專利名稱：雜交瘤細胞株10g4及其產生的抗黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2總量單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及雜交瘤細胞株10G4及其產生的抗黃曲霉毒素總量單克隆抗體。
背景技術：
黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌產生的次生代謝產物，是能引起人畜各種損害的天然有毒化合物。黃曲霉毒素品種較多，目前被已發現20余種。黃曲霉毒素具有污染廣、毒性強、危害重等特點。因此，全球至今至少有70個以上的國家制定了農產品及食品中黃曲霉毒素限量標準，很多國家更是制定了主要黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量的限量標準。因此黃曲霉毒素總量分析方法顯得尤為重要。現有黃曲霉毒素的檢測方法包括薄層層析法、精密儀器分析法和免疫學分析法。其中薄層層析法是檢測黃曲霉毒素最常用的檢測方法，其不需要特殊的儀器設備，一般實驗室都可進行，但試劑用量大、操作繁瑣、其它組分干擾嚴重、準確性差，不能準確定量，且對實驗人員和周圍環境污染危害較大，不適于現場快速檢測。精密儀器分析法包括熒光分光光度法和高效液相色譜法，其靈敏度高，準確性好，但儀器昂貴，要求黃曲霉毒素樣品純化程度高，樣品前處理過程繁瑣，耗時長，對實驗環境要求高，難以實現快速檢測。近些年發展起來的免疫分析技術克服了前兩者的缺點，具有特異性強、靈敏度高、樣品前處理簡單、成本低、對實驗人員和周圍環境的污染危害小、適于現場批量檢測等優點。免疫分析是利用抗原和抗體的特異性反應和抗體(或抗原)上標記物的生物、物理或化學放大作用來對超微量殘留物進行定性、定量檢測，所以要研究建立針對黃曲霉毒素總量分析方法的任何一種免疫學檢測技術，都必須先制得抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量的抗體。事實上無論國內還是國際上研制黃曲霉毒素抗體的報道很多，黃曲霉毒素通用抗體也有報道，甚至也有個別學者將黃曲霉通用抗體用來建立黃曲霉毒素總量分析方法。黃曲霉毒素通用抗體主要強調抗體對各種黃曲霉毒素均可發生較強的特異性結合反應，可被用來分別建立每種黃曲霉毒素的免疫分析方法；而黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量抗體則不僅強調抗體對各種黃曲霉毒素均可發生較強的特異性結合反應，而且還特別強調應用該抗體建立的針對每種黃曲霉毒素的免疫分析方法的靈敏度一致性要強。國內外現有報道的黃曲霉毒素通用抗體通用性都是比較強的，但針對每種黃曲霉毒素的分析靈敏度一致性卻通常都較差，因此，這些報道的黃曲霉毒素通用抗體并不適合用來建立黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量分析方法，即使建立了黃曲霉毒素總量分析方法，其定量分析的準確性也會大打折扣。因此，研制黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量抗體對實現黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量免疫快速定量檢測具有重要意義。

發明內容
本發明所要解決的問題是提供雜交瘤細胞株10G4及其產生的抗黃曲霉毒素BI、B2、G1、G2總量單克隆抗體。、
本發明提供了雜交瘤細胞株10G4，該細胞株已于2010年7月13日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO.C201016，分類命名為小鼠雜交瘤細胞10G4。其具有序列表中SEQ ID NO. I所示的抗黃曲霉毒素BI、B2、GU G2總量單克隆抗體重鏈可變區編碼基因序列和序列表中SEQ ID NO. 2所示的抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體輕鏈可變區編碼基因序列。抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體，它由保藏編號為CCTCC NO. C201016的雜交瘤細胞株10G4分泌產生。其重鏈可變區具有序列表中SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列；輕鏈可變區具有序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。本發明提供的雜交瘤細胞株10G4是采用兩步篩選法獲得的，其具體步驟為將BALB/c小鼠經黃曲霉毒素完全抗原AFBl-BSA免疫4_6次后，用2倍于前一次免疫劑量的黃曲霉毒素完全抗原AFBl-BSA作最后一次加強免疫，3天后進行細胞融合，采用ELISA方法分兩步進行篩選融合細胞第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素BI而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性孔培養液進行檢 測，用黃曲霉毒素G2作為競爭原——因為國內外現有報道的黃曲霉毒素通用抗體對黃曲霉毒素G2的交叉反應率往往是最小的(< 50%)，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔，采用有限稀釋法進行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步篩選法進行檢測，如此重復克隆2-3次后，最終篩選獲得雜交瘤細胞株10G4。抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體在黃曲霉毒素BI、B2、Gl、G2總量測
定中的應用。本發明提供的抗黃曲霉毒素BI、B2、GU G2總量單克隆抗體的制備方法，步驟如下將獲得的雜交瘤細胞株10G4注射預先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化即得抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體。按上述方案，所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體操作為用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4°C，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30 35 u L,室溫混合30 60min，4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0. lmol/L和pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調節該混合液的pH值至7. 4，4 °C預冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0. 277g/mL, 4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體，將抗體置_20°C冰箱中備用;
所述的醋酸鹽緩沖液為0. 29g醋酸鈉，0. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的
0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液為0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0. 02g，加水定容至IOOmL所得。本發明的有益效果在于
(I)本發明提供的雜交瘤細胞株10G4可以用于制備抗黃曲霉毒素BI、B2、Gl、G2總量單克隆抗體。用常規非競爭酶聯免疫吸附分析(ELISA)法測得10G4的鼠腹水抗體的效價可達 5. 12X105。(2)本發明提供的抗黃曲霉毒素BI、B2、GU G2總量單克隆抗體可以一致性較好地識別黃曲霉毒素81、82、61、62，對黃曲霉毒素則、82、61、62的50%抑制濃度IC5tl依次為2. 09ng/mL、2. 23ng/mL、2. 19ng/mL、3. 21ng/mL，對黃曲霉毒素 BI、B2、Gl、G2 的交叉反應率范圍為 65. 2%-100%。(3)本發明提供的抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體可應用于定量測定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量。
具體實施例方式實施例I :雜交瘤細胞株10G4的制備
I.動物免疫 購買6周齡BALB/c小鼠6只，免疫市售的黃曲霉毒素BI完全抗原AFB1-BSA。第一次免疫將黃曲霉毒素BI完全抗原與等量福氏完全佐劑乳化后，于小鼠頸背部皮下多點注射。第二次免疫于4周后進行，采用福氏不完全佐劑與等量黃曲霉毒素BI完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫與第二次免疫間隔4周，免疫方式與其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后進行，免疫方式與第二次免疫相同，同樣為腹腔注射。4次免疫劑量相同，均為每鼠50 ii g。前3次每次免疫后8天,尾靜脈采血,分離血清,采用間接ELISA法監測小鼠血清效價。第4次免疫后8天，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監測小鼠血清效價，并用間接競爭ELISA法測定小鼠血清靈敏度，選擇效價、靈敏度均相對較高的血清對應的小鼠進行最后一次加強免疫，免疫劑量為之前的2倍。黃曲霉毒素BI完全抗原AFBl-BSA購于 Sigma-Aldrich 公司。2.細胞融合
于最后一次加強免疫3天后，采用50%(重量百分數)的聚乙二醇即PEG(分子量為1450)作融合劑，按常規方法進行細胞融合，具體步驟無菌條件下殺死免疫小鼠，分離脾細胞，與鼠源骨髓瘤細胞SP2/0以5 : I的個數比混合，用RPMI-1640基礎培養液洗混合細胞，用50%PEG融合，融合I分鐘，然后加滿RPMI-1640基礎培養液，離心，移去上清，小鼠脾細胞和鼠源骨髓瘤細胞SP2/0形成的融合細胞用72mLRPMI-1640基礎培養液重懸，將重懸起來的細胞滴加到96孔細胞培養板內，2滴/孔，置37°C二氧化碳培養箱培養，所述的RPMI-1640基礎培養液為含有20% (體積百分數)胎牛血清，2% (重量百分數)生長因子和1% (重量百分數)次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0購于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基礎培養液購于Hyclone公司；1%次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即 HAT 購于 Sigma-Aldrich 公司。3.細胞株的篩選及克隆
待細胞融合后第12天左右，細胞集落長到占孔底1/2大小，培養液變黃，即可進行抗體檢測。采用ELISA方法對有雜交瘤細胞生長的培養孔進行篩選，篩選分兩步進行，第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素BI而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性孔進行檢測，用黃曲霉毒素G2作為競爭原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競爭原為0的孔即陽性對照孔的最終測定值較高，靈敏度較高指抑制率為50%時的競爭原濃度亦即IC5tl值較小)，采用有限稀釋法進行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步法進行檢測，如此重復克隆2-3次后，獲得雜交瘤細胞株10G4。實施例2 :抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體雜交瘤細胞株系10G4抗體可變區序列測定
(1)提取總RNA:采用天根公司的總RNA提取試劑盒并按照說明書提取可產生雜交瘤細胞株系10G4的總RNA ；
(2)合成cDNA:以步驟I獲得的總RNA為模板，oligo(dT) 15為引物，按照SuperScript -2 II反轉錄酶說明書進行反轉錄,合成cDNA第一鏈；引物oligo (dT) 15由Invitrogen 購得；
(3)PCR法克隆可變區基因根據GENEBANK中小鼠抗體基因序列的保守位點設計引物，以cDNA為模版擴增抗體輕、重鏈可變區基因。PCR程序為94°C 30s,55°C lmin、72°C Imin，擴增30個循環，最后72°C延伸lOmin。PCR產物經過1% (重量百分數)的瓊脂糖凝膠 電泳分離后，用試劑盒純化回收DNA片段，連接到載體PMD18-T中，轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，挑取陽性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進行測序。其中引物的序列分別為重鏈可變區引物為 5'-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CffG G_3’(22mer)和 5'-TGA GGA GACGGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中 S、M、R 和 W 為兼并堿基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，輕鏈可變區引物為 5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC _3’(24mer)和 5’-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’(24mer)。得到的基因序列結果重鏈可變區編碼基因序列長356bp，序列如SEQ ID NO: I所示，根據所獲得的基因序列推導出該基因序列所編碼的重鏈可變區由118個氨基酸組成，序列如SEQ ID NO:3所示。輕鏈可變區編碼基因序列長332bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根據所獲得的基因序列推導出該基因序列所編碼的輕鏈可變區由110個氨基酸組成，序列如 SEQ ID NO:4 所示。實施例3 :抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體的制備純化、亞型和特性鑒定
將實施例2獲得的抗黃曲霉毒素BI、B2、Gl、G2總量單克隆抗體雜交瘤細胞株系10G4注射預先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為用雙層濾紙過濾小鼠腹水，4°C，12000r/min離心15min，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33 u L，室溫混合30min，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0. lmol/L和pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調節該混合液的pH值至7. 4，4 °C預冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0. 277g/mL，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min,棄上清,將所得沉淀用原腹水體積1/10的0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素BI、B2、GU G2總量單克隆抗體，將抗體置_20°C冰箱中備用；所述的醋酸鹽緩沖液為0. 29g醋酸鈉，0. 14ImL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液為0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，
0.02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0. 02g，加水定容至IOOmL所得。
用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細胞株10G4分泌的抗黃曲霉毒素BI、B2、GUG2總量單克隆抗體的亞型為IgGl。用常規非競爭酶聯免疫吸附分析(ELISA)法測得10G4的鼠腹水抗體的效價可達
5.12X105，即鼠腹水抗體稀釋5. 12X IO5倍時的溶液測定結果為陽性。用常規間接競爭ELISA法鑒定其對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量的靈敏度50%抑制濃度IC5tl依次為2. 09ng/mL、2. 23ng/mL、2. 19ng/mL、3. 21ng/mL，對黃曲霉毒素BI、B2、Gl、G2的交叉反應率范圍為65. 2%-100%o實施例4 :黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體10G4的應用。將實施例3中獲得的黃曲霉毒素BI、B2、Gl、G2共4條標準曲線平均化處理獲得一條新的定量分析曲線作為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量分析曲線，并用于檢測5份花生 實際樣品黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量，同時采用GB/T 18979-2003高效液相色譜標準方法進行檢測比對，結果顯示兩種方法一致性比較理想，詳細結果
樣品I :基于抗體10G4的總量ELISA方法檢測結果為0. 23ng/mL,GB/T 18979-2003高效液相色譜標準方法檢測結果為0. 2ng/mL ；
樣品2 :基于抗體10G4的總量ELISA方法檢測結果為I. 47ng/mL,GB/T 18979-2003高效液相色譜標準方法檢測結果為I. 2ng/mL ；
樣品3 :基于抗體10G4的總量ELISA方法檢測結果為0. 88ng/mL,GB/T 18979-2003高效液相色譜標準方法檢測結果為I. I ng/mL ；
樣品4 :基于抗體10G4的總量ELISA方法檢測結果為陰性，GB/T 18979-2003高效液相色譜標準方法檢測結果為陰性；
樣品5 :基于抗體10G4的總量ELISA方法檢測結果為0. 92ng/mL,GB/T 18979-2003高效液相色譜標準方法檢測結果為0. 8ng/mL。
權利要求
1.雜交瘤細胞株10G4，其特征在于它保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO. C201016。
2.抗黃曲霉毒素BI、B2、Gl、G2總量單克隆抗體，其特征在于它由保藏編號為CCTCCNO. C201016的雜交瘤細胞株10G4分泌產生。
3.根據權利要求2所述的抗黃曲霉毒素BI、B2、Gl、G2總量單克隆抗體在黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量測定中的應用。
4.根據權利要求2所述抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體的制備方法，步驟如下將獲得的雜交瘤細胞株10G4注射預先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化即得抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體。
全文摘要
本發明涉及雜交瘤細胞株10G4及其分泌產生的抗黃曲霉毒素總量單克隆抗體。本發明提供的雜交瘤細胞株10G4(CCTCCNO.C201016)可以用于制備抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體，并用常規非競爭酶聯免疫吸附分析(ELISA)法測得10G4的鼠腹水抗體的效價可達5.12×105；本發明提供的抗黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量單克隆抗體可以一致性較好地識別黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的50%抑制濃度IC50依次為2.09ng/mL、2.23ng/mL、2.19ng/mL、3.21ng/mL，對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反應率范圍為65.2%-100%；可應用于定量測定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量。
文檔編號C12N5/20GK102747042SQ20121011761
公開日2012年10月24日 申請日期2012年4月20日 優先權日2012年4月20日
發明者丁小霞, 張兆威, 張奇, 張文, 李冉, 李培武, 李鑫 申請人:中國農業科學院油料作物研究所