專利名稱：一株通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株內生真菌。
背景技術：
甘草為豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza Linn)屬烏拉爾甘草(G. uralensis Fisch)，脹果甘草(G. inflate Bat)和光果甘草(G. glabra L)的干燥根和根莖，廣泛分布于我國東北、西北及華北等地。甘草性味甘平，為補氣類中藥，具有補中 益氣、清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、調和藥性等功效。中醫處方離不開甘草，自古至今，廣為藥用，兼有“國老”的尊號。近年來，野生甘草因過度采挖強度而瀕臨滅絕，甘草已被列入《野生藥材資源保護條例》的國家二級保護植物。甘草的主要成分為甘草次酸，具有防癌、抑癌的作用，是醫藥、化妝品、食品的生產原料。甘草次酸的來源主要有兩個途徑一是化學合成，二是從甘草中提取。上述兩種途徑均需要利用甘草資源，因此如何高效利用甘草資源是人們的研究熱點。
發明內容
本發明提供了一株通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌。本發明通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為產黃青霉(Penicilliumchrysogenum) RElI,已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M2012047,保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日；它在PDA固體培養基上培養7d后，菌落直徑為6 8cm，菌落為綠色，基質為黃色，菌絲較密集，菌落邊緣整齊，緊貼培養基，產分生孢子，分生孢子頭呈圓柱狀，分生孢子單生，單細胞。本發明通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為產黃青霉(Penicilliumchrysogenum) RE 11,其ITS序列提交至NCBI網頁，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過MEGA5. 03軟件構建系統進化樹，REll菌株的ITS序列與青霉屬菌(Penicillium chrysogenum,編號GQ161752. I)菌株的相似性都達到了 99%以上，結合形態學觀察結果，確定內生真菌REll為產黃青霉(Penicillium chrysogenum)。本發明通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為產黃青霉(Penicilliumchrysogenum) RElI,已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M2012047,保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本發明利用微生物制藥手段提取分離甘草健康植株的內生真菌RE11，以其發酵甘草，以HPLC法為分析手段測定經甘草內生真菌REll發酵甘草后甘草次酸的含量，結果甘草發酵后甘草次酸含量顯著高于生藥。將獲得的內生真菌REll菌株通過形態學觀察和ISSrDNA序列分析鑒定其種屬。本發明通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)RE11，能夠以甘草為底物對其進行發酵可使甘草中的甘草次酸含量顯著升高；甘草次酸是經典的抗炎藥物目前在醫藥化妝品等領域中廣泛應用，還具有防癌和抗癌作用；本發明對采用甘草內生真菌REll發酵甘草生產甘草次酸具有指導意義。
圖I為具體實施方式
一中產黃青霉(Penicillium chrysogenum)REll的孢子顯微結構圖；圖2為具體實施方式
一中產黃青霉(Penicillium chrysogenum) RElI的PCR擴增的電泳圖，其中M泳道表示Marker, I泳道表示REll ;圖3為具體實施方式
一中產黃青霉(Penicillium chrysogenum) REll的系統進化樹圖； 圖4為具體實施方式
一中甘草次酸對照品的HPLC色譜圖，其中I表示甘草次酸；圖5為具體實施方式
一中甘草的HPLC色譜圖，其中I表示甘草次酸；圖6為具體實施方式
一中甘草加入對照品后甘草次酸的HPLC色譜圖，其中I表示加對照品后甘早次Ife ；圖7為具體實施方式
一中REll發酵甘草后甘草次酸的HPLC色譜圖，其中I表示甘草次酸。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為產黃青霉(Penicillium chrysogenum)REll，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M 2012047，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本實施方式中產黃青霉(Penicillium chrysogenum) RE 11,它在PDA固體培養基上培養7d后，菌落直徑為6 8cm，菌落為綠色，基質為黃色，菌絲較密集，菌落邊緣整齊，緊貼培養基，產分生孢子，分生孢子頭呈圓柱狀，分生孢子單生，單細胞。本實施方式中產黃青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,其生長溫度為28°C,生長pH值自然。本實施方式中通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為產黃青霉(Penicillium chrysogenum) RE 11,該菌株分離自健康的野生甘草的根莖，采自大慶地區，植株年齡3年，植株健壯，無病蟲害，其樣本現存于黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業實驗室；它按以下步驟進行分離培養選取健康的野生甘草的根莖用自來水沖洗干凈后以無菌濾紙吸干水分，切成Icm小段于無菌超凈臺內將甘草的根莖按下述方法進行表面消毒75%酒精浸泡lmin-2%次氯酸鈉浸泡15min-無菌水沖洗3次；用無菌手術刀將野生甘草的根莖從中間切開，分別置于5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養基和5%甘草提取液馬鈴薯液體分離培養基中，于28°C恒溫水浴搖床和恒溫培養箱中，培養3 5d，待實驗材料周圍長出菌體，挑取菌體轉入平板(5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養基)多次劃線分離純化，將純化后的菌株置于斜面固體培養基中，4°C保存備用；其中5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖、20g的瓊脂和余量的5%甘草提取液組成，pH值為7. O 7. 2，121°C下高壓滅菌30min ；5%甘草提取液馬鈴薯液體分離培養基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖和余量的5%甘草提取液組成，pH值為7. O 7. 2，121 °C下高壓滅菌30min ；斜面固體培養基為取5mL5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。結果從野生甘草的根莖中分離出內生真菌RE11，并且陰性對照中對照平板和對照液體培養基內均無任何菌長出，多次重復均如此，證明所分到的菌是植物內生真菌，而不是表面的附生菌。篩選出的內生真菌RElI根據《真菌分類學》、《真菌鑒定手冊》和《半知菌屬圖解》進行形態學鑒定，其菌落特征和孢 子形態與青霉屬菌特征極為相近，孢子顯微結構如圖I所示；分子鑒定內生真菌REll發酵液抽濾得菌絲體用25%乙醇漂洗2次，滅菌的去離子水沖洗2次，離心去上清液，提取總DNA后進行目的片段的PCR擴增，將含有目標條帶的PCR產物全部進行再一次的點樣，用2 %的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下用解剖刀將目的條帶切下，用DNA膠回收試劑盒回收，制備感受態大腸桿菌細胞，將PCR產物與pMD18-T載體進行連接后，連接產物加入到感受態細胞中，進行進行菌落PCR驗證；挑取單菌落進行大腸桿菌轉化子的PCR檢測，證明目的片段已成功轉化進入感受態細胞中后，將克隆陽性菌株送上海生工生物工程技術服務有限公司測序；所測定的核苷酸序列在NCBI數據庫中應用BLAST分析進行同源性比較，并根據分子生物學研究的基本原理選擇相應種屬代表菌株的18S rDNA 序列應用軟件 CLUSTALX I. 83 和 MEGA5. 03 以近鄰結合法(Neighbor-joining)構建系統發育樹，bootstrap檢驗值> 50% (1000重復)，確定目標菌株的分類地位；內生真菌REll基因組經尿素法提取后，采用PCR擴增后凝膠成像結果如圖2所示，在500bp附近得到一擴增片段(堿基序列見SEQ ID N0:1))，證明已成功從內生真菌REll菌株中提取出其基因組DNA ；根據內生真菌REll的ITS序列提交至NCBI網頁，通過Blast搜索與所得到的序列相似性高的序列，并通過MEGA5. 03軟件構建系統進化樹(見圖3)，REll菌株的ITS序列與青霉屬菌(Penicillium chrysogenum,編號GQ161752. I)菌株的相似性都達到了99%以上，結合形態學觀察結果，確定篩選出的內生真菌REll為產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。本實施方式中產黃青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,其發酵甘草提高甘草次酸含量的實驗結果如表I所示，甘草內生真菌REll發酵甘草提高甘草次酸含量的實驗結果表明，REll能夠通過發酵甘草使其中的甘草次酸含量顯著升高。表I
組別KEll發酵的甘草樣甘草生藥空白對照 PUA對照
品
甘草次酸含量 O. 516±0.0025 Λ 0.128 土 0.223 土 - (mg/g)Δ0.00110.0008注同生藥組相比*Ρ< 0.05，#Ρ <0.01 ;同陰性對照組相比Λ P < O. 05，ΛΛ P
<0.01 ；PDA對照無甘草次酸產生。
本實施方式中產黃青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,其發酵甘草提高甘草次酸含量的檢測如下取干燥甘草根，用粉碎機粉碎后過40目篩。精確稱取6g甘草粉，放入IOOmL三角瓶中，向其中加入30mL的蒸餾水，密封后，121°C高壓滅菌30min。取出，作為底物。向已活化的REll菌株試管中加入無菌水，制成I X 106CFU/mL的菌懸液，將此菌懸液5mL加入到底物中，另取甘草粉加等量的無菌水作為空白對照，將制備好的樣品于28°C，120r/min搖床培養14天。取出，凍干，即為甘草發酵樣品，備用。每個樣品做6個重復。精密稱取甘草發酵樣品lg，準確加入IOmL的色譜甲醇，稱重，超聲提取2h，取出， 放冷，以色譜甲醇補足重量，過濾，取續濾液4mL，于IOmL容量瓶中定容，待測。同時精密稱取甘草生藥Ig加入IOmL的色譜甲醇，稱重，超聲提取2h，取出，放冷，以色譜甲醇補足重量，過濾，取續濾液4mL，于IOmL容量瓶中定容，作為生藥對照待測。甘草發酵前后甘草次酸含量的測定色譜條件色譜柱VenusiLXBP-C18 柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m)；流動相甲醇-水-冰醋酸(82 17 I)；流速ImL· mirf1 ；檢測波長254nm；柱溫25°C；進樣量10μ L在色譜條件下，甘草內生真菌REll發酵甘草所制備的供試品與甘草次酸對照品相應位置的色譜峰一致，而且色譜峰經過對照品加入法得到了較好的確認，結果見圖4、5、6和7,結論內生真菌REll為產黃青霉(Penicillium chrysogenum) RE 11,其以甘草為底物進行發酵能夠使甘草中甘草次酸含量顯著升高，本實施方式對采用甘草內生真菌REll生產甘草次酸具有指導意義。
權利要求
1. 一株通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，其特征在于它為產黃青霉(Penicillium chrysogenum) RElI,已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNo M 2012047，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。
全文摘要
一株通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它涉及一株內生真菌。通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，它為產黃青霉(Penicillium chrysogenum)RE11，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NoM 2012047，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2012年2月29日。本發明中通過發酵甘草提高甘草次酸含量的內生真菌，能夠以甘草為底物對其進行發酵可使甘草中的甘草次酸含量顯著升高；甘草次酸是經典的抗炎藥物目前在醫藥化妝品等領域中廣泛應用，還具有防癌和抗癌作用；本發明對采用甘草內生真菌RE11發酵甘草生產甘草次酸具有指導意義。
文檔編號C12N1/14GK102643755SQ20121012626
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者孔德崴, 孫雅北, 白長勝, 譚佳音, 鄭春英 申請人:黑龍江大學