專利名稱：一株發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株內生真菌。
背景技術：
北五味子[Schisandra chinensis (Turcz. ) Baill.],木蘭科植物五味子的干燥成熟果實，是既食又藥功能性保健食品。北五味子的活性成分是以五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等為代表的木脂素類成分，該類成分具有明顯的抗癌、抗炎、鎮靜，抗焦慮，保護肝細胞，抗化學性肝損傷、抗菌等作用，現廣泛應用于醫藥和食品行業。由于北五味子需求量上漲，森林面積逐漸減少以及盲目的采挖，使北五味子資源面臨考驗，目前北五味子是國家三級重點保護的瀕危藥用植物。發酵技術可以改變或增強食品的某些活性，保護食品中某些活性成分，節省資源，為食品、藥品活性成分的獲得提供新方法。關于北五味子發酵的相關研究目前未見報道。
發明內容
本發明提供了一株發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌。本發明發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger)WJl，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No:M2012044，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日；它在PDA固體培養基上培養，菌絲初為白色，后變成黑色厚絨狀，背面無色，菌株頂部形成球狀頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，上長有成串黑褐色球狀分生孢子，孢子直徑3. 5 y m，分生孢子頭球狀，褐黑色。本發明中發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,依據《真菌分類學》、《真菌鑒定手冊》和《半知菌屬圖解》,可見WJl菌株的菌落特征和孢子形態與曲霉菌特征極為相近。本發明中發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,其ITS序列提交至NCBI網頁,通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過MEGA5. 03軟件構建系統進化樹，WJl菌株的ITS序列與曲霉屬菌黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的相似性達到了 99%以上,結合形態學觀察結果,確定WJl菌株為黑曲霉(Aspergillus niger)。本發明發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger) WJ1，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No:M2012044，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本發明采用分離自北五味子的內生真菌WJl發酵北五味子，以北五味子中4種主要木脂素成分為指標，比較其發酵前后此4種主要活性成分的動態變化，旨在增強北五味子的活性和提高木脂素成分含量，為高效利用北五味子，節省藥源、開發新型功能性保健食品提供依據。本發明發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,它能使北五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等主要活性成分顯著提高，因此在以獲得五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素為目的的原料生產中可以選擇五味子內生真菌WJl發酵五味子以提高得率，節省藥源。
圖I為具體實施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的菌落形態圖；圖2為具體實施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的菌落形態圖；圖3為具體實施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的菌落形態圖；圖4為具體實施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的PCR擴增的電泳圖，其中M泳道表示Marker，WJl泳道表示WJl ；圖5為具體實施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的系統進化樹圖；圖6為具體實施方式
一中混合對照品的HPLC色譜圖，其中I表示五味子醇甲，2表不五味子酯甲，3表不五味子甲素和4表不五味子乙素；圖7為具體實施方式
一中北五味子的HPLC色譜圖，其中I表示五味子醇甲，2表示五味子酯甲，3表不五味子甲素和4表不五味子乙素；圖8為具體實施方式
一中WJl發酵后的五味子HPLC色譜圖,其中I表不五味子醇甲，2表不五味子酯甲，3表不五味子甲素和4表不五味子乙素。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger)WJ1，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No :M2012044，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本實施方式中黑曲霉(Aspergillus niger) WJl，它在PDA固體培養基上培養，菌絲初為白色，后變成黑色厚絨狀，背面無色，菌株頂部形成球狀頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，上長有成串黑褐色球狀分生孢子，孢子直徑3. 5 y m，分生孢子頭球狀，褐黑色(如圖1、2和3所示)。本實施方式中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl，其生長溫度為28°C，生長pH值自然。本實施方式中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl,該菌株分離自健康的藥用植物北五味子植株的根莖，采自黑龍江省帽兒山地區，并經黑龍江省中醫研究院付克治研究員鑒定為木蘭科植物五味子屬Schisandra Chinensis (Turcz. ) Baill.的植株,樣本現存于黑龍江大學生命科學學院生物制藥實驗室；它按以下步驟進行分離培養(I)材料預處理選取健康北五味子的根莖用自來水沖洗干凈后以無菌濾紙吸干水分，切成0. 5cm小段，備用；(2)表面消毒于無菌超凈臺內將健康北五味子的根莖按下述方法進行表面消毒75%酒精浸泡3 次氯酸鈉浸泡15min-無菌水沖洗4次。用無菌手術刀將樣品從中間切開，分別置于馬鈴薯固體分離培養基和馬鈴薯液體分離培養基中，28°C恒溫培養箱和搖床中培養，待其邊緣及頂端長出菌絲后，及時挑取菌落轉移到相應的培養基中；(3)陰性對照取最后一次沖洗北五味子的無菌水涂布培養平板(馬鈴薯固體分離培養基)或取適量此沖洗液倒入馬鈴薯液體分離培養基內作對照，另將消毒后的實驗材料在平板(馬鈴薯固體分離培養基)上滾動一周作對照，于相同的條件下培養；(4)菌體培養將消毒后的實驗材料分別置于馬鈴薯固體分離培養基和馬鈴薯液體分離培養基中，于28°C培養箱中培養3-7d，待實驗材料周圍長出菌體，挑取菌體轉入平板(馬鈴薯固體分離培養基)上多次劃線分離純化，將純化后的菌株于斜面固體培養基上培養，4 °C保存備用。馬鈴薯液體分離培養基馬鈴薯培養基(PDA):每L由200g的馬鈴薯、20g的蔗糖和余量的水組成，pH自然，121°C高壓滅菌30min ;其中馬鈴薯去皮，切成小塊煮沸30min，用6層紗布過濾。馬鈴薯固體分離培養基馬鈴薯培養基(PDA):每L由200g的馬鈴薯、20g的蔗糖，16g的瓊脂粉和余量的水組成，pH自然，121°C高壓滅菌30min ;其中馬鈴薯去皮，切成小塊煮沸30min，用6層紗布過濾。斜面固體培養基取5mL馬鈴薯固體培養基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。試驗用主要儀器設備和試劑見表I ;表I
權利要求
1.一株發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌，其特征在于它為黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,已在中國典型培養物保藏中心保藏,保藏編號為CCTCC No:M2012044，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。
全文摘要
一株發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌，它涉及一株內生真菌。發酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的內生真菌，它為黑曲霉(Aspergillus niger)WJ1，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NoM2012044，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本發明黑曲霉(Aspergillus niger)WJ1能使北五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等主要活性成分顯著提高，因此在以獲得五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素為目的的原料生產中可以選擇五味子內生真菌WJ1發酵五味子以提高得率，節省藥源。
文檔編號C12N1/14GK102628018SQ20121012623
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者劉玉潔, 鄭春英, 陸欣媛 申請人:黑龍江大學