專利名稱：一種發酵生產沙利霉素工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及沙利霉素的發酵工藝優化方法，特別是涉及一種菌體生長期補糖菌體產素期補油發酵生產沙利霉素工藝。
背景技術：
沙利霉素是一種聚醚類一元羧酸抗生素，具有特殊的環狀結構，是典型的離子載體抗生素。沙利霉素是由白色鏈霉菌(Streptomysis albus)產生的聚醚類離子載體型動物專用抗生素，由于其廣譜高效的抗球蟲病性能而得到廣大飼養者的認可。目前沙利霉素的生產主要通過生物發酵的方法進行，主要以豆油作為其主要的發酵碳源，例如中國專利CN1230596A公開的，但是隨著近年來油的價格持續上升，沙利霉素的發酵成本相應有了很大的提高；并且由于油的自身特性，發酵基質中過多油的積累會造成發酵體系溶氧的降低，同時其還會附著于菌絲體表面，不利于菌體代謝，甚至還會出現發酵液結塊的現象，對后期處理造成困難。2005年8月《山東大學學報(理學版)》第40卷第4期“鹽霉素發酵補油工藝研究”中公開了一種菌體產素期補油的工藝，該文獻雖然優化了補油工藝，即減少初始發酵培養基中的豆油含量，并在發酵過程中以豆油、脂肪酸含量分數和豆油消耗速率為指標進行補油，但是若不能使菌體代謝活力維持在一個較高的水平，依然會造成菌體對油的利用率不高，從而導致發酵水平的低下。因此，如何在菌體生長期增強菌體的代謝活力是提高發酵產量的關鍵因素。

發明內容
針對現有技術中存在的問題，本發明提供一種發酵生產沙利霉素工藝，菌體生長期補糖菌體產素期補油，可使沙利霉素效價提高的同時降低生產成本。一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于包括以下工藝步驟
發酵培養將經斜面培養和種子培養所得種子液接種至裝有培養基的發酵罐，接種量8-12%,培養溫度 30-35 0C，壓力 O. 04-0. 06MPa, DO 控制在 30%-100%,轉速 250-500rpm ;發酵進行30-50小時開始補加糖，控制發酵液中還原糖含量為3-10g/l ;發酵進行到80-120小時，開始補加植物油，控制發酵液中脂肪酸含量為l_5wt% ;發酵進行290-310h放罐。本發明所述的菌體產素期是在發酵的次級代謝中產生沙利霉素的時間段。當發酵進行到30-50小時，培養基中的還原糖含量降低，不利于菌體的生長，本發明采用在此時間段內補加糖來促進菌體的進一步生長，根據糖濃度控制補糖速率，糖濃度控制在3-10g/l。80-120小時，菌體進入次級代謝，需補加植物油來提高發酵效價，本發明在此時間段內開始采用連續流加方式補油，根據脂肪酸含量控制補油速率，脂肪酸濃度控制在 l-5wt%。、
作為優選，所述的斜面培養是將菌株接種到斜面培養基上，26-30°C下培養6-8天。作為優選，所述斜面培養基的組成是可溶性淀粉1-3 wt%,硫酸鎂O. 02-0. 08wt%，氯化鈉 O. 02-0. 08 wt%，牛肉膏 O. 05-0. 2 wt%，硝酸鉀 O. 05-0. 2 wt%，磷酸氫二鉀O. 02-0. 08 wt%，亞硫酸鐵O. 0005-0. 0015 wt%，瓊脂l_3wt%，余量的蒸餾水；所述斜面培養基的pH值為6. 5-7. 5。
作為優選，所述的種子培養是將經斜面培養所得孢子接入種子培養基，在30-35°C>220-260 r/min 的條件下培養 25_30h。作為優選，種子培養基的組成是葡萄糖2-8 wt%，黃豆粉2-4 wt%，酵母粉O. 5-2wt%,輕質碳酸I丐O. 1-0. 4 wt%,余量的蒸懼水。作為優選，發酵罐中培養基的組成是蔗糖2-6 wt%，棕櫚油2_8wt%，氯化鉀O. 1-0. 4wt%，氯化鈉 O. 05-0. 2 wt%，豆柏粉 O. 1-0. 8 wt%，胚芽粉 O. 2_lwt%，磷酸氫二鉀O. 01-0. 02wt%，硫酸鎂 O. 005-0. 02 wt%，乳化劑 O. 02-0. 08wt%，硫酸銨 0.1_lwt%，輕質碳酸鈣O. 1-0. 5 wt%，余量的蒸餾水；所述發酵液的pH值為6. 5-7. O。作為優選，所述糖為蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉的一種或多種。作為優選，所述植物油為棕櫚油、豆油、菜籽油的一種或多種。作為優選，所述補糖方式為連續流加，根據還原糖濃度控制補糖速率，還原糖濃度控制在3-10g/l。作為優選，所述補油方式為連續流加，根據脂肪酸含量控制補油速率，脂肪酸濃度控制在2-4wt%0作為優選，本發明在發酵進行到38-42小時，開始補加糖。作為優選，本發明在發酵進行到90-110小時，開始補加植物油。本發明解決了由于前期油含量較高對菌體的影響，在增強菌體代謝活力的基礎上，使初級代謝到次級代謝的轉換更加順暢，從而使發酵效價有較大的提高，同時提高了油的利用率，降低了生產過程中油的消耗，解決了發酵基質中過多油的積累造成發酵體系溶氧的降低，以及發酵液結塊的技術問題，本發明的技術成熟，適合工業規模化生產。
具體實施例方式本發明中種子罐及發酵罐由上海國強生化工程裝備有限公司生產，本發明中DO為溶解氧，還原糖糖濃度的測定使用DNS法，脂肪酸含量的測定使用酸解比色法。本實施例采用的沙利霉素生產菌種為白色鏈霉菌(Streptomyces albus)。培養基成分I :
配制斜面培養基(wt%):可溶性淀粉1，硫酸鎂O. 08，氯化鈉O. 02，牛肉膏O. 2，硝酸鉀O. 05，磷酸氫二鉀O. 08，硫酸亞鐵O. 0005，瓊脂3，pH 6.5，余量為蒸餾水；并進行滅菌
O配制種子培養基(wt%):葡萄糖2，黃豆粉4，酵母粉O. 5，輕質碳酸鈣O. 4，余量為蒸餾水；
配制發酵培養基(wt%):蔗糖2，棕櫚油8，氯化鉀0.1，氯化鈉O. 2，豆柏粉0.1，胚芽粉1，磷酸氫二鉀O. 01，硫酸鎂O. 02，乳化劑O. 02，硫酸銨1，輕質碳酸鈣0.1，pH 7.0，余量為蒸餾水；并進行滅菌。培養基成分2
斜面培養基(wt%):可溶性淀粉3，硫酸鎂O. 02，氯化鈉O. 08，牛肉膏O. 05，硝酸鉀0.2，磷酸氫二鉀O. 02，硫酸亞鐵O. 0015，瓊脂1，余量的蒸餾水；所述斜面培養基的pH值為7.5。種子培養基(wt%):葡萄糖8，黃豆粉2，酵母粉2，輕質碳酸鈣0.1，余量為蒸餾水。發酵罐的培養基(wt%):蔗糖6，棕櫚油2，氯化鉀O. 4，氯化鈉O. 05，豆柏粉O. 8，胚芽粉O. 2，磷酸氫二鉀O. 02，硫酸鎂O. 005，乳化劑O. 08，硫酸銨O. I，輕質碳酸鈣O. 5，余量為蒸餾水；所述發酵液的PH值為6. 5。 培養基成分3
斜面培養基(wt%):可溶性淀粉2，硫酸鎂O. 06，氯化鈉O. 04，牛肉膏O. 1，硝酸鉀0.1，磷酸氫二鉀O. 05，硫酸亞鐵O. 001，瓊脂2，余量為蒸餾水；所述斜面培養基的pH值為 7. O。種子培養基(wt%):葡萄糖5，黃豆粉3，酵母粉1，輕質碳酸鈣O. 3，余量為蒸餾水。發酵罐的培養基(wt%):蔗糖3，棕櫚油5，氯化鉀O. 3，氯化鈉O. 15，豆柏粉O. 5，胚芽粉O. 8，磷酸氫二鉀O. 015，硫酸鎂O. 01，乳化劑O. 05，硫酸銨O. 5，輕質碳酸鈣O. 3，余量為蒸餾水；所述發酵液的pH值為6. 8。
實施例I :
使用培養基成分I
(1)斜面培養將白色鏈霉菌菌株接種到新鮮斜面上，26°C下培養8天；
(2)種子培養將步驟(I)所得孢子接入種子培養基，在30°C、260r/min的條件下培養
30h ；
(3)發酵培養將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(15L罐，滅菌后大概8升發酵培養基)，接種量8%，培養溫度30-35°C，壓力O. 05MPa，D0控制在30-40%，轉速400-500rpm，發酵進行到30小時，開始以8-12ml/H連續流加質量百分含量為20%的蔗糖水溶液，控制發酵液中還原糖含量為3g/l，發酵進行到90小時，開始以3-5ml/H連續流加棕櫚油，控制發酵液中脂肪酸含量為2wt%，發酵290小時放罐。
實施例2
使用培養基成分2
(1)斜面培養將白色鏈霉菌菌株接種到新鮮斜面上，30°C下培養6天；
(2)種子培養將步驟(I)所得孢子接入種子培養基，在35°C、220r/min的條件下培養
28h ；
(3)發酵培養將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(30L罐，滅菌后大概16升發酵培養基)，接種量12%，培養溫度30-35°C，壓力O. 06MPa, DO控制在80_100%，轉速250_300rpm，發酵進行到42小時，開始以18-22ml/H連續流加質量百分含量為20%的葡萄糖水溶液，控制發酵液中還原糖含量為10g/l，發酵進行到110小時，開始以8-12ml/H連續流加豆油，控制發酵液中脂肪酸含量為5wt%，發酵300小時放罐。
實施例3
使用培養基成分3
(1)斜面培養將白色鏈霉菌菌株接種到新鮮斜面上，28°C下培養7 天；
(2)種子培養將步驟(I)所得孢子接入種子培養基，在32°C、240r/min的條件下培養
26h ；
(3)發酵培養將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(50L罐，滅菌后大概24升發酵培養基)，接種量10%，培養溫度30-35°C，壓力O. 04MPa, DO控制在60_80%，轉速300_400rpm，發酵進行到40小時，開始以18-22ml/H連續流加質量百分含量為15%的可溶性淀粉溶液，控制發酵液中還原糖含量為6g/l，發酵進行到100小時，開始以4-6mL/H連續流加菜籽油，控制發酵液中脂肪酸含量為lwt%，發酵310小時放罐。
實施例4
使用培養基成分I
(1)斜面培養將白色鏈霉菌菌株接種到新鮮斜面上，26°C下培養8天；
(2)種子培養將步驟(I)所得孢子接入種子培養基，在30°C、260r/min的條件下培養
30h ；
(3)發酵培養將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(15L罐，滅菌后大概8升發酵培養基)，接種量8%，培養溫度30-35 °C，壓力O. 04MPa, DO控制在30_50%，轉速400-500rpm，發酵進行到38小時，開始分別以4-6mL/H流加方式補加質量百分含量為20%的可溶性淀粉水溶液和質量百分含量為20%的蔗糖水溶液，控制發酵液中還原糖含量為3g/l，發酵進行到80小時，分別以3-5mL/H流加方式補加棕櫚油和豆油，控制發酵液中脂肪酸含量為2wt%，發酵290小時放罐。
實施例5
使用培養基成分2
(1)斜面培養將白色鏈霉菌菌株接種到新鮮斜面上，30°C下培養6天；
(2)種子培養將步驟(I)所得孢子接入種子培養基，在35°C、220r/min的條件下培養
25h ；
(3)發酵培養將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(30L罐，滅菌后大概16升發酵培養基)，接種量12%，培養溫度30-35°C，壓力0.05MPa，DO控制在40_60%，轉速350_450rpm，發酵進行到50小時，開始分別以8-12mL/H流加方式補加質量百分含量為20%的可溶性淀粉水溶液和質量百分含量為20%的蔗糖水溶液，控制發酵液中還原糖含量為8g/l，發酵進行到120小時，分別以6-10mL/H流加方式補加菜籽油和豆油，控制發酵液中脂肪酸含量為4wt%,發酵300小時放罐。實施例6
使用培養基成分3
(1)斜面培養將白色鏈霉菌菌株接種到新鮮斜面上，28°C下培養7天；
(2)種子培養將步驟(I)所得孢子接入種子培養基，在32°C、240r/min的條件下培養
28h ；
(3)發酵培養將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(30L罐，滅菌后大概24升發酵培養基)，接種量10%，培養溫度30-35°C，壓力0.06MPa，DO控制在50_70%，轉速250_350rpm，發酵進行到40小時，開始分別以4-6ml/H連續流加質量百分含量為15%的可溶性淀粉水溶液、質量百分含量為20%的葡萄糖水溶液和質量百分含量15%的為蔗糖水溶液，控制發酵液中還原糖含量為6g/l，發酵進行到90小時，開始以8-12mL/H連續流加菜籽油、豆油和棕櫚 油，控制發酵液中脂肪酸含量為3wt%，發酵310小時放罐。
對比實施例I
同實施例1，不同的是發酵培養時只補糖不補油，具體是將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(15L罐，滅菌后大概8升發酵培養基)，接種量8%，培養溫度30-35°C，壓力O. 05MPa，DO控制在30-40%，轉速400_500rpm，發酵進行到38小時，開始以8_12ml/H連續流加質量百分含量為20%的蔗糖水溶液，控制發酵液中還原糖含量為3g/l，發酵290小時放罐。
對比實施例2
同實施例2，不同的是發酵培養時只補油不補糖，具體是將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(30L罐，滅菌后大概16升發酵培養基)，接種量12%，培養溫度30-35°C，壓力O. 06MPa，D0控制在80-100%，轉速250_300rpm，發酵進行到42小時，開始以6-lOml/H連續流加豆油，控制發酵液中脂肪酸含量為4wt%，發酵300小時放罐。
對比實施例3
同實施例3，不同的是發酵培養時先補油后補糖，具體是將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(50L罐，滅菌后大概24升發酵培養基)，接種量10%，培養溫度30-35°C，壓力O. 04MPa，DO控制在60-80%，轉速300_400rpm，發酵進行到40小時，開始以8_12mL/H連續流加菜籽油，控制發酵液中脂肪酸含量為3wt%，發酵進行到100小時，開始以16-20ml/H連續流加質量百分含量為8%的可溶性淀粉溶液，控制發酵液中還原糖含量為6g/l，發酵310小時放罐。
對比實施例4
同實施例4，不同的是發酵培養時發酵液中糖含量為lg/1。
對比實施例5
同實施例4，不同的是發酵培養時發酵液中脂肪酸含量為6wt%。對比實施例6
同實施例6，不同的是發酵培養時只補糖不補油，具體是將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(15L罐，滅菌后大概8升發酵培養基)，接種量8%，培養溫度30-35°C，壓力O. 05MPa，DO控制在30-40%，轉速400_500rpm，發酵進行到100小時，開始以4_6ml/H連續流加質量百分含量為20%的蔗糖水溶液，控制發酵液中還原糖含量為3g/l，發酵290小時放罐。
對比實施例7
同實施例6，不同的是發酵培養時只補糖不補油，具體是將步驟(2)所得種子液接種至發酵罐(30L罐，滅菌后大概16升發酵培養基)，接種量12%，培養溫度30-35°C，壓力
O.06MPa, DO控制在80-100%，轉速250_300rpm，發酵進行到100小時，開始以8_12ml/H連續流加豆油，控制發酵液中脂肪酸含量為4wt%，發酵300小時放罐。結果見下表。表I
^賴咸茶m的利_.率效價(u/ i)丨實麄《與34丨實鹿例_對
(元/公斤) (%)比例成幕比比例效&比
____較( )較(W
I 38.5 I 82 I 70125 | -26,82124.4
對比實 IIWl 52.660S31256
實廳例 2__ST1S__86 __72531-8.965. SI
對 fctl 施側 2 41.376%SST39
實_ 3__36^2__90%__75425-16.9818.73
對比實施W 3 43.672%63527
實IfcW 4__37.088 __73423-13.5512.21
對比 實施 ffiU 42.875%85432
實MlW 537.786%72351-27,.222T, 53
ΕΙΕΙΤ 5 1 5jL 8 I 7T% IjII
實Il例 g38.6__83%_ 70138-24. 76BI, 32
對比3 施We 51.365%36754
‘批實SI 例 7 41.2m68 3 2
由以上實施例和對比實施例可以看出，本發明實施例通過菌體生長期補糖菌體產素期補油發酵生產沙利霉素工藝，與僅在菌體生長期補糖(對比實施例I)、僅在菌體生長期補油(對比實施例2)、菌體生長期補油菌體產素期補糖(對比實施例3)、僅在菌體產素期補糖(對比實施例6)、僅在菌體產素期補油(對比實施例7)相比，本發明工藝不僅可以使效價增加，同時可以使原料成本大為降低，所得沙利霉素產品質量穩定可靠，本發明提供的補糖工藝適合大規模工業化生產。
本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其并不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書后可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的權利要求范圍內都受到專利法的保 護。
權利要求
1.一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于包括以下工藝步驟 發酵培養將經斜面培養和種子培養所得種子液接種至裝有培養基的發酵罐，接種量8-12%,培養溫度 30-35 0C，壓力 O. 04-0. 06MPa, DO 控制在 30%-100%,轉速 250-500rpm ;發酵進行30-50小時開始補加糖，控制發酵液中還原糖含量為3-10g/l ;發酵進行到80-120小時，開始補加植物油，控制發酵液中脂肪酸含量為1_5被％;發酵進行290-310h放罐。
2.根據權利要求I所述的一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于所述的斜面培養是將菌株接種到斜面培養基上，26-30°C下培養6-8天。
3.根據權利要求2所述的一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于斜面培養基的組成是可溶性淀粉1-3 wt%，硫酸鎂O. 02-0. 08 wt%，氯化鈉O. 02-0. 08 wt%，牛肉膏O. 05-0. 2 wt%,硝酸鉀O. 05-0. 2 wt%,磷酸氫二鉀O. 02-0. 08 wt%,亞硫酸鐵O. 0005-0. 0015 wt%，瓊脂l_3wt%，余量的蒸餾水；所述斜面培養基的pH值為6. 5-7. 5。
4.根據權利要求I所述的一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于所述的種子培養是將經斜面培養所得孢子接入種子培養基，在30-35°C、220-260 r/min的條件下培養25-30h。
5.根據權利要求4所述的一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于種子培養基的組成是葡萄糖2-8 wt%,黃豆粉2-4 wt%,酵母粉O. 5-2wt%,輕質碳酸I丐O. 1-0.4 wt%,余量的蒸餾水。
6.根據權利要求I所述的一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于發酵罐中培養基的組成是鹿糖2-6 wt%,棕櫚油2-8wt%,氯化鉀O. 1-0. 4wt%,氯化鈉O. 05-0. 2 wt%,豆柏粉O. 1-0. 8 wt%，胚芽粉 O. 2-lwt%，磷酸氫二鉀 O. 01-0. 02wt%，硫酸鎂 O. 005-0. 02 wt%，乳化劑O. 02-0. 08wt%,硫酸銨O. l-lwt%,輕質碳酸I丐O. 1-0. 5 wt%,余量的蒸懼水；所述發酵液的PH值為6. 5-7.0。
7.根據權利要求I所述的一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于所述補加的糖為蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉的一種或多種。
8.根據權利要求I所述的一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于所述植物油為棕櫚油、豆油、菜籽油的一種或多種。
9.根據權利要求I或7所述的一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于補糖方式為連續流加，根據還原糖濃度控制補糖速率，還原糖濃度控制在3-10g/l。
10.根據權利要求I或8所述的一種發酵生產沙利霉素工藝，其特征在于補油方式為連續流加，根據脂肪酸含量控制補油速率，脂肪酸濃度控制在2-4wt%。
全文摘要
本發明公開了發酵生產沙利霉素工藝，當發酵進行到30-50小時，開始補加糖，發酵進行到80-120小時，開始補加植物油，發酵290-310小時放罐。本發明解決了由于菌體生長期油含量較高對菌體的影響，使初級代謝到次級代謝的轉換更加順暢，從而使發酵單位有較大的提高，同時提高了油的利用率，降低了生產過程中油的消耗，解決了發酵基質中過多油的積累造成發酵體系溶氧的降低，以及發酵液結塊的技術問題，本發明的技術成熟，適合工業規?；a。
文檔編號C12P17/18GK102643880SQ201210129748
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者儲消和, 沈建, 蔡群芳, 陳中兵, 高圣君, 黃會鴿, 黃海濤 申請人:內蒙古拜克生物有限公司, 浙江升華拜克生物股份有限公司