專利名稱：一種提高桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
桑黃(Phellinusigniarius)為擔子菌亞門 Basidiomycotina、層菌綱Hymenomycetes>多孔菌目Polyporales、鎊革孔菌科Hymenochaetacae、針層孔菌屬(Phellinus)真菌，是一種珍貴的大型藥用真菌。傳統(tǒng)中醫(yī)認為桑黃性甘、味苦，用于治療血崩、帶下、閉經(jīng)、脾虛泄瀉等。現(xiàn)代藥理學研究表明，桑黃具有抗腫瘤、增強免疫力、抗肝纖維化等功效。據(jù)報道，桑黃是目前抗腫瘤能力最高的藥用真菌。早在1968年，日本學者 Tetsuro Ikekawa等用桑黃的水提取物進行細胞試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對小鼠S180的抑制率為96. 7%，而對正常細胞無毒，同時研究發(fā)現(xiàn)桑黃主要活性成分為多糖組分、三萜類化合物和黃酮類物質(zhì)，其中所含三萜類涵蓋了不下百余種的化合物成分，其中以四環(huán)三萜類化合物為主。近來研究表明桑黃中的三萜類物質(zhì)具有迅速提高免疫力的作用，表現(xiàn)在促進淋巴細胞增殖，提高巨噬細胞、NK細胞、T細胞的吞噬能力和殺傷力，并直接和間接毒殺腫瘤細胞，同時能夠激活化療藥物難以殺死的休眠期腫瘤細胞，進行單獨和聯(lián)合毒殺。由于桑黃三萜類化合物對休眠期細胞的獨特作用，以及對惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的有效遏止，彌補了傳統(tǒng)腫瘤治療(手術(shù)、放療、化療)的不足，成為腫瘤免疫治療中的重要成分。但是桑黃的總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量較低一直是限制其應(yīng)用的影響因素，由于受生理狀態(tài)的特殊性、復(fù)雜性以及外部環(huán)境的制約，特別是生成可應(yīng)用的子實體需要多年，加之近幾年人們對野生桑黃的大量采集，天然的桑黃資源已經(jīng)非常稀少，同時桑黃的人工栽培也極其困難，培養(yǎng)條件苛刻，且生長周期長達3 4年。因此，僅是通過利用采集或人工栽培子實體從中提取總?cè)氼惢衔锏纳a(chǎn)方式很難滿足日益膨脹的市場需要。液體發(fā)酵法生產(chǎn)桑黃的有效成分有生產(chǎn)周期短、節(jié)省勞動力、受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點，是一種相對低成本、高效的生產(chǎn)方法，但其中總?cè)祁惓煞值姆置诋a(chǎn)量仍然較低。目前，國內(nèi)外學者對桑黃總?cè)祁惢衔锏陌l(fā)酵研究相對較少，主要集中在培養(yǎng)基組成、溶氧、PH值及產(chǎn)物提取分離等工藝層面上，對桑黃總?cè)祁惢衔锏陌l(fā)酵水平提高有限，還遠不能滿足現(xiàn)代工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的需要。近年來，在植物細胞壁中發(fā)現(xiàn)一類被稱為擴張蛋白的蛋白新家族。自McQueen-Mason等首先從黃瓜下胚軸伸長區(qū)分離純化出擴張蛋白以來，相繼從燕麥胚芽鞘細胞壁、栝樓根尖細胞壁、番茄、煙草、擬南芥、水稻、棉纖維、玉米、大豆等細胞壁中也發(fā)現(xiàn)了擴張蛋白的存在，被認為其普遍存在于各種雙子葉和單子葉植物的細胞壁中，促進其細胞生理生長，影響營養(yǎng)生長、形態(tài)發(fā)生、授粉受精、果實軟化等。通過重組細胞壁實驗研究證實了該蛋白與以前發(fā)現(xiàn)的所有細胞壁蛋白不同，它具有誘導(dǎo)熱鈍化的離體細胞壁恢復(fù)伸展的功能，被推測能夠打斷細胞壁多聚物之間的氫鍵進而誘導(dǎo)酸依賴的細胞壁延展和壓力松弛等生理活動，在植物生長過程中可能是生理調(diào)控和細胞壁松弛延伸的主要調(diào)控因子。但是，關(guān)于擴張蛋白的作用機制目前仍多是猜測和推斷，國內(nèi)外均未有明確的驗證定論和機制闡明。因此，對擴張蛋白的各種應(yīng)用的研究報道很少，將擴張蛋白應(yīng)用于桑黃的液體發(fā)酵生產(chǎn)，用以提高桑黃三萜類化合物等次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量的研究國內(nèi)外均尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用擴張蛋白提高桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量的液體發(fā)酵方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下 —種提高桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，包括如下步驟(I)將桑黃菌種接種到平板培養(yǎng)基上，進行活化培養(yǎng)，然后取菌塊接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度22 27°C，搖床培養(yǎng)2 3天，搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min，得初發(fā)酵液；(2)向步驟(I)制得的初發(fā)酵液中加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的濃度為O. 2
I.5mg/ml，然后在溫度22 27°C、搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)3 5天，分離，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液；(3)從步驟⑵制得的發(fā)酵液中提取桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮瑥牟襟E(2)制得的桑黃菌絲體中提取桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铮旌仙｜S胞外總?cè)祁惢衔锖桶麅?nèi)總?cè)祁惢衔铮吹蒙｜S總?cè)祁惢衔铩８鶕?jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的平板培養(yǎng)基為PDA平板培養(yǎng)基；每升組分如下馬鈴薯200g、葡萄糖20g,瓊脂15g,蒸懼水定容至1000mL。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的活化培養(yǎng)條件為溫度22 27°C，時間4 5天。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基，PD液體發(fā)酵培養(yǎng)基每升組分如下馬鈴薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至1000mL。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為0. 3 I. 0mg/ml ;進一步優(yōu)選0. 35 0. 8mg/ml。最優(yōu)選的,所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為0. 4mg/ml。所述步驟(2)中的擴張蛋白溶液可參照現(xiàn)有技術(shù)制備,如采用McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins thatinduce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 中的記載的方法制備；也可以按照如下方法制備擴張蛋白溶液將大豆或黃瓜種子經(jīng)0. 05 0. 15wt % HgCl2消毒4 6min,流水沖洗5 7h,然后，25 28°C暗培養(yǎng)4 6天；剪取幼苗下胚軸頂端3 4cm，置_20°C預(yù)冷0. 5h，加預(yù)冷至4°C的勻漿緩沖液，勻漿后，用孔徑70 μ m的尼龍網(wǎng)過濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置I 3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4°C下提取44 50h，過濾，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向濾液中緩慢添加(NH4) 2S04,添加(NH4) 2S04過程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置45 50h，4°C條件下25000g離心5 IOmin,沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液經(jīng)20000g離心lOmin，取上清液即為制備的擴張蛋白溶液。上述擴張蛋白溶液制備方法中，所述勻漿緩沖液組分為25mmol/L HEPES(4_羥乙基哌嗪乙橫酸)，I. 5mmol/LNa2S205, 2mmol/L EDTA, O. Iwt % Triton X-100, pH 7. 0 ;所述提取液組分為15mmol/L 4-輕乙基哌嗪乙磺酸，I. Ommol/L EDTA, I. 5mmol/L Na2S2O5,O. 5mol/L NaCl，pH 6. 0 ;所述酸性緩沖液配制是將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4. 0，水定容至1L。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(2)中所述的分離是在15000r/min條件下離心分離5 IOmin0 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(3)中從發(fā)酵液中提取桑黃胞外總?cè)祁惢衔锏姆椒ǎ襟E如下向步驟⑵制得的發(fā)酵液中加入3 5倍體積的體積百分數(shù)為95%的乙醇溶液，去除沉淀(沉淀為多糖和其它大分子物質(zhì))，取上清液，經(jīng)70°C濃縮蒸餾去除乙醇，然后加入2 3倍體積的乙酸乙酯萃取，再經(jīng)過70°C濃縮蒸餾去除乙酸乙酯，得到桑黃胞外總?cè)祁惢衔铩８鶕?jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中提取桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锏姆椒ǎ襟E如下將步驟(2)制得的桑黃菌絲體65°C烘干，研成粉末，按每克桑黃菌絲體粉末加15 40mL甲醇的量加入甲醇，在室溫條件下，通過頻率40KHz，功率200W的超聲提取5 7h，過濾，取上清液，制得浸提液；濾渣重復(fù)超聲提取、過濾操作，合并浸提液，經(jīng)65°C濃縮蒸餾去除甲醇，得到桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩１景l(fā)明同已有技術(shù)相比有如下積極效果I、本發(fā)明將擴張蛋白應(yīng)用于桑黃總?cè)祁惢衔锏囊后w發(fā)酵中，桑黃胞外總?cè)祁惢衔锖蜕｜S胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量分別高達到952. 12mg/L和475. 51mg/L，相比現(xiàn)有技術(shù)提高了 2. 52倍和2. 19倍，極大的提高了桑黃總?cè)祁惢衔锏漠a(chǎn)量，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。2、本發(fā)明利用天然桑黃菌種作為生產(chǎn)原料，環(huán)保無毒，原材料成本低廉，所采用的桑黃液體發(fā)酵工藝和提取方法簡單，重復(fù)性好；此外，本發(fā)明所述的發(fā)酵過程可控，不受外部環(huán)境條件限制，適于工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。3、本發(fā)明所述擴張蛋白可從大多數(shù)雙子葉和單子葉植物及真菌等不同物種中提取，來源廣泛，成本較低，制備方法也相對簡單，可規(guī)模提取生產(chǎn)，對桑黃總?cè)祁惢衔锏陌l(fā)酵生產(chǎn)具有很好的促進和提升效果。


圖I是不同濃度的擴張蛋白溶液對桑黃胞外總?cè)祁惢衔锖蜕｜S胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量的影響曲線；
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。原料及培養(yǎng)基
實施例中所述的發(fā)酵用桑黃(Phellinus igniarius)菌種,購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為CGMCC No. 51328。香草醛、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、EDTA (乙二胺四乙酸)、牛血清白蛋白、Tritonx-100均購自生工生物工程(上海)有限公司公司；熊果酸標準溶液購自濟南盛偉生物科技有限公司；其他試劑均為普通市售產(chǎn)品。實施例中所述的擴張蛋白溶液的制備步驟如下將大豆(Glycine max L. Merr. CV. M40 ;購自濟南偉_種業(yè)有限公司)或黃瓜(Cucumissativus L. CV. Jinnian No. 6 ;購自濟南偉麗種業(yè)有限公司)種子經(jīng)O. Iwt %HgCl2消毒5min，流水沖洗6h，然后，栽入濕蛭石中，27°C暗培養(yǎng)5d。剪取幼苗下胚軸頂端 3 4cm，即生長區(qū)約100g，置-20°C冰箱預(yù)冷O. 5h，加預(yù)冷至4°C的勻漿緩沖液，高速勻漿后，用70 μ m尼龍網(wǎng)過濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置2h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4°C下提取48h，過濾，濾液按O. 4g/mL的添加量向濾液中緩慢添加(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置48h，4°C條件下25000g離心lOmin，沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C條件下用截留分子量為3000Da的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋(購自北京博潤萊特科技有限公司)透析，透析液經(jīng)20000g離心lOmin，取上清液即為制備的擴張蛋白溶液，置4°C下保存。其他未描述步驟可參照 McQueen-Mason 等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Twoendogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell,1992,4 :1425 1433中的描述進行。上述勻漿緩沖液組分為25mmol/LHERES (4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，I. 5mmol/LNa2S2O5, 2mmol/L EDTA, O. Iwt % Triton X-100, pH 7. O ；上述提取液組分為15mmol/LHERES, I. OmmoI/L EDTA, I. 5mmol/L Na2S2O5,O.5mol/LNaCl, pH 6. O ；所述酸性緩沖液每升按如下方法配制將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4. 0，水定容至1L。擴張蛋白溶液濃度的測定方法采用考馬斯亮藍法檢測，具體可參照(《精編蛋白質(zhì)科學實驗指南》，ISBN:703018086，出版日期1900-1-1)中記載的考馬斯亮藍法進行操作，以牛血清白蛋白作標準曲線，經(jīng)檢測上述擴張蛋白溶液中擴張蛋白濃度為O. 27g/ml。實施例中所述PDA平板培養(yǎng)基，每升組份如下馬鈴薯200g、葡萄糖20g，瓊脂15g,蒸懼水定容至lOOOmL。實施例中所述ro液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組份如下馬鈴薯200g、葡萄糖20g，蒸餾水定容至lOOOmL。實施例I一種利用擴張蛋白提高桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，包括如下步驟(I)將桑黃菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基上，進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 V，培養(yǎng)時間5天，然后取直徑0. 3cm的菌塊6塊，接種于含有H)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中(每500mL三角瓶裝H)液體發(fā)酵培養(yǎng)基150mL)進行發(fā)酵培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度25°C，搖床培養(yǎng)2天，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，得初發(fā)酵液；
(2)向步驟(I)制得的初發(fā)酵液中加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的終濃度為O. 2mg/mL,然后在溫度25°C、搖床轉(zhuǎn)速150r/min的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)5天，15000r/min條件下離心分離lOmin，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液；(3)從 步驟(2)制得的發(fā)酵液中提取桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮瑥纳｜S菌絲體中提取桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铮旌仙｜S胞外總?cè)祁惢衔锖蜕｜S胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铮蒙｜S總?cè)祁惢衔铮簧鲜鎏崛∩｜S胞外總?cè)祁惢衔锏牟襟E如下向步驟(2)制得的發(fā)酵液中加入4倍體積的體積百分數(shù)為95%的乙醇溶液，經(jīng)15000r/min離心5 IOmin去除沉淀，取上清液，經(jīng)70°C濃縮蒸餾去除乙醇，然后加入3倍體積的乙酸乙酯萃取，再經(jīng)過70°C濃縮蒸餾去除乙酸乙酯，得到桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮簧鲜鎏崛∩｜S胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锏牟襟E如下將步驟(2)制得的桑黃菌絲體烘干，研成粉末，按每克桑黃菌絲體粉末加15 40mL甲醇的量加入甲醇，在室溫條件下，通過頻率40KHz，功率200W的超聲提取5h，過濾，取上清，得浸提液，封口置4°C下冷藏；濾渣重復(fù)超聲提取、過濾操作3次，合并浸提液；然后，經(jīng)65°C濃縮蒸餾去除甲醇，得到桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩Ｉ｜S總?cè)祁惢衔锖康臏y定桑黃胞外總?cè)祁惢衔锎郎y樣品的制備取由IOOmL發(fā)酵液制得的桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮蛹状级ㄈ葜?mL，制得桑黃胞外總?cè)祁惢衔锎郎y樣品；桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锎郎y樣品的制備將由干重I. Og的菌絲體中提取出的桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铮蛹状级ㄈ葜?mL，制得桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锎郎y樣品；采用本領(lǐng)域常規(guī)的紫外比色法測定(參照皮文霞，蔡寶昌，郭勝偉等.分光光度法測定山茱萸制劑中總?cè)扑岬暮縖J].南京中醫(yī)藥大學學報.2003，19 (2) =99-100.和王文祥，顧振綸.比色法測定山楂總?cè)扑岬暮?中國野生植物資源[J].2001，20(5):47-48.等文獻報道)(I)標準曲線的建立分別取熊果酸標準溶液O. l、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于試管中，再加香草醛O. 2mL，高氯酸O. 5mL，混勻后于60°C水浴中保溫30min，取出后置4°C冷水中l(wèi)Omin，再加入冰醋酸5mL，于550nm處測定吸光值，以熊果酸的微克數(shù)為橫坐標，吸光度為縱坐標，建立標準曲線。(2)桑黃胞外總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量的檢測加桑黃胞外總?cè)祁惢衔锎郎y樣品O. ImL于試管中，再加香草醛O. 2mL,高氯酸O. 5mL，混勻后于60°C水浴中保溫30min，取出后置4°C冷水中l(wèi)Omin，再加入冰醋酸5mL，于550nm處測定吸光值，經(jīng)檢測，吸光值為O. 293，通過標準曲線計算，O. ImL桑黃胞外總?cè)祁惢衔锎郎y樣品中含有2. 1151mg桑黃胞外總?cè)祁惢衔铩?. 1151mgX (2mL/0. lmL)/100 = O. 42302mg,即每毫升發(fā)酵液中含有桑黃胞外總?cè)祁惢衔?23. 02 yg,因此，每升發(fā)酵液中含有423. 02mg桑黃胞外總?cè)祁惢衔铩Ｈ鐖DI所示。(3)桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量的檢測
加桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锎郎y樣品0. ImL于試管中，再加香草醛0. 2mL,高氯酸0. 5mL，混勻后于60°C水浴中保溫30min，取出后置4°C冷水中l(wèi)Omin，再加入冰醋酸5mL，于550nm處測定吸光值，經(jīng)檢測，吸光值為0. 122，通過標準曲線計算，0. ImL桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锎郎y樣品中含有470. 6u g桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩?70. 6 UgX (2mL/0. ImL) = 9412 y g，即每克菌絲體(干重)中含有桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔?. 41mg,因此，對應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有142. 2Img桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩＝Y(jié)果如圖I所示。因此，每升發(fā)酵液桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量為423. 02mg+142. 2Img = 565. 23mg。實施例2如實施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中擴張蛋白的濃度為0. 4mg/mL ； 經(jīng)檢測計算，每毫升發(fā)酵液中含有桑黃胞外總?cè)祁惢衔?52. 12 U g，即每升發(fā)酵液中含有952. 12mg桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮幻靠司z體(干重)中含有桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔?7. 26mg,即對應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有333. 47mg桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩＝Y(jié)果如圖I所示。因此，每升發(fā)酵液桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量為952. 12mg+333. 47mg =1285. 59mg0實施例3如實施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中擴張蛋白的濃度為
0.6mg/mL ；經(jīng)檢測計算，每毫升發(fā)酵液中含有桑黃胞外總?cè)祁惢衔?29. 51 u g，即每升發(fā)酵液中含有829. 51mg桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮幻靠司z體(干重)中含有桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔?5. 31mg,即對應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有340. 77mg桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩＝Y(jié)果如圖I所示。因此，每升發(fā)酵液桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量為829. 51mg+340. 77mg =1170. 28mg0實施例4如實施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中擴張蛋白的濃度為
0.8mg/mL ；經(jīng)檢測計算，每毫升發(fā)酵液中含有桑黃胞外總?cè)祁惢衔?85. 76 U g，即每升發(fā)酵液中含有785. 76mg桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮幻靠司z體(干重)中含有桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔?6. 34mg,即對應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有449. 5Img桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩＝Y(jié)果如圖I所示。因此，每升發(fā)酵液桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量為785. 76mg+449. 5Img =1235.27mg0實施例5如實施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中擴張蛋白的濃度為
1.Omg/mL ；經(jīng)檢測計算，每毫升發(fā)酵液中含有桑黃胞外總?cè)祁惢衔?38. 63 U g，即每升發(fā)酵液中含有838. 63mg桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮幻靠司z體(干重)中含有桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔?2. 07mg,即對應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有337. 82mg桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩＝Y(jié)果如圖I所示。因此，每升發(fā)酵液桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量為838. 63mg+337. 82mg =1176. 45mg0實施例6如實施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中擴張蛋白的濃度為
I.2mg/mL ；經(jīng)檢測計算，每毫升發(fā)酵液中含有桑黃胞外總?cè)祁惢衔?82. 37 U g，即每升發(fā)酵液中含有882. 37mg桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮幻靠司z體(干重)中含有桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔?3. 25mg,即對應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有335. 03mg桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩＝Y(jié)果如圖I所示。因此，每升發(fā)酵液桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量為882. 37mg+335. 03mg = 1217. 4mg。實施例7如實施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中擴張蛋白的濃度為
I.5mg/mL ；經(jīng)檢測計算，每毫升發(fā)酵液中含有桑黃胞外總?cè)祁惢衔?13. 11 U g，即每升發(fā)酵液中含有713. Ilmg桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮幻靠司z體(干重)中含有桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔?5. 94mg,即對應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有414. 72mg桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩＝Y(jié)果如圖I所示。因此，每升發(fā)酵液桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量為713. llmg+414. 72mg =1127. 83mg0對比例I如實施例I所述的液體發(fā)酵方法，不同之處在于，步驟(2)中用不含擴張蛋白的酸性緩沖液替代實施例加入的擴張蛋白溶液；經(jīng)檢測計算，每毫升發(fā)酵液中含有桑黃胞外總?cè)祁惢衔?70. 15 u g，即每升發(fā)酵液中含有270. 15mg桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮幻靠司z體(干重)中含有桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔?. 76mg,即對應(yīng)每升發(fā)酵液產(chǎn)生的菌絲體中含有149. 03mg桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩＝Y(jié)果如圖I所示。因此，每升發(fā)酵液桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量為270. 15mg+149. 03mg = 419. 18mg。分析根據(jù)以上實施例I 7及對比例I可表明擴張蛋白對桑黃胞外總?cè)祁惢衔铩⑸｜S胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锏漠a(chǎn)量具有明顯促進作用，分別在發(fā)酵液中擴張蛋白的濃度為0. 4mg/mL和0. 8mg/mL時，桑黃胞外總?cè)祁惢衔锖蜕｜S胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量分別達到最高產(chǎn)量952. 12mg/L和475. 51mg/L。相比對比例I分別提高了 2. 52倍和2. 19倍。本發(fā)明擴張蛋白還可從其它雙子葉和單子葉植物及真菌等物種(如燕麥胚芽、栝樓根尖、番茄、煙草、擬南芥、水稻、棉纖維、玉米等)的細胞壁中提取，桑黃菌種也可采用其它普通栽培品種。
權(quán)利要求
1.一種利用擴張蛋白提高桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)將桑黃菌種接種到平板培養(yǎng)基上，進行活化培養(yǎng)，然后取菌塊接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為溫度22 27°C，搖床培養(yǎng)2 3天，搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min,得初發(fā)酵液； (2)向步驟(I)制得的初發(fā)酵液中加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的終濃度為0.2 I.5mg/ml，然后在溫度22 27°C、搖床轉(zhuǎn)速100 180r/min的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)3 5天，分離，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液； (3)從步驟(2)制得的發(fā)酵液中提取桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮瑥纳｜S菌絲體中提取桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铮旌仙｜S胞外總?cè)祁惢衔锖蜕｜S胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铮吹蒙｜S總?cè)祁惢衔铩?br> 2.如權(quán)利要求I所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(I)中的活化培養(yǎng)條件為溫度22 27°C，時間4 5天。
3.如權(quán)利要求I所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為0. 3 I. Omg/mL ;進一步優(yōu)選0. 35 0. 8mg/mL ;最優(yōu)選擴張蛋白的濃度為0. 4mg/mL。
4.如權(quán)利要求I所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(2)中的擴張蛋白溶液的制備方法如下 將大豆或黃瓜種子經(jīng)0. 05 0. 15wt% HgCl2消毒4 6min,流水沖洗5 7h,然后，25 28°C暗培養(yǎng)4 6天；剪取幼苗下胚軸頂端3 4cm，置_20°C預(yù)冷0. 5h，加預(yù)冷至4°C的勻漿緩沖液，勻漿后，用孔徑70 y m的尼龍網(wǎng)過濾，濾渣經(jīng)勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置I 3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4°C下提取44 50h，過濾，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向濾液中緩慢添加(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置45 50h，4°C條件下25000g離心5 lOmin，沉淀用酸性緩沖液復(fù)溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液經(jīng)20000g離心IOmin,取上清液即為制備的擴張蛋白溶液。
5.如權(quán)利要求4所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液組分為25mmol/L4-輕乙基哌嗪乙橫酸，I. Smmol /T, Na2S2O5, 2mmol/L 乙二胺四乙酸,0. Iwt % TritonX-100, pH 7. O。
6.如權(quán)利要求4所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于，所述提取液組分為15mmol/L4~ 輕乙基喊嚷乙橫酸，I. Ommo 1/L 乙二胺四乙酸，1. 5mmo 1/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaCl, pH6.O。
7.如權(quán)利要求4所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于，所述酸性緩沖液每升按如下方法配制 將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4. 0，水定容至1L。
8.如權(quán)利要求I所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(2)中的分離，是指在15000r/min條件下離心分離5 lOmin。
9.如權(quán)利要求I所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中提取桑黃胞外總?cè)祁惢衔锏牟襟E如下 向步驟(2)制得的發(fā)酵液中加入3 5倍體積的體積百分數(shù)為95%的乙醇溶液，去除沉淀，取上清液，經(jīng)70°C濃縮蒸餾去除乙醇，然后加入2 3倍體積的乙酸乙酯萃取，再經(jīng)過70°C濃縮蒸餾去除乙酸乙酯，得到胞外總?cè)祁惢衔铩?br> 10.如權(quán)利要求I所述的液體發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(3)中提取桑黃胞內(nèi)總?cè)氼惢衔锏牟襟E如下 將步驟(2)制得的桑黃菌絲體65°C烘干，研成粉末，按每克桑黃菌絲體粉末加15 40mL甲醇的量加入甲醇，在室溫條件下，通過頻率40KHz，功率200W的超聲提取5 7h，過濾，取上清液，制得浸提液；濾渣重復(fù)超聲提取、過濾操作，合并浸提液，經(jīng)65°C濃縮蒸餾去除甲醇，得到桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铩?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高桑黃總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，包括如下步驟(1)將桑黃菌種接種到平板培養(yǎng)基上，進行活化培養(yǎng)，然后取菌塊接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，得初發(fā)酵液；(2)向初發(fā)酵液中加入擴張蛋白溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3～5天，得到桑黃菌絲體和發(fā)酵液；(3)從發(fā)酵液中提取桑黃胞外總?cè)祁惢衔铮瑥纳｜S菌絲體中提取桑黃胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铮旌仙｜S胞外總?cè)祁惢衔锖蜕｜S胞內(nèi)總?cè)祁惢衔铮吹蒙｜S總?cè)祁惢衔铩１景l(fā)明將擴張蛋白應(yīng)用于桑黃總?cè)祁惢衔锏囊后w發(fā)酵中，桑黃胞外總?cè)祁惢衔锖蜕｜S胞內(nèi)總?cè)祁惢衔锂a(chǎn)量相比現(xiàn)有技術(shù)提高了2.52倍和2.19倍，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/645GK102628064SQ20121011149
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月16日
發(fā)明者萬魯長, 任鵬飛, 單洪濤, 姚強, 孫濤, 宮志遠, 曲玲, 李瑾, 王 琦, 韓建東, 高能 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所