專利名稱：一種利用蛹蟲草液體發酵生產蟲草酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用蛹蟲草液體發酵生產蟲草酸的方法，屬于生物發酵工程技術領域。
背景技術：
蛹蟲草Cordyceps militaris是蟲菌結合的藥用真菌，是子囊菌亞門 Ascomycota、肉座菌目 Hypocreales、麥角菌科 Clavicipitaceae、蟲草屬 Cordyceps 的模式種，又名北冬蟲夏草、北蛹蟲草等，為現代珍稀中草藥，其所含的藥用成分和多種藥效可與傳統名藥——冬蟲夏草相媲美，其中的蟲草酸是主要的生理活性物質，有抗自由基、抗氧化的性質。而且，蟲草酸含量的高低被作為衡量蟲草質量的主要標準之一，一般認為蟲草酸含量高的蟲草的藥用價值高。試驗測定，冬蟲夏草含蟲草酸成分約為7%，而蛹蟲草中的蟲草酸活性成分含量要明顯高于冬蟲夏草，使其應用價值得到人們的廣泛關注。藥理學研究表明，蟲草酸具有促進人體新陳代謝，改善人體微循環系統，明顯降低血脂，抑制細菌，增強對疾病的抵抗力等作用，以及鎮咳、祛痰、平喘的功效。蟲草的增強免疫功可使肝臟的解毒作用增強，抗肝組織纖維化，抗脂質過氧化，能夠有效保護肝細胞，同時可預防和治療腦血栓、 腦出血、心肌梗塞、長期衰竭等。由于對蛹蟲草蟲草酸等活性成分的需求增長迅速，野生蛹蟲草資源被瘋狂采摘而日益稀少昂貴，通過化學合成其活性成分的途徑工藝復雜且產量極低，因此其廣泛應用受到藥源資源的嚴重制約。研究發現，通過液體發酵生產與從蛹蟲草子實體、菌絲體中直接提取得到的蟲草酸等活性成分在生化結構、生理作用上基本是相同的，而且具有培養周期短、 生產流程易控制、活性物質易于提取等優點，蟲草酸等活性物質的提取含量及效率都要遠高于利用人工栽培蟲草進行生產和提取。但是目前的蛹蟲草及蟲草酸等活性成分的生產仍是以傳統的固體栽培為主，液體培養研究和應用由于發展時間短，許多發酵技術和工藝仍不成熟，整體產量和發酵水平較低，限制了其工業化生產的發展。擴張蛋白是在植物細胞壁中發現的一類新蛋白種類。研究表明，擴張蛋白幾乎參與了植物的整個發育過程除具有增大細胞的功能外，擴張蛋白在細胞生長、種子萌發、根毛形成、根系生長、葉原基形成、葉子生長發育、果實成熟、器官脫離，以及花粉管生長方面起著重要的作用。在擬南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多種植物中均已發現擴張蛋白，被認為其普遍存在于各種雙子葉和單子葉植物的細胞壁中。試驗表明擴張蛋白是一類細胞壁酶蛋白，能夠通過打斷細胞壁多聚物之間的氫鍵誘導酸依賴的細胞壁延展和壓力松弛，進而可能還是在植物生長過程中起生理調控和細胞壁延伸過程中的一個重要調控因子。然而，關于擴張蛋白的作用機制目前仍未有明確定論，將擴張蛋白應用于食藥用菌蛹蟲草的液體發酵進行蟲草酸等次生代謝產物的生產，國內外目前均未見報道。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種利用擴張蛋白進行蛹蟲草液體發酵生產蟲草酸的方法。本發明技術方案如下一種利用蛹蟲草的液體發酵生產蟲草酸的方法，包括如下步驟(I)將蛹蟲草菌種接種到H)液體發酵培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數10 15%的接種量轉接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為溫度 20 25°C，搖床培養24 72h，得種子液；(2)將步驟(I)制得種子液按5 15%的體積比接種于液體發酵培養基中，在溫度20 25°C的條件下，液體發酵培養20 30h，然后加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的濃度為O. 5 2. 5mg/mL，然后繼續培養96 144h，分離，得到蛹蟲草菌絲體；(3)從步驟(2)制得的蛹蟲草菌絲體中提取蛹蟲草胞內蟲草酸，即得蟲草酸。根據本發明優選的，所述步驟(I)中的ro液體發酵培養基，每升組分如下馬鈴薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至1000mL。根據本發明優選的，所述步驟(I)中的活化培養條件為搖床轉速100 160r/ min，溫度20 25 °C，暗培養活化24 72h。根據本發明優選的，所述步驟(I)中的種子發酵培養基，每升組分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5顆直徑3 6_的玻璃珠。經種子發酵培養基培養后，菌球數量可提高60%以上、菌球直徑縮小40%以上，菌絲松散均勻。根據本發明優選的，所述步驟(2)中的液體發酵培養基，每升組分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、2g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3g KH2PO4' 0. 3g K2HPO4。根據本發明優選的，所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為I. O 2. 5mg/mL ;進一步優選I. 8 2. Omg/mL。最優選的,所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為I. 5mg/mL。所述步驟(2)中的擴張蛋白溶液可參照現有技術制備,如采用McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 中的記載的方法制備；也可以按照如下方法制備擴張蛋白溶液將蠶豆或黃瓜種子經0. 05 0. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水沖洗5 7h，栽入濕蛭石，25 28°C暗培養4 6天；剪取幼苗上胚軸或根系4 5cm，置_20°C預冷I 2h，加預冷至O 4°C的勻漿緩沖液勻漿后，用孔徑60 80 μ m的尼龍網過濾，濾渣經勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置I 3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，O 4°C下提取24 30h，過濾，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向濾液中緩慢添加 (NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4過程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置24 30h， 4°C條件下25000g離心5 IOmin,沉淀用酸性緩沖液復溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析，透析液經20000g離心5 lOmin，取上清液即為制備的擴張蛋白溶液。上述擴張蛋白溶液制備方法中，所述勻漿緩沖液組分為25mmol/LHEPES(4-羥乙基哌嗪乙橫酸)，3mmol/L Na2S2O5, Immol /T, EDTA, 0. Iwt % Triton X-100, pH 7. 0 ;所述提取液組分為25mmol/L 4-輕乙基哌嗪乙磺酸，I. 0mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸)，3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaCl，pH 6. 8 ;所述酸性緩沖液配制是將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調節PH至4. 0，水定容至1L。
根據本發明優選的，步驟(2)中所述的分離是在4°C 12000r/min條件下離心分離
5 IOmin0根據本發明優選的，所述步驟(3)中提取蛹蟲草蟲草酸活性成分的方法，步驟如下將步驟⑵制得的蛹蟲草菌絲體65°C烘干I 3h，研成粉末，取O. Ig蛹蟲草菌絲體粉末加20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，以500W的功率微波處理lmin，然后12000r/ min離心5min，取上清液，沉淀中加入20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，按前述步驟微波處理并離心，合并上清液，制得蟲草酸。本發明與已有技術相比有如下優點I、本發明將擴張蛋白應用于蛹蟲草的蟲草酸液體發酵生產,產量可達2. 621g/L, 是對照(對比例I)蟲草酸發酵產量的7. 3倍以上；本發明大大提高了整體蛹蟲草的蟲草酸有效成分的產量，具有很好的工業化應用前景；2、本發明采用液體好氧發酵方法，一般為5 7天，相對于現有技術，產量高，周期短，無需靜置培養及誘導合成產物等過程，生產效率較高，所生產的蛹蟲草的蟲草酸活性成分可直接用于免疫力調節、降脂保肝、降血糖等藥物的制備；3、本發明所述擴張蛋白可從大多數雙子葉和單子葉植物中提取，來源廣泛，成本較低，本發明的制備方法經優化后步驟也相對簡單，產量高，可規模提取生產，對蛹蟲草蟲草酸類活性物質的發酵生產具有很好的促進和提升效果；4、本發明所采用的蛹蟲草液體發酵工藝簡單，環保無毒，原材料成本低廉，而且全發酵過程可控，不受外部環境條件限制，適合工業化生產及推廣應用。5、本發明對液體發酵培養基和種子發酵培養基的配方進行了優化，能夠大幅度提高蛹蟲草的蟲草酸活性成分的產量。


圖I是不同濃度的擴張蛋白溶液對蛹蟲草的蟲草酸產量的影響曲線；
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作詳細說明，但本發明所保護范圍不限于此。原料及培養基實施例中所述的蛹蟲草(Cordyceps militaris)發酵菌種，菌種保藏號為CGMCC No. 5. 701和CGMCC No. 3. 4655，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。實施例中的甘露醇、鼠李糖、乙酸胺、乙酰丙酮均購自濟南盛偉生物科技有限公司；實施例中所述的擴張蛋白溶液的制備步驟如下將蠶豆(Vicia faba L.;購自濟南茂豐種苗有限公司)或黃瓜(Cucumis sativus L. CV. Jinnian No. 6 ;購自濟南偉麗種業有限公司)種子經O. 15wt% HgCl2消毒6min,流水沖洗6h，栽入濕蛭石中，27°C暗培養4d。剪取幼苗上胚軸4 5cm，即生長區約100g， 置-20°C冰箱預冷lh，加預冷至4°C的勻漿緩沖液，高速勻漿后，用70 μ m尼龍網過濾，濾渣經勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置2h，得靜置液；向靜置液中加入提取液，4°C下提取24h，過濾，濾液按O. 4g/mL的添加量向濾液中緩慢添加(NH4)2SO4, 添加(NH4)2SO4S程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置24h，4°C條件下 25000g離心5min，沉淀用酸性緩沖液復溶，4°C條件下用截留分子量為3000Da的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋(購自北京博潤萊特科技有限公司)透析，透析液經20000g離心5min， 取上清液即為制備的擴張蛋白溶液，置4°C下保存。其他未描述步驟可參照McQueen-Mason 等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 以及https:// homes, bio. psu. edu/expansins/ProtocoIs/Extraction. htm 中的描述進行。上述勻漿緩沖液組分為25mmol/LHERES (4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，3mmol/ LNa2S2O5, Immol /T, EDTA, O. Iwt% Triton X-100, pH 7. 0 ；上述提取液組分為25mmol/LHERES, I. OmmoI/L EDTA(乙二胺四乙酸)，3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaCl, pH 6. 8 ；所述酸性緩沖液每升按如下方法配制將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調節pH至4. 0，水定容至1L。擴張蛋白溶液濃度的測定方法采用考馬斯亮藍法檢測，具體可參照(《精編蛋白質科學實驗指南》，ISBN:703018086，出版日期1900-1-1)中記載的考馬斯亮藍法進行操作， 以牛血清白蛋白作標準曲線，經檢測上述擴張蛋白溶液中擴張蛋白濃度為O. 33g/mL。實施例中所述的ro液體發酵培養基，每升組分如下馬鈴薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至lOOOmL。實施例中所述的種子發酵培養基，每升組分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5顆直徑3 6mm的玻璃珠。實施例中所述的液體發酵培養基，每升組分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、2g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3g KH2PO4'
0.3g/L K2HPO4。實施例I :一種利用擴張蛋白提高蛹蟲草的蟲草酸產量的液體發酵方法，包括如下步驟(I)將蛹蟲草(Cordyceps militaris)菌種，菌種編號為 CGMCC No. 5. 701,接種到ro液體發酵培養基中，進行活化培養，在溫度25°C、搖床轉速150r/min的條件下暗培養 48h，然后按體積百分數15 %的接種量轉接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為 溫度25°C，搖床培養48h，得種子液；(2)將步驟⑴制得種子液按15%體積比接種于液體發酵培養基中，在溫度25°C 的條件下，液體發酵培養24h，然后加入擴張蛋白溶液,使擴張蛋白的濃度為I. 0mg/mL，然后繼續培養120h, 12000r/min條件下離心分離IOmin,去發酵上清液得到蛹蟲草菌絲體；(3)從步驟⑵制得的蛹蟲草菌絲體中提取蟲草酸，步驟如下將步驟(2)由IL發酵液制得的蛹蟲草菌絲體65°C烘干I 3h，得4. 072g蛹蟲草菌絲，研成粉末，取0. Ig蛹蟲草菌絲體粉末加20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，以500W的功率微波處理lmin，然后12000r/min離心5min，取上清液，沉淀中繼續加入20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，按前述步驟微波處理并離心，合并上清液，制得蟲草酸。
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蟲草酸待測樣品的制備取上述步驟制得的蟲草酸，用體積濃度為50%的乙醇溶液定容至50mL。蟲草酸活性成分的測定采用本領域常規的高碘酸鈉比色法測定(參照溫魯，尹起范，唐玉玲等.蛹蟲草與有關蟲草活性成份檢測比較[J].食品科學，2004，25 (8) =155-157)(I)標準曲線的建立以甘露醇為基準的標準曲線制作稱取105°C干燥2h并冷卻至室溫的甘露醇粉末，配成5mg/mL的標準溶液。精確吸取甘露醇標準溶液0mL、0. lmL、0. 2mL、0. 3 mL、0. 4mL、
0.5mL、0. 6mL、0. 7mL、0. 8mL、0. 9mL置試管中，分別加蒸懼水水至I. OmL,然后加ImL 15mM的高碘酸鈉試液(3. 2g高碘酸鈉溶于蒸餾水中，加10. 2mL濃鹽酸，蒸餾水定容至1L)混勻，室溫放置IOmin,加2mL O. Iwt %鼠李糖，4mL新配制的Nash試液(稱取乙酸胺150g,蒸懼水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，定容至1L)，搖勻，置于53°C水浴中保溫15min。用分光光度計在420nm下測定反應溶液的吸光度值，以甘露醇含量(mg/mL)為橫坐標，吸光度值 A4m為縱坐標,繪制得到標準曲線。(2)蟲草酸活性成分產量的檢測取蟲草酸待測樣品500yL于試管中，用蒸餾水定容至l.OmL，搖勻。空白對照為
1.OmL水。然后加ImL 15mM的高碘酸鈉試液(3. 2g高碘酸鈉溶于蒸餾水中，加10. 2mL濃鹽酸，蒸懼水定容至1L)混勻，室溫放置IOmin,加2mL O. I %鼠李糖,4mL新配制的Nash試液(稱取乙酸胺150g，蒸餾水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，定容至1L)，搖勻，置于 53°C水浴中保溫15min。用分光光度計在420nm下測定反應溶液的吸光度值。根據標準曲線計算蟲草酸待測樣品中蟲草酸含量為237. 23 μ g。每升發酵液對應菌絲體的蟲草酸產量為237. 23 μ gX IOOX 10X4. 072 =
O.966g;結果如圖I所示。實施例2 如實施例I所述的液體發酵方法，不同之處在于，步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的濃度為I. 5mg/mL,然后繼續培養120h。經檢測計算，每克菌絲體(干重)中含有蟲草酸271. 55mg,即對應每升發酵液產生的菌絲體中含有2. 621g蛹蟲草蟲草酸。結果如圖I所示。實施例3 如實施例I所述的液體發酵方法，不同之處在于，步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的濃度為2. Omg/mL，然后繼續培養120h。經檢測計算，每克菌絲體(干重)中含有蟲草酸257. 07mg,即對應每升發酵液產生的菌絲體中含有2. 097g蛹蟲草蟲草酸。結果如圖I所示。實施例4如實施例I所述的液體發酵方法，不同之處在于，步驟(2)中在溫度25°C的條件下，加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的濃度為2. 5mg/mL,然后繼續培養120h。經檢測計算，每克菌絲體(干重)中含有蟲草酸252. 39mg,即對應每升發酵液產生的菌絲體中含有1.949g蛹蟲草蟲草酸。結果如圖I所示。對比例I
如實施例I所述的液體發酵方法，不同之處在于，所述步驟(2)中用不含擴張蛋白的酸性緩沖液替代實施例加入的擴張蛋白溶液，溫度25°C的條件下，液體發酵培養144h。經檢測計算，每克菌絲體(干重)中含有蟲草酸175. 25mg,即對應每升發酵液產生的菌絲體中含有O. 356g蛹蟲草蟲草酸。結果如圖I所示。
權利要求
1.一種利用蛹蟲草的液體發酵生產蟲草酸的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將蛹蟲草菌種接種到ro液體發酵培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數 10 15%的接種量轉接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為溫度20 250C，搖床培養24 72h，得種子液；(2)將步驟(I)制得種子液按5 15%的體積比接種于液體發酵培養基中，在溫度 20 25°C的條件下，液體發酵培養20 30h，然后加入擴張蛋白溶液，使擴張蛋白的濃度為 O. 5 2. 5mg/mL，然后繼續培養96 144h，分離，得到蛹蟲草菌絲體；(3)從步驟(2)制得的蛹蟲草菌絲體中提取蛹蟲草胞內蟲草酸，即得蟲草酸。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的活化培養條件為搖床轉速100 160r/min，溫度20 25°C，暗培養活化24 72h。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的種子發酵培養基，每升組分如下3g 葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0.03g CaCl2、0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5顆直徑3 6mm的玻璃珠。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的液體發酵培養基，每升組分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、2g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0.03g CaCl2,0. 3g KH2PO4'O. 3g K2HPO4。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為I.O 2. 5mg/mL。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，擴張蛋白的濃度為I.8 2.Omg/mL ;最優選的,所述步驟⑵中，擴張蛋白的濃度為I. 5mg/mL。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的擴張蛋白溶液按照如下方法制備將蠶豆或黃瓜種子經O. 05 O. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水沖洗5 7h，栽入濕蛭石，25 28°C暗培養4 6天；剪取幼苗上胚軸或根系4 5cm，置_20°C預冷I 2h，加預冷至O 4°C的勻漿緩沖液勻漿后，用孔徑60 80 μ m的尼龍網過濾，濾渣經勻漿緩沖液洗滌，然后將濾渣加入勻漿緩沖液中，室溫靜置I 3h，得靜置液；向靜置液中加入提取液， O 4°C下提取24 30h,過濾，按O. 3 O. 5g/mL的添加量向濾液中緩慢添加(NH4)2SO4, 添加(NH4)2SO4S程中不斷攪拌，防止(NH4)2SO4局部過飽和，然后靜置24 30h，4°C條件下 25000g離心5 IOmin,沉淀用酸性緩沖液復溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液經20000g離心5 lOmin，取上清液即為制備的擴張蛋白溶液。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述勻漿緩沖液組分為25mmol/L4-羥乙基哌嗪乙橫酸，3mmol/L Na2S2O5, lmmol/L 乙二胺四乙酸，O. Iwt % Triton Χ-100, ρΗ7· O ; 所述提取液組分為25mmol/L 4-輕乙基哌嗪乙磺酸，I. Ommol/L乙二胺四乙酸,3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaGl，pH 6. 8 ;所述酸性緩沖液配制是將2. 05g醋酸鈉溶于水中，用冰醋酸調節PH至4. 0，水定容至1L。
9.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的分離是在4°C12000r/ min條件下離心分離5 lOmin。
10.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中提取蛹蟲草蟲草酸活性成分的方法，步驟如下將步驟(2)制得的蛹蟲草菌絲體65°C烘干I 3h，研成粉末，取O. Ig蛹蟲草菌絲體粉末加20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，以500W的功率微波處理lmin，然后12000r/min離心5min，取上清液，沉淀中加入20mL體積濃度為50%的乙醇溶液，按前述步驟微波處理并離心，合并上清液，制得蟲草酸。
全文摘要
本發明涉及一種利用蛹蟲草液體發酵生產蟲草酸的方法，(1)將蛹蟲草菌種接種到PD液體發酵培養基中，進行活化培養，然后轉接到種子發酵培養基中，進行種子培養，得種子液；(2)將種子液接種于液體發酵培養基中，液體發酵培養20～30h，然后加入擴張蛋白溶液，繼續培養96～144h，分離，得到蛹蟲草菌絲體；(3)從蛹蟲草菌絲體中提取蛹蟲草胞內蟲草酸，即得蟲草酸。本發明將擴張蛋白應用于蛹蟲草的蟲草酸液體發酵生產，產量可達2.621g/L，是對照蟲草酸發酵產量的7.3倍以上；具有很好的工業化應用前景。
文檔編號C12P7/18GK102605005SQ20121011151
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月16日 優先權日2012年4月16日
發明者萬魯長, 任鵬飛, 單洪濤, 姚強, 孫濤, 宮志遠, 李瑾, 王 琦, 趙軍勝, 韓建東, 高能 申請人:山東省農業科學院農業資源與環境研究所