專利名稱：一種降血壓菜籽肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及涉及生物技術領域，具體涉及降血壓菜籽肽及其制備方法和應用。
背景技術：
我國是世界上油菜籽產量最大的國家，年產量已近1200萬噸，菜籽柏是菜籽油加エ的主要副產物，占菜籽總量的65%，其中含蛋白35% 42%。菜籽蛋白氨基酸組成合理，賴氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的含量較高，是ー種優良的植物蛋白。開發利用菜籽蛋白質資源對有效利用我國的植物蛋白資源，提高我國人民的營養水平，具有重大的社會意義和良好的經濟效益。
目前，我國約有2億高血壓患者，每年仍然新增1000萬人，開發新型降血壓藥劑和營養素，有利于解決這一日益嚴峻的社會公共問題。一方面，現有降血壓藥物長期服用會對身體造成很多的副反應，尤其是對消化道系統有很大的傷害；另外一方面，目前大多數降血壓肽研究的靶標都是血管緊張素轉移酶(ACE)，但是，長期服用降血壓藥物ACE抑制劑，會激活血管緊張素系統(RAS)的旁路途徑，從而影響高血壓的臨床治療。而腎素抑制劑可以從源頭阻斷RAS系統，具有比ACE抑制劑更多的潛在獲益、更少的不良反應和更好的耐受性，并且在大型中間終點事件的研究中顯示出具有靶器官保護的作用。但是，基于腎素抑制劑的降血壓藥物較少。

發明內容
本發明的目的在于提供ー種酶法制備具有腎素抑制活性和ACE抑制活性的降血壓菜籽肽的方法，該方法對環境友好，反應條件溫和，能充分發揮蛋白酶對菜籽蛋水解作用，是ー種低成本、適合エ業化大批量制備菜籽降血壓肽的方法。本發明的另一目的在于提供降血壓菜籽肽，不僅能夠抑制血管緊張素轉移酶(ACE)，而且能夠抑制腎素，可以阻斷由于長期服用降血壓藥物ACE抑制劑激活的血管緊張素系統(RAS)的旁路途徑。本發明的另一目的在于提供降血壓菜籽肽在制備治療降血壓藥物方面的應用。本發明提供一種制備降血壓菜籽肽的方法，包括如下步驟
(O以粉碎后的菜籽柏為原料，將所述原料與水混合，調節PH值至6. 5 9，溫度35°C 50で，攪拌分散O. 5 2 h，獲得菜籽蛋白水溶液；
(2)向步驟(I)所述菜籽蛋白水溶液中，加入蛋白酶，在35°C 50で下水解I 4h,滅活其中的蛋白酶，離心取上清液，得降血壓菜籽肽粗提液；
(3)將步驟(2)所述降血壓菜籽肽粗提液精制后獲得降血壓菜籽肽。步驟(I)所述菜籽柏的原料是普通油菜籽或雙低油菜籽，粉碎后的菜籽柏的粒徑為 10 200 μ m。步驟(I)所述菜籽蛋白水溶液的原料是從菜子柏中分離的蛋白質。步驟(2)所述蛋白酶為蛋白酶K、嗜熱菌蛋白酶、復合蛋白酶或木瓜蛋白酶，優先蛋白酶K。步驟⑵所述加入的蛋白酶與菜籽蛋白水溶液中蛋白質的質量比為I 10:100。步驟(3)所述精制方法為降血壓菜籽肽粗提液經截留分子量為3kDa的超濾膜超濾，取透過液透析脫鹽，冷凍干燥得降血壓菜籽肽。步驟(3)所述精制方法也可以為將降血壓菜籽肽粗提液經反相高效液相色譜分離，分別取有機溶劑體積濃度為10°/Γ15%，359Γ40%和55%飛0%的三部分洗脫液，將所述三部分洗脫液分別冷凍干燥，即得降血壓菜籽肽；所述反相高效液相色譜分離的條件為色譜柱為碳12或碳18硅膠柱；流動相為水和有機溶劑，所述有機溶劑為甲醇或こ腈，所述水和有機溶劑中均含有質量濃度為O. 05 O. 10%三氟こ酸；洗脫條件為線性洗脫，流動相中的有機溶劑體積濃度從5%變化到80%。本發明還提供采用上述方法制備的降血壓菜籽肽。本發明還提供采用所述降血壓菜籽肽在制備降血壓藥物方面的應用。本發明的有益效果
(I)本發明制備降血壓菜籽肽方法與現有的技術相比，直接以菜籽柏或者菜籽分離蛋白質為原料，通過酶法水解，獲得降血壓菜籽肽，原料來源廣泛，生產エ藝簡單、成本低，而且變廢為寶，有利于環境保護。(2)采用兩種精制方法獲得的降血壓菜籽肽，不僅能夠抑制血管緊張素轉移酶(ACE)，而且能夠抑制腎素，可以阻斷由于長期服用降血壓藥物ACE抑制劑激活的血管緊張素系統(RAS)的旁路途徑，在降血壓方面有很大的開發前景。(3)本發明降血壓菜籽肽源于天然動、植物及微生物的降血壓肽，除了具有降血壓功能外，還有抗氧化、免疫促進、抗凝血、易消化吸收、對靶細胞無毒害作用等功能，是為降血壓藥物和營養素的首選原料。
具體實施例方式本發明中使用的蛋白酶K (Proteinase K)購于Fisher公司，貨號39450-01-6 ;嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)購于sigma公司，貨號232_973_4 ,產品編號P1512 ;復合蛋白酶(Protamex)購于sigma,產品編號P0029 ;木瓜蛋白酶(Papain)購于sigma ,貨號是232-627-2，產品編號 P4762。實施例I采用蛋白酶K制備降血壓菜籽肽
(I)將菜籽柏粉碎，通過100目篩，制成粉碎后的菜子柏。以粉碎后的菜籽柏為原料，將所述原料按固液比1:20，將與水混合，調節pH值至7. 5，溫度37 V，攪拌分散Ih，獲得菜籽蛋白水溶液。所述菜籽柏的原料是普通油菜籽或雙低油菜籽，粉碎后的菜籽柏的粒徑為10 200 μ m。所述菜籽蛋白水溶液的原料還可以為從菜子柏中分離的蛋白質。(2)按蛋白酶與菜籽蛋白水溶液中蛋白質的質量比為5:100，向步驟(I)所述菜籽蛋白水溶液中，加入蛋白酶K，控制溫度和pH值不變，水解I 3 h。反應結束后，將水解液 加熱至90 100で，保持10 min，滅活其中的蛋白酶K，冷卻至室溫，10000 g離心カ離心I h取上清液，得降血壓菜籽肽粗提液。(3)將降血壓菜籽肽粗提液經反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離，洗脫時，分別取有機溶劑體積濃度為10°/Γ15%，359Γ40%和55% 60%的三部分洗脫液，將所述三部分洗脫液分別冷凍干燥，即得降血壓菜籽肽；所述反相高效液相色譜分離的條件為色譜柱為碳12或碳18硅膠柱；流動相為水和有機溶劑，所述有機溶劑為甲醇或こ腈，所述水和有機溶劑中均含有質量濃度為O. 05 O. 10% TFA (三氟こ酸)；洗脫條件為線性洗脫，流動相中的有機溶劑體積濃度從5%變化到80%。反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離時，采用紫外檢測器(檢測波長215 nm)。其中，組分2 (洗脫時，有機溶劑體劑濃度為35°/Γ40%) ACE抑制活性達到91. 81%，腎素抑制活性達到49. 40% ;組分5(洗脫時，有機該溶劑體劑濃度為45% 50%) ACE抑制活性達到87. 89%，腎素抑制活性達到54. 97% ;組分9 (洗脫時，有機溶劑體劑濃度為559T60%)ACE抑制活性達到86. 89%，腎素抑制活性達到58. 19%。可以看出采用該方法分離到的組分2、5和9均具有 很高的ACE抑制活性和腎素抑制活性，在降血壓方面有著很好的應用前景。ACE抑制活性檢測方法如下在比色杯中加入I mL 0.5 mM FAPGG ( FAPGG全稱N-[3-(2-Furyl)acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl_glycine,溶解在含 O. 3 M NaCl 濃度為 50 mM 的 Tris-HCl 緩沖液，pH 7.5) ,20 μ L ACE (lU/mL,最終活力 20 mU)，200μ L降血壓菜籽肽溶液(蛋白濃度為lmg/mL，溶劑為50 mM Tris-HCl緩沖液，含0.3 MNaCl, pH 7. 5)，混勻室溫下，2 min內測定345 nm下吸光值的降低速率·空白以Tris-HCl緩沖液代替樣品.根據以下公式計算ACE抑制活性
ACE 抑制活性(％)=1-[ AA.mirT1(樣品)/ Λ A. mirT1(空白)]X 100%，
，其中，ΛΑ. HiirT1ws)和ΛΑ. HiirT1isw)分別是表示樣品和空白的ACE活性抑制速率。腎素抑制活性的檢測方法如下降血壓菜籽肽抑制血管緊張素活性的體外測定根據腎素活性試劑盒(購買于Cayman Chemical，編號10006270)提供方法，按以下步驟測定96-孔板中依次加入(I)空白20 μ L底物，160 μ L測試用緩沖液，10 μ L純水；
(2)空白對照20 UL底物，150 UL測試用緩沖液，和10 μ L純水；(3)樣品20 μ L底物，150 UL測試用緩沖液，和10 μ L樣品。之后分別在每個孔(除空白外)中加入10 UL腎素啟動反應。96-孔板室溫下震蕩10 S，在37 °C下預熱15 min，在IOmin內測定樣品的熒光強度，激發波長340nm，發射波長490nm，根據以下公式計算樣品的腎素抑制活性
權利要求
1.一種制備降血壓菜籽肽的方法，包括如下步驟 (O以粉碎后的菜籽柏為原料，將所述原料與水混合，調節PH值至6. 5 9，溫度35°C 50で，攪拌分散O. 5 2 h，獲得菜籽蛋白水溶液； (2)向步驟(I)所述菜籽蛋白水溶液中，加入蛋白酶，在35°C 50で下水解I 4h,滅活其中的蛋白酶，離心取上清液，得降血壓菜籽肽粗提液； (3)將步驟(2)所述降血壓菜籽肽粗提液精制后獲得降血壓菜籽肽。
2.根據權利要求I所述制備降血壓菜籽肽的方法，其特征在于步驟(I)所述菜籽柏的原料是普通油菜籽或雙低油菜籽，粉碎后的菜籽柏的粒徑為10 200 μ m。
3.根據權利要求2所述制備降血壓菜籽活性肽的方法，其特征在于步驟(I)所述菜籽蛋白水溶液的原料是從菜子柏中分離的蛋白質。
4.根據權利要求2所述制備降血壓菜籽肽方法，其特征在于步驟(2)所述蛋白酶為蛋白酶K、嗜熱菌蛋白酶、復合蛋白酶或木瓜蛋白酶。
5.根據權利要求4所述制備降血壓菜籽肽方法，其特征在于步驟(2)所述蛋白酶為蛋白酶K。
6.根據權利要求4或5所述制備降血壓菜籽肽的方法，其特征在于步驟(2)所述加入的蛋白酶與菜籽蛋白水溶液中蛋白質的質量比為I 10:100。
7.根據權利要求6所述制備降血壓菜籽肽方法，其特征在于步驟(3)所述精制方法為降血壓菜籽肽粗提液經截留分子量為3kDa的超濾膜超濾，取透過液透析脫鹽，冷凍干燥得降血壓菜籽肽。
8.根據權利要求6所述制備降血壓菜籽肽的方法，其特征在于步驟(3)所述精制方法為將降血壓菜籽肽粗提液經反相高效液相色譜分離，分別取有機溶劑體積濃度為10% 15%，35% 40%和55% 60%的三部分洗脫液，將所述三部分洗脫液分別冷凍干燥，即得降血壓菜籽肽；所述反相高效液相色譜分離的條件為色譜柱為碳12或碳18硅膠柱；流動相為水和有機溶剤，所述有機溶劑為甲醇或こ腈，所述水和有機溶劑中均含有質量濃度為O.05 O. 10%三氟こ酸；洗脫條件為線性洗脫，流動相中的有機溶劑體積濃度從5%變化到 80%ο
9.ー種采用權利要求8之一方法制備的降血壓菜籽肽。
10.一種權利要求9所述降血壓菜籽肽在制備降血壓藥物方面的應用。
全文摘要
本發明提供一種降血壓菜籽肽及其制備方法和應用。所述制備降血壓菜籽肽的方法采用蛋白酶水解菜籽蛋白水溶液，然后精制獲得降血壓菜籽肽。本發明制備降血壓菜籽肽方法與現有的技術相比，直接以菜籽粕或者菜籽分離蛋白質為原料，通過酶法水解，獲得降血壓菜子肽，原料來源廣泛，生產工藝簡單、成本低，而且變廢為寶，有利于環境保護。該降血壓菜籽肽，不僅能夠抑制(血管緊張素轉化酶)ACE活性，而且能夠抑制腎素活性，可以阻斷由于長期服用降血壓藥物ACE抑制劑激活的血管緊張素系統(RAS)的旁路途徑，在降血壓方面有很大的開發前景。
文檔編號C12P21/06GK102676621SQ20121013008
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者何榮, 周建新, 王立峰, 王雪峰, 石嘉懌, 袁建, 都立輝, 陳銀基, 鞠興榮, 高瑀瓏 申請人:南京財經大學