所有待測細胞分為四個區域。由圖5可知，分化后左上區域細胞(為造血干細胞)明顯增加。表明對原始誘導多能干細胞進行基因修復后獲得的地貧誘導多能干細胞具有多能性，能夠分化為造血干細胞，分化后細胞CD34陽性率約10% (下圖左上區域，未分化的干細胞此區域0% )。然后，利用定量PCR對地貧多能干細胞進行檢測，結果表明獲得的地貧多能干細胞表達0ct4、Sox2、Nanog等多能性因子。此外，利用傳統的造血分化技術，在適于造血分化的條件下，即將上述地貧誘導多能干細胞形成的擬胚體與0P9細胞共培養，添加培養基(成分MEM alpha基礎培養基+10% FBS+MTG+Vc)培養8天，結果約有10%的地貧誘導多能干細胞分化為⑶34陽性的造血干細胞。需要說明的是，誘導多能干細胞要用于藥物篩選及臨床移植，必須分化為特定類型的細胞。而本實驗證明了，根據本發明的方法得到的修復好的地貧誘導多能干細胞，可以在體外分化為造血干細胞。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。盡管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本 發明的范圍由權利要求及其等同物限定。
權利要求
1.ー種地貧誘導多能干細胞，其特征在于，所述地貧誘導多能干細胞衍生自地中海貧血癥患者的體細胞，并且所述誘導多能干細胞的基因組中包含正常β珠蛋白基因， 任選地，所述地中海貧血癥患者體細胞基因組中的β珠蛋白基因與所述正常β珠蛋白基因相比，存在選自下列的至少ー種突變CD41/42(-4bp)、IVS-11-654 (C — T)、CD71/72 (+A)、-28 (A — G)、CD17 (A — T)、IVSl-I (G — T)、IVS1-5 (G — C)、CD8/9 (+G)、CD15 (G — A)、CD26 (G — A)和 CD30 (G — C)， 任選地，所述地貧誘導多能干細胞的基因組中的β珠蛋白基因均為正常β珠蛋白基因， 任選地,所述體細胞為選自所述地中海貧血癥患者的尿液細胞、血液細胞、皮膚細胞、羊水細胞、角質細胞和臍血細胞的至少ー種，優選為選自羊水細胞和尿液細胞的至少ー種，任選地，所述地貧誘導多能干細胞不含有外源基因。
2.一種制備地貧誘導多能干細胞的方法，其特征在于，包括 將多能干細胞誘導因子引入地中海貧血癥患者的體細胞中，其中，所述地中海貧血癥患者體細胞基因組中的β珠蛋白基因與正常β珠蛋白基因相比，存在選自下列的至少ー種突變CD41/42(-4bp)、IVS-11-654 (C — T)、CD71/72(+A)、-28 (A — G)、CD17(A — T)、IVSl-I (G — T)、IVS1-5 (G — C)、CD8/9 (+G)、CD15 (G — A)、CD26 (G — A)和 CD30 (G — C)；將引入所述多能干細胞誘導因子的體細胞在適于重編程的培養基中進行培養，以便獲得原始誘導多能干細胞；以及 向所述原始誘導多能干細胞中引入編碼正常β珠蛋白的核酸，以便獲得地貧誘導多能干細胞，所述地貧誘導多能干細胞的基因組中包含正常β珠蛋白基因， 任選地,所述體細胞為選自所述地中海貧血癥患者的尿液細胞、血液細胞、皮膚細胞、羊水細胞、角質細胞和臍血細胞的至少ー種，優選為選自羊水細胞和尿液細胞的至少ー種，任選地，所述多能干細胞誘導因子是以cDNA或miRNA的形式引入的， 任選地，利用選自外隨體載體、病毒載體和質粒載體的至少ー種作為載體引入所述多能干細胞誘導因子，優選采用外隨體載體， 任選地，所述多能干細胞誘導因子為選自Oct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf5、l-Myc、n-Myc、Esrrb> LRH> Nanog、Lin28 和 miR-302-367 的至少一種，優選米用 0ct4、Sox2、Nanog、Lin28和miR-302-367的組合， 任選地，采用選自核轉染、病毒感染、脂質體轉染、電穿孔和基因槍的至少ー種，將所述多能干細胞誘導因子引入所述地中海貧血癥病人的體細胞中，優選采用核轉染方法， 任選地，向所述原始誘導多能干細胞中引入編碼正常β珠蛋白的核酸是通過第一載體進行的， 其中， 所述第一載體包括 第一核酸分子，所述第一核酸分子包含編碼正常β珠蛋白的核酸序列； 第二核酸分子，所述第二核酸分子位于所述第一核酸分子的3’側，并且所述第二核酸分子包含編碼篩選基因的核酸序列； 兩個IoxP位點，所述兩個Ioxp位點分別位于所述第二核酸分子的5’側和3’側，其中位于所述第二核酸分子5’側的IoxP位點位于所述第二核酸分子和所述第一核酸分子之間， 任選地，進ー步包括第三核酸分子，所述第三核酸分子位于所述第二核酸分子的3’側，并且所述第三核酸分子為同源重組所需要的β珠蛋白基因下游的序列， 任選地，所述第一核酸分子的序列如SEQ ID NO:I所示， 任選地，所述第二核酸分子進ー步包括啟動子， 任選地,所述啟動子為真核細胞啟動子,所述真核細胞啟動子優選為選自PGK啟動子、CMV啟動子啟動子、CAG啟動子和EFl α啟動子的至少ー種， 任選地，所述篩選基因為選自藥物抗性基因和編碼發光蛋白的基因的至少ー種，所述發光蛋白優選為選自GFP和EGFP的至少ー種，所述藥物抗性基因優選為選自新霉素磷酸轉移酶、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和殺稻瘟菌素抗性基因的至少ー種， 任選地，所述第三核酸分子為β珠蛋白基因的3’下游區域，任選3’UTR區域以及下游區域， 任選地，進ー步包括向所述原始誘導多能干細胞中引入編碼鋅指核酸酶的核酸分子，其中所述鋅指核酸酶特異性識別所述β珠蛋白基因的3’下游區域，任選3’ UTR區域以及下游區域， 任選地，所述編碼鋅指核酸酶的核酸分子有兩個，分別具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO:4的所示的序列， 任選地，所述第一載體包括兩個載體，所述兩個載體中分別包含不同的篩選基因， 任選地，所述第一載體包括兩個載體，所述兩個載體中分別包含新霉素磷酸轉移酶和嘌呤霉素抗性基因。
3.—種載體,其特征在于,所述載體包括 第一核酸分子，所述第一核酸分子包含編碼正常β珠蛋白的核酸序列； 第二核酸分子，所述第二核酸分子位于所述第一核酸分子的5’側，并且所述第二核酸分子包含編碼篩選基因的核酸序列； 兩個IoxP位點，所述兩個Ioxp位點分別位于所述第二核酸分子的5’側和3’側，其中位于所述第二核酸分子5’側的IoxP位點位于所述第二核酸分子和所述第一核酸分子之間， 任選地，所述載體進ー步包括第三核酸分子，所述第三核酸分子位于所述第二核酸分子的3’側，并且所述第三核酸分子為同源重組所需要的β珠蛋白基因下游的序列， 任選地，所述第一核酸分子的序列如SEQ ID NO:I所示， 任選地，所述第二核酸分子進ー步包括啟動子， 任選地,所述啟動子為真核細胞啟動子,所述真核細胞啟動子優選為選自PGK啟動子、CMV啟動子啟動子、CAG啟動子和EFl α啟動子的至少ー種， 任選地，所述篩選基因為選自藥物抗性基因和編碼發光蛋白的基因的至少ー種，所述發光蛋白優選為選自GFP和EGFP的至少ー種，所述藥物抗性基因優選為選自新霉素磷酸轉移酶、嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和殺稻瘟菌素抗性基因的至少ー種， 任選地，所述第三核酸分子為β珠蛋白基因的3’下游區域，任選3’UTR區域以及下游區域， 任選地，所述載體包括兩個載體，所述兩個載體中分別包含不同的篩選基因，任選地，所述載體包括兩個載體，所述兩個載體中分別包含新霉素磷酸轉移酶和嘌呤霉素抗性基因。
4.ー組載體，其特征在于，包含 第一載體，所述第一載體為權利要求3所述的載體；以及 第二載體，所述第二載體攜帯編碼鋅指核酸酶的核酸分子，其中所述鋅指核酸酶特異性識別所述β珠蛋白基因的3’下游區域，包括任選3’ UTR區域以及下游區域， 任選地，所述編碼鋅指核酸酶的核酸分子有兩個，分別具有SEQ ID NO :3和SEQ ID NO:4的所示的序列。
5.權利要求3所述的載體，或權利要求4所述的ー組載體在制備地貧誘導多能干細胞中的用途。
6.一種制備造血干細胞的方法，其特征在于，包括 在適于造血分化的條件下，培養權利要求I所述的地貧誘導多能干細胞，以便獲得造血干細胞。
7.—種造血干細胞，其是通過權利要求6所述的方法得到的。
8.權利要求I所述的地貧誘導多能干細胞在制備藥物以及藥物庫篩選中的用途，所述藥物用于治療地中海貧血癥。
9.一種治療地中海貧血癥的方法，其特征在于，包括 分離患者的體細胞； 根據權利要求2所述的方法，基于所述體細胞，制備地貧誘導多能干細胞；以及 將所述地貧誘導多能干細胞或其衍生物引入所述患者體內， 任選地，所述地貧誘導多能干細胞衍生物是造血干細胞，其是在得到所述地貧誘導多能干細胞之后，在適于造血分化的條件下，培養所述地貧誘導多能干細胞而獲得的。
10.ー種試劑盒，其特征在于，包括權利要求3所述的載體，或權利要求4所述的ー組載體。
全文摘要
本發明涉及地貧誘導多能干細胞及其制備方法和用途。其中，地貧誘導多能干細胞衍生自地中海貧血癥患者的體細胞，并且該誘導多能干細胞的基因組中包含正常β珠蛋白基因。本發明的地貧誘導多能干細胞在適當的條件下能夠分化為造血干細胞，并且該造血干細胞能夠表達正常β珠蛋白基因。
文檔編號C12N5/074GK102628029SQ20121009000
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月29日 優先權日2012年3月29日
發明者廖寶劍, 潘光錦, 裴端卿, 馬寧 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院