專利名稱：一種大黃歐文氏菌及其在制備低乳糖牛奶中的應用的制作方法
一種大黃歐文氏菌及其在制備低乳糖牛奶中的應用
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域。更具體地，本發明涉及一種大黃歐文氏菌(Erwiniarhapontici)E602株,還涉及所述大黃歐文氏菌E602株的用途。
背景技術：
乳糖是一種二糖，由一分子葡萄糖和一分子半乳糖縮合而成。它在牛奶中的含量約為4. 5-5.0%。牛奶中的乳糖會導致人體發生乳糖不耐癥。全球有約75%成年人有乳糖不耐癥，在亞洲約有60-90%患病率，非洲國家高達90-100%，在中國成年人中的發病率達90%。由于國內這么多的人飲用牛乳會導致乳糖不耐癥，該病癥已妨礙了我國乳品工業的
進一步發展。β_半乳糖苷酶(β -galactosidase)又稱β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β -D-galactoside galacto hydrolase,EC 3· 2· I. 23),商品名為乳糖酶(Lactase),是一種重要的糖苷水解酶，它能將牛乳中的乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，因此，利用這種酶可以有效地降低牛乳中的乳糖含量，從而解決牛乳飲用人群的乳糖不耐癥問題。β_半乳糖苷酶的來源較為廣泛，其中包括來源于大多數植物、動物和微生物等。在工業上，β_半乳糖苷酶往往來源于微生物。到目前為止，研究較多的產乳糖酶的微生物主要有大腸桿菌(Escherichia coli)、乳鏈球菌(Streptococcus lactis)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)等。而在工業中應用較多的β _半乳糖苷酶主要來源于酵母和黑曲霉。近年來，隨著人們生活水平的提高，乳品工業對乳糖酶的需求越來越多，乳糖酶的研究開發相應增加。目前，工業上使用的β_半乳糖苷酶主要是在中溫條件下具有較高活性的中溫酶，采用中溫半乳糖苷酶對牛乳中乳糖進行水解時，水解反應的溫度是約37°C，因此，容易造成在牛乳水解過程中的微生物污染問題。近年來，乳糖酶的一個研究熱點是在較低溫度下具有較高活性的低溫乳糖酶(Cold-adaptive β-Galactosidase),這類酶適合于在較低溫度下(例如<20°C)進行牛乳乳糖的水解，較低溫度能夠防止微生物污染，且低溫乳糖酶在牛乳巴氏殺菌溫度下能夠完全失活，因而可以保證牛乳中乳糖水解度基本一致。CN200710190755 公開了一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici) NX-5 株,還涉及利用該大黃歐文氏菌NX-5株生產蔗糖異構酶，再利用這種酶制備異麥芽酮糖。采用該菌株使蔗糖轉化率高達99. 5%(W/W)，異麥芽酮糖轉化率達90%，轉化液中異麥芽酮糖濃度達500g/L，無水解副反應，轉化液中幾乎不含葡萄糖和果糖，隨著反應進行也不會使產物異麥芽酮糖轉化為其他成分，對工業化生產異麥芽酮糖十分有益。有關利用大黃歐文氏菌制備半乳糖苷酶及其應用尚未見報道。因此，本發明人在總結現有技術的基礎上，通過大量實驗研究與分析，終于完成了本發明。發明內 容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici) E602株。本發明的另一個目的是提供所述大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici) E602株的用途。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici) E602株,該菌株已于2011年3月17日在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號為CGMCC No. 4678。本發明還涉及所述的大黃歐文氏菌E602株在生產低乳糖牛奶中的用途。具體地，本發明涉及利用所述的大黃歐文氏菌E602株生產低乳糖牛奶的方法。該方法的步驟如下A、制備一級種子將大黃歐文氏菌E602株甘油凍存管中菌液劃線至含IPTG和X-Gal的營養瓊脂培養基，在培養箱中在溫度24-28°C下培養20-28h ;從該營養瓊脂培養基表面挑取藍色有金屬光澤的大黃歐文氏菌E602單菌落，轉移至4-6mL LB液體培養基中，在溫度24_28°C與轉速180-220r/min的條件下培養10_14h，獲得一級種子；B、制備二級種子按照以TSA液體培養基體積計1-4%接種量，將步驟A)得到的一級種子接種至45-55mL TSA液體培養基中，在溫度24_28°C與轉速180_220r/min的條件下培養12_18h，獲得二級種子；C、發酵培養按照以TSA液體培養基體積計1-4%接種量，將步驟B)得到的二級種子接種至4-6L TSA液體培養基中，在溫度24-30°C與轉速180_220r/min與不通氣的條件下發酵12-20h，然后進行離心分離，收集含β-半乳糖苷酶的菌體；D、分離β-半乳糖苷酶收集在步驟C)得到的含β -半乳糖苷酶的菌體，在重懸于磷酸鹽緩沖液后，將得到的重懸液于冰浴中進行超聲波破碎，然后進行離心分離，收獲上清液。向得到的上清液中添加硫酸銨粉末，在其飽和度達到20-60%的硫酸銨溶液中進行硫酸銨鹽析，再進行離心分離，其沉淀物用磷酸鹽緩沖液重懸，接著透析除去硫酸銨，再進行離心分離，其上清液再進行陰離子交換色譜層析與凝膠色譜層析分離，于是得到純β_半乳糖苷酶；Ε、制備低乳糖牛奶往新鮮牛乳中加入在步驟D)得到的β -半乳糖苷酶，使牛乳中β -半乳糖苷酶的濃度達到2. 0-30. OU/mL，然后在溫度0-40°C水浴中進行水解4-20h，得到一種低乳糖牛奶。根據本發明的一種優選實施方式，所述的超聲波破碎是在超聲波功率200-500W的條件下進行超聲處理500-700次。根據本發明的另一種優選實施方式，在超聲波破碎后，所述的離心分離是在18000-22000r/min與溫度0-6°C的條件下進行離心20_40min。
根據本發明的另一種優選實施方式，在硫酸銨鹽析后，所述的離心分離是在8000-12000r/min與溫度0-6°C的條件下進行離心8_12min。
根據本發明的另一種優選實施方式，在如下的條件下進行離子交換色譜層析分離DEAE FF陰離子交換柱，流動相A為20mmol/L Tri-HCl溶液，ρΗ7· 0-7. 5 ;流動相B為20mmol/L Tri-HCl 和 2mol/L NaCl 的溶液，pH7. 0-7. 5，上樣流速為 2_5mL/min，洗脫流速為4-8mL/min，在波長280nm處測定紫外光吸收度。根據本發明的另一種優選實施方式，在如下的條件下進行凝膠色譜層析分離Sephacry S-100凝膠柱，流動相為50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液和0-100. Ommol/LNaCl的溶液，pH 7. 0-7. 5，上樣流速為O. 4-2. OmL/min,洗脫流速為O. 4-2. OmL/min,在波長280nm處測定紫外光吸收度。在步驟D)得到的β -半乳糖苷酶在ρΗ4. 0-9. O范圍內具有良好的酶活性。β -半乳糖苷酶酶活測定方法如下將5mL 50mg/100mL鄰-硝基苯-β _D_半乳糖吡喃糖苷(ONPG)底物溶液與O. 9mL磷酸緩沖鹽溶液混合后，往其中加入O. ImL根據權利要求2所述方法制備的酶液，在水浴內于溫度40°C的條件下反應lOmin，然后往其中加入2mL75g/L Na2CO3溶液終止酶反應，再在溫度25 °C的水浴中放置15min，接著在波長420nm處測定吸光度，由該吸光度值根據下式計算出β-半乳糖苷酶酶活β -半乳糖苷酶酶活(U/mL) = (EXVI)/(4. 45X tXV2)式中E :反應混合物在420nm處的吸光度，VI 反應混合物的總體積，mL，V2 :加入該體系中的酶液體積，mL，t:反應時間，min,4. 45-在該試驗條件下I μ mol/mL鄰-硝基苯(ONP)的吸光度。本發明涉及采用上述方法制備得到的低乳糖牛奶，其特征在于與牛奶相比，所述低乳糖牛奶中的乳糖含量低60%以上。下面將更詳細地描述本發明。本發明涉及一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)E602株,該菌株已于2011年3月17日在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號為CGMCC No. 4678。大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)E602菌株具有下述性質I、菌落形態學特征在含IPTG和X-Gal的營養瓊脂培養基上，在溫度26°C下培養24h出現藍色菌落，這種菌落呈圓形，表面光滑，中央突起，不透明，適當延長培養，菌落會逐漸增大，而細胞尺寸和形狀變化卻很小。2、生理與生化特征培養溫度25_30°C，最適溫度為26°C。在ρΗ7· 3-7. 5范圍內生長。3、營養特征在大黃歐文氏菌Ε602株的培養基中不需要額外添加生長因子，使用有機氮作為氮源。將該菌株E602株接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養基中進行無氧發酵，離心得到含半乳糖苷酶的細胞，通過超聲波破碎、硫酸銨鹽析、離子交換色譜層析、凝膠色譜層析等方法得到純β_半乳糖苷酶，進而利用該純β_半乳糖苷酶進行低乳糖牛奶的生產。本發明還涉及所述的大黃歐文氏菌Ε602株在生產低乳糖牛奶中的用途。具體地，本發明涉及利用所述的大黃歐文氏菌Ε602株生產低乳糖牛奶的方法。該方法的步驟如下 Α、制備一級種子將大黃歐文氏菌Ε602株甘油凍存管中菌液劃線至含IPTG和X-Gal的營養瓊脂培養基，在培養箱中于溫度24-28°C下培養20-28h ;從營養瓊脂培養基表面挑取藍色有金屬光澤的大黃歐文氏菌E602單菌落，轉移至4-6mLLB液體培養基中，在溫度24-28°C與轉速180-220r/min的條件下培養10_14h，獲得一級種子；含IPTG和X-Gal的營養瓊脂培養基制備方法如下按照20g/L蛋白胨、3g/L酵母提取物、2. 5g/L磷酸氫二鉀,5g/L氯化鈉、15g/L瓊脂稱取這些組分，再用水溶解，然后用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液將其溶液的pH調節至7. 3-7. 5,再在溫度121°C下滅菌20min,接著添加X-Gal (5-漠-4-氣-3- Π引噪-β -D-半乳糖苷)，使其終濃度達到40 μ g/mL,然后添加IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)，使其終濃度達到20 μ g/mL，然后澆鑄成含IPTG和X-Gal的營養瓊脂培養基。LB (Luria-Bertani)液體培養基組成如下10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化鈉，其余組分為水。TSA液體培養基組成如下15g/L胰蛋白胨、5g/L大豆蛋白胨、2. 5g/L磷酸氫二鉀、2. 5g/L乳糖、5g/L氯化鈉、3g/L酵母浸膏、其余組分為水，pH 7. 3-7. 5。優選地,大黃歐文氏菌E602株在培養箱中在溫度26°C下培養26h。挑選藍色有金屬光澤的大黃歐文氏菌E602株單菌落接種至5mL LB液體培養基中，在溫度26°C與轉速200r/min的條件下培養12h。B、制備二級種子按照以TSA液體培養基體積計1-4%接種量，將步驟A)得到的一級種子接種至45-55mL TSA液體培養基中，在溫度24_28°C與轉速180_220r/min的條件下培養12_18h，獲
得二級種子。優選地，步驟A)得到的一級種子接種量是以TSA液體培養基體積計2-3%。步驟A)得到的一級種子在50mL TSA液體培養基中在溫度26°C與轉速200r/min的條件下培養16h。C、發酵培養按照以TSA液體培養基體積計1-4%接種量，將步驟B)得到的二級種子接種至4-6L TSA液體培養基中，在溫度24-30°C與轉速180_220r/min與不通氣的條件下發酵12-20h，然后進行離心分離，收集含β -半乳糖苷酶的菌體。優選地，步驟B)得到的二級種子接種量是以TSA液體培養基體積計2-3%。步驟B)得到的二級種子在5L TSA液體培養基中在溫度26°C與轉速200r/min與不通氣的條件下培養16h。
根據本發明，所述的不通氣應該理解是在培養過程中將培養容器封閉，不讓培養容器內的環境與外部環境交流的一種封閉式不通氣培養。所述的離心分離是在3000-5000r/min與溫度15-30 °C的條件下進行離心10_15minoD、分離半乳糖苷酶收集在步驟C)得到的含β -半乳糖苷酶的菌體，在重懸于磷酸鹽緩沖液后，將得到的重懸液于冰浴中進行超聲波破碎，然后進行離心分離，向得到的上清液中添加硫酸銨粉末，在硫酸銨飽和度達到20-60 %的溶液中進行硫酸銨鹽析，再進行離心分離，其沉淀物用磷酸鹽緩沖液重懸，接著透析除去硫酸銨，再進行離心分離，收獲上清液；所得上清液再進行陰離子交換色譜層析與凝膠色譜層析分離，于是得到純β-半乳糖苷酶； 在步驟C)得到的菌體在重懸于磷酸鹽緩沖液后，得到的重懸液于冰浴中進行超聲破碎。在超聲波功率200-500W的條件下進行超聲3s，暫停8s，按照這種方式連續超聲500-700 次，共 30min。超聲波破碎是使用超聲波破碎儀通過換能器將電能轉換為超聲波,這種形式的能量在通過液體介質時使其介質變成一個個小氣泡，這些小氣泡會迅速炸裂，從而使細胞破碎。超聲波破碎使用的細胞超聲波破碎儀是目前市場上銷售的產品，例如上海靖永實業有限公司銷售的產品。在超聲破碎后獲得的菌液然后進行離心分離，移取其上清液。這種離心分離是在18000-22000r/min與溫度0-6°C的條件下進行離心20_40min。這種離心分離使用的離心機是目前市場上銷售的產品，例如德國SIGMA公司、長沙英泰儀器有限公司生產的產品。將所述的上清液置于冰浴中，在磁力攪拌器的攪拌下，加入硫酸銨粉末，在硫酸銨飽和度達到20-60%的溶液中進行硫酸銨鹽析。所述的硫酸銨鹽析主要是使蛋白質和酶鹽析出來。硫酸銨的優點是溫度系數小，溶解度大，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來，還不易引起蛋白質變性。鹽析時，硫酸銨溶液的pH通常是4. 5-5. 5。在硫酸銨鹽析后進行離心分離所得到的沉淀物是蛋白質。蛋白質在通過鹽析沉淀分離后，需要將其中的鹽除去，常用的方法是透析。得到的沉淀物使用PH7. 4磷酸鹽緩沖液溶解，裝入透析袋進行充分透析，在透析過程中需要更換磷酸鹽緩沖液2-5次，使用萘氏試劑檢測透析外液無黃色，即無NH4+為止，已無硫酸銨鹽。在硫酸銨鹽析后，所述的離心分離是在8000_12000r/min與溫度0_6°C的條件下進行離心8-12min。這種離心分離得到的上清液再進行陰離子交換色譜層析與凝膠色譜層析分離，可以得到純半乳糖苷酶。離子交換色譜層析分離在如下的條件下進行DEAE FF陰離子交換柱，流動相A為20mmol/L Tri-HCl 溶液，ρΗ7· 0-7. 5 ;流動相 B 為 20mmol/LTri-HCl 和 2mol/L NaCl 的溶液，PH7. 0-7. 5，上樣流速為2-5mL/min，洗脫流速為4_8mL/min，在波長280nm處測定紫外光吸收度。根據測定的紫外光吸收度值曲線，收集與吸收度最大值對應的洗脫部分。重復這個收集步驟，將這些洗脫部分合并，然后再進行凝膠色譜層析分離。
凝膠色譜層析分離在如下的條件下進行Sephacry S-100凝膠柱，流動相為50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液和0-100. Ommol/L NaCl的溶液，pH 7. 0-7. 5，上樣流速為O. 4-2. OmL/min，洗脫流速為O. 4-2. OmL/min，在波長280nm處測定紫外光吸收度。根據測定的紫外光吸收度值曲線，收集與吸收度最大值對應的洗脫部分。重復這個收集步驟，將這些洗脫部分合并，得到純的β -半乳糖苷酶。接著測定β -半乳糖苷酶酶活，其測定方法如下將5mL 50mg/100mL鄰-硝基苯-β -D-半乳糖吡喃糖苷(ONPG)底物溶液與O. 9mL磷酸鹽緩沖溶液混合后，往其中加入
O.ImL本發明方法制備的β-半乳糖苷酶液，在水浴內在溫度40°C的條件下反應lOmin，然后往其中加入2mL 75g/L似20)3溶液終止酶反應，再在溫度25°C的水浴中放置15min，接著在波長420nm處測定吸光度，由該吸光度值根據下式計算出β _半乳糖苷酶酶活β -半乳糖苷酶酶活(U/mL) = (EXVI)/(4. 45X tXV2)式中E :反應混合物在420nm處的吸光度，VI 反應混合物的總體積，mL，V2 :加入該體系中的酶液體積，mL，t:反應時間，min,4. 45-在該試驗條件下I μ mol/mL鄰-硝基苯(ONP)的吸光度。大黃歐文氏菌E602菌株所產的β -半乳糖苷酶與其他來源的β -半乳糖苷酶在性質方面進行了比較，其結果列于表I中。表I :大黃歐文氏菌Ε602所產的β -半乳糖苷酶與其他來源的β -半乳糖苷酶性質比較
權利要求
1.一種大黃歐文氏菌(Erwinia rhapontici)E602株,該菌株已于2011年3月17日在北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號為CGMCC No. 4678。
2.一種利用根據權利要求I所述的大黃歐文氏菌E602生產低乳糖牛奶的方法，其特征在于該方法的步驟如下 A、制備一級種子 取大黃歐文氏菌E602菌株菌液劃線至含IPTG和X-Gal的營養瓊脂培養基，在培養箱中于溫度24-28°C下培養20-28h ;從該營養瓊脂培養基表面挑取藍色有金屬光澤的大黃歐文氏菌E602株單菌落，轉移至4-6mL LB液體培養基中，在溫度24_28°C與轉速180_220r/min的條件下培養10-14h,獲得一級種子； B、制備二級種子 按照以TSA液體培養基體積計1-4%接種量，將步驟A)得到的一級種子接種至45-55mLTSA液體培養基中，在溫度24-28°C與轉速180-220r/min的條件下培養12_18h，獲得二級種子； C、發酵培養 按照以TSA液體培養基體積計1-4%接種量，將步驟B)得到的二級種子接種至4-6LTSA液體培養基中，在溫度24-30°C、轉速180-220r/min與不通氣的條件下發酵12_20h，然后進行離心分離，收集含β-半乳糖苷酶的菌體； D、分離β-半乳糖苷酶 收集在步驟C)得到的含β_半乳糖苷酶的菌體，在重懸于磷酸鹽緩沖液后，將得到的重懸液于冰浴中進行超聲波破碎，然后進行離心分離，收獲上清液，向所得上清液中添加硫酸銨粉末，在硫酸銨飽和度達到20-60%的溶液中進行硫酸銨鹽析，再進行離心分離，其沉淀物用磷酸鹽緩沖液重懸，接著透析除去硫酸銨，再進行離心分離，收獲上清液；所得上清液再進行陰離子交換色譜層析與凝膠色譜層析分離，于是得到純β-半乳糖苷酶； Ε、制備低乳糖牛奶 向新鮮牛乳中加入在步驟D)得到的β_半乳糖苷酶，使牛乳中β_半乳糖苷酶的濃度達到2. 0-30. OU/mL，然后在溫度0_40°C水浴中進行水解4_20h，得到一種低乳糖牛奶。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的超聲波破碎是在超聲波功率200-500w的條件下進行超聲處理500-700次。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在超聲波破碎后，所述的離心分離是在18000-22000r/min與溫度0-6°C的條件下進行離心20_40min。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在硫酸銨鹽析后，所述的離心分離是在8000-12000r/min與溫度0-6°C的條件下進行離心8_12min。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在如下的條件下進行離子交換色譜層析分離DEAE FF陰離子交換柱，流動相A為20mmol/L Tri-HCl溶液，ρΗ7· 0-7. 5 ;流動相B為20mmol/L Tri-HCl 和 2mol/L NaCl 的溶液，pH7. 0-7. 5，上樣流速為 2_5mL/min，洗脫流速為4-8mL/min，在波長280nm處測定紫外光吸收度。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在如下的條件下進行凝膠色譜層析分離Sephacry S-100凝膠柱，流動相為50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液和0-100. OmmoI/L NaCl的溶液，pH 7. 0-7. 5，上樣流速為O. 4-2. OmL/min,洗脫流速為O. 4-2. OmL/min,在波長280nm處測定紫外光吸收度。
8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在步驟D)得到的β-半乳糖苷酶在ΡΗ4. 0-9. O范圍內具有良好的酶活性。
9.根據權利要求2所述的方法，其特征在于β-半乳糖苷酶酶活測定方法如下將5mL50mg/100mL鄰-硝基苯-β -D-半乳糖吡喃糖苷底物溶液與O. 9mL磷酸鹽緩沖溶液混合后，往其中加入O. ImL根據權利要求2所述方法制備的β -半乳糖苷酶液，在水浴內在溫度40°C的條件下反應lOmin，然后往其中加入2mL 75g/L Na2CO3溶液終止酶反應，再在溫度25°C的水浴中放置15min，接著在波長420nm處測定吸光度，由該吸光度值根據下式計算出β-半乳糖苷酶酶活 β-半乳糖苷酶酶活(U/mL) = (Ε X VI)/(4. 45 Xt XV2) 式中 E :反應混合物在420nm處的吸光度， Vl :反應混合物的總體積，mL， V2 :加入該體系中的酶液體積，mL， t :反應時間，min, 4.45-在該試驗條件下I μ mol/mL鄰-硝基苯的吸光度。
10.根據權利要求2-9中任一項權利要求所述方法制備得到的低乳糖牛奶，其特征在于與牛奶相比，所述低乳糖牛奶中的乳糖含量低60 %以上。
全文摘要
本發明涉及一種大黃歐文氏菌E602株，還涉及所述大黃歐文氏菌E602株在生產低乳糖牛奶中的用途。生產低乳糖牛奶的方法包括一級種子、二級種子制備、發酵培養、分離純化β-半乳糖苷酶，以及制備低乳糖牛奶等步驟。該β-半乳糖苷酶最適宜的反應溫度為40℃，最適宜的反應pH為7.0，在低溫下存在良好的酶活性。采用不同終濃度的β-半乳糖苷酶在溫度20℃下水解牛奶12h，使牛奶中的乳糖水解率達到60％以上，達到低乳糖牛奶的生產要求。
文檔編號C12N1/20GK102634468SQ20121010101
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月9日 優先權日2012年4月9日
發明者夏雨 申請人:江南大學