專利名稱：對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因、其克隆方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因、其克隆方法及其應用。
背景技術：
玉米(Zea mays)是世界上種植面積最大并且產量最大的禾本科作物之一，大多用于動物飼料，食物以及エ業原料，在エ農業中均有著廣泛的應用。玉米對于現代社會的發展起到了重要作用。但是，由于玉米蛋白質中必需氨基酸含量不完整，尤其是胚乳中含量最高的a醇溶蛋白(22kD醇溶蛋白和19kD醇溶蛋白)的賴氨酸和色氨酸嚴重缺乏，導致玉米本身的營養價值較差，長期以玉米為單ー糧食會導致嚴重的營養不良。為了改進玉米的蛋白質質量，人們進行了大量的科學研究。Opaque-2是ー個含有bZIP結構域的轉錄因子，并且在1987年被人們通過轉座子標簽技術克隆。突變體表現出了典型的粉質胚乳(圖I)，并且在生化成分含量中，ベ 相對于野生型籽粒表現出了高含量的賴氨酸和色氨酸。因此，Opaque-2是ー個著名的籽粒高賴氨酸突變體。目前研究表明，轉錄因子Opaque-2在玉米胚乳中專ー的調控22kD醇溶蛋白的表達，并且部分調控19kD醇溶蛋白的表達。由于之前的研究中已經發現，Opaque-2可以和ー些非醇溶蛋白產生物理結合，因此，可以認為，Opaque-2在玉米籽粒發育過程中可能還擔負著一些其他的重要使命。從Opaque-2克隆至今，人們通過ー些方法找到了ー些疑似和Opaque-2有關的基因，如PBF、OHPU GCN5，但是對于Opaque-2在玉米籽粒發育中具體的調控機制依然不為人知。鑒于Opaque-2本身轉錄因子的分子結構以及其調控的下游蛋白在玉米籽粒中的重要作用，人們普遍認為Opaque-2是ー個在籽粒發育中起到重要作用的轉錄因子。解釋Opaque-2的具體功能對于人們改進玉米蛋白質品質具有極為重要的意義。根據之前研究的經驗來看，通過蛋白相互作用的方法在轉錄后水平來尋找調控Opaque-2的蛋白不失為一個重要的手段。蛋白相互作用的方法包括酵母雙雜篩庫、體外的Pul 1-down、體內的免疫共沉淀(CoIP)等。酵母雙雜實驗是基于酵母體系在酵母體內篩選可能有互作的兩個蛋白的方法。該實驗可以大范圍地篩選可能有直接互作的兩個蛋白。但是，其背景信號較高，會有一些假陽性的情況出現。Pull-down是基于免疫沉淀和Western技術發展來的體外或者半體內來檢測蛋白互作的ー門技木。該技術通過抗體的特異性吸附以及互作蛋白之間的相互物理性的結合來進行互作驗證。該實驗方法相對于酵母雙雜可以大幅降低背景，但是還是不能完全體內地來驗證蛋白互作。由Pull-down技術發展而來的免疫共沉淀技術可以在體內情況下驗證蛋白互作。 該技術原理和Pull-down —致,都是利用了免疫沉淀和Western技術來檢測蛋白互作。但是和Pull-down不同的是免疫共沉淀完全采取了內源的組織細胞表達的蛋白。因此，免疫共沉淀的難度更大對抗體的要求更高，但是結果更可靠。此外，一些其他的實驗方法也可以用來進行蛋白互作之后的功能分析。包括亞細胞定位以及蛋白在植物細胞瞬時表達的酶活測定等。亞細胞定位主要是基于以熒光蛋白為標簽的瞬時轉化技木。可以通過基因槍對洋蔥表皮細胞瞬時轉化以及農桿菌侵染煙草表皮細胞或者原生質體等方法來實現對蛋白的亞細胞定位。在對互作蛋白的功能分析中，采取以⑶S為報道基因，熒光素酶為內參通過酶標儀來測定酶活的方法來對互作蛋白的功能分析進行定量檢測。

發明內容
本發明的目的之一在于通過酵母雙雜技術篩選出了ー個對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因，稱為ZmTaxilin。該基因在酵母中和Opaque-2有相互作用。 本發明的目的之ニ在于提供該基因的克隆方法。本發明的目的之三在于提供其應用價值。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案為
ー種對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因，其特征在于該基因為SEQ ID N0:1所示的堿基序列。一種克隆上述的對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因，其特征在于該方法的具體步驟為
a.將均一化的玉米籽粒cDNA片段與單雜載體pGADI7-Rec連接轉化,構建館質粒,選取其中包含bZIP結構域以及核定位信號又屏蔽了其轉錄激活結構域02-2片段，將其連入PGBKT7載體中，構建庫質粒；
b.將步驟a所得的庫質粒以及餌質粒轉入酵母AH109中，得到酵母轉化子，通過DDO與QDO的篩選，共獲得了疑似陽性克隆，對該克隆質粒抽提、測序分析以及回轉酵母，篩選出一個與Taxilin同源的基因，即得到對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因。上述的對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因在對轉錄因子下游靶標基因的轉錄中的調控作用。上述的對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因在和bZIP類轉錄因子發生相互結合并且改變轉錄因子在細胞內分布中的應用。上述的對bZIP類轉錄因子在調控bZIP類轉錄因子轉錄激活能力中作用。上述的對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因在抑制被調控轉錄因子對下游靶標基因的基因表達中的應用。通過RT-PCR與Real-time PCR的方法證明了本發明的基因ZmTaxilin與Opaque-2的表達具有時空重疊性。通過瞬時轉化洋蔥表皮細胞發現ZmTaxilin與Opaque-2具有一致的共定位。ZmTaxilin在洋蔥表皮細胞中通過改變Opaque-2的亞細胞定位抑制了Opaque-2的功能。由于Opaque-2是ー個能夠調控22kD醇溶蛋白啟動子表達的轉錄因子。因此，將22kD醇溶蛋白啟動子，Opaque-2, ZmTaxilin以及熒光素酶一同轉入洋蔥表皮細胞中，通過酶標儀分別檢測GUS與熒光素酶的酶活。通過研究和bZIP類轉錄因子有互作的蛋白為線索，利用酵母雙雜的方法，以Opaque-2為館質粒,篩選出了一個含有Taxilin結構域的蛋白。通過NCBI預測，該蛋白是一個疑似的細胞骨架蛋白。通過酵母回轉驗證以及半體內的GST Pull-down實驗,證明了和Opaque-2的互作。此外,通過對ZmTaxilin的時空表達分析發現，該蛋白和Opaque-2具有時空重疊性。在對ZmTaxilin調控Opaque-2的亞細胞定位以及功能分析中發現，ZmTaxilin在洋蔥表皮細胞中可以改變Opaque-2的亞細胞定位,從而降低Opaque-2對22kD醇溶蛋白啟動子的轉錄調控。本發明首次發現細胞骨架蛋白能夠和bZIP類的轉錄因子Opaque-2發生互作，從而改變了 Opaque-2的亞細胞定位,并且抑制Opaque-2的轉錄調控能力。對于解釋Opaque-2的具體轉錄后調控機制具有極為重要的意義，為高品質玉米的大規模生產奠定理論基礎。本專利適用于一般玉米常規品種，具體以W22自交系為例說明。


圖I是野生型與Opaque-2突變體雜交的F2代籽粒。黑色箭頭分別指出了由于Opaque-2突變而導致的不透明的Opaque表型籽粒以及野生型的透明的籽粒；
圖2是酵母雙雜篩庫中館質粒構建的示意圖。由于Opaque-2本身就是一個轉錄因子，具有較強的轉錄激活能力，所以利用Opaque-2全長基因篩庫會有很高的自激活背景。因此，根據Opaque-2的序列特性，將Opaque-2全長分為三段，選擇第二段02_2(即包括了 bZIP結構域又屏蔽了轉錄激活結構域)作為餌，和已經成功構建的庫質粒進行篩庫；
圖3是酵母雙雜篩庫獲得的陽性克隆滴板驗證結果圖，其中3-42即為ZmTaxilin在篩庫中使用的編號，AD+02-2以及3-42+BD都為負對照；
圖4是通過RT PCR與Real-time PCR檢測ZmTaxilin在根、莖、葉、雄花、須、穗與籽粒中的表達，并且還檢測了籽粒授粉后不同時期的表達情況；
圖5是通過半體內的GST Pull-down實驗驗證ZmTaxilin與Opaque-2的相互作用。GST +kernel extracts 與單獨的 kernel extracts 為負對照；
圖6是利用基因槍瞬時轉化洋蔥表皮細胞來檢測ZmTaxilin與Opaque-2的亞細胞定
位；
圖7同樣利用基因槍瞬時轉化洋蔥表皮細胞來檢測ZmTaxilin對Opaque-2調控22kD醇溶蛋白啟動子的影響。其中，ZlC啟動子+YFP、Z1C啟動子+CFP為負對照。
具體實施例方式下面結合具體實施事例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生物學一實驗手冊(Plant Molecular Biology — A Laboratory Manual, Melody S. Clark編’ Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例一利用酵母雙雜實驗篩選和0paque-2有互作的蛋白
首先采取了 SMART方法，獲得了均一化的玉米籽粒cDNA片段。將該cDNA片段與單雜載體pGADI7-Rec連接轉化，獲得了約I. OX IO6個克隆。在餌質粒的構建中，由于全長Opaque-2轉錄背景較高，因此選取了包含bZIP結構域以及核定位信號又屏蔽了其轉錄激活結構域的02-2片段，參見圖2)，將其連入pGBKI7載體中。通過 PEG/LiAc法將構建的庫質粒以及餌質粒轉入酵母AH109中，得到IO6個酵母轉化子。通過DDO與QDO的篩選，共獲得了 50個疑似陽性克隆。對這些克隆質粒抽提、測序分析以及回轉酵母，篩選出一個與Taxilin同源的基因，參見圖3。實施例二 ZmTaxilin和Opaque-2的半體內互作驗證
為了進一步驗證ZmTaxilin和Opaque-2的互作,采取了優化的GST Pull-down方法。首先利用pGEX-4t-l的大腸桿菌外源表達載體構建了含有GST標簽的ZmTaxilin。擴增GST-taxilin的特異引物的堿基序列為
正向引物從 5'端至 3'端為GCGAAITCATGGAAGGCTCGCCGGTGGC ( + )
反向引物從 5'端至 3'端為GCCCCGGGTTAAGATTCTTGACTTGTCG (-)
將構建完的GST-taxilin轉入BL21大腸桿菌外源表達菌株中進行誘導。經過誘導條件的摸索，確定最佳的誘導條件為30攝氏度，ImM IPTG在OD為0. 6時誘導6小時。利用超聲破碎的方法裂解大腸桿菌獲得含有GST-taxilin的總蛋白。Pull-down 的過程是基于PIERCE 的GST Pull-down試劑盒(ProFound Pull-DownGST Protein:Protein Interaction Kit)來進行的。首先利用已去頭的槍頭吸取50 u I含有谷胱甘肽的瓊脂糖珠子(Immobilized Glutathione)至離心柱中，利用事先配置的緩沖液(ProFound 裂解液TBS=1:1)洗滌5遍，每遍800 y I。其次，在含有GST-taxilin的總蛋白中加入等量的ProFound 裂解液,取800 ii I的總蛋白至離心柱中，使其與珠子一起4°C孵育I小時。I小時后首先同樣利用800 u I緩沖液清洗珠子3遍，隨后用自配的蛋白抽提buffer清洗珠子3遍。保存于4°C備用。蛋白抽提buffer的配方為
25mM Tris-Cl pH7. 4-7. 5 IOmM EDTA pH7. 4-7. 5 120mM NaCl
0. 2% NP-40ImM PMSF
0.1%蛋白酶抑制劑(Sigma)
同樣利用蛋白抽提buffer抽提授粉后15天(15DAP)的玉米野生型籽粒。抽提方法為取5-6顆15DAP的玉米野生型籽粒液氮研磨，加入800 U I的蛋白抽提buffer。冰上靜置30分鐘后，4°C離心取上清，即為玉米籽粒總蛋白溶液。將獲得的總蛋白加入已經處理的珠子中，使總蛋白與珠子在4°C孵育2小時。2小時后離心回收珠子，用蛋白抽提buffer清洗珠子5遍去除非特異結合的蛋白。將清洗干凈的珠子按照說明書的指示加入用蛋白抽提buffer溶解的谷胱甘肽溶液，洗脫結合在珠子上的蛋白，離心收集蛋白溶液用于Western檢測。Western使用的抗體分別為GST抗體(Abcam)以及02抗體(自備)。經過GST Pull-down實驗發現，GST-Taxilin可以在體外非常穩定地和Opaque-2發生直接的結合。由于我們在Pull-down過程中，使用的是玉米籽粒內源的未變性的0paque-2復合物代替了大腸桿菌外源表達的Opaque-2，因此反應條件更接近體內的實際情況，結果更為可靠。實施例三ZmTaxilin在玉米組織中的時空表達分析
首先收取玉米各組織器官的材料，包括根、莖、葉、雄穗、須、雌穗以及從3DAP至36DAP的籽粒，抽提并且反轉錄RNA為cDNA。以ZmUBQ(GenBank Accession BT018032)為內參，對所有反轉錄的cDNA進行定量PCR ( (MJ Research)。以玉米籽粒授粉后18天(18DAP)的表達量為參照(設定為I )，對其他的樣品進行相對表達分析。定量PCR中使用到的ZmTaxi I in以及ZmUBQ的弓丨物堿基序列為ZmTaxilin :正向引物從 5'端至 3'端為TCAACCTACCGTCCGTCTCAG ( + )
反向引物從 5'端至 3'端為GTAGGAATGCACCACTAGGCTCT (-)
ZmUBQ :正向引物從 5'端至 3'端為CTGGTGCCCTCTCCATATGG ( + )
反向引物從 5'端至 3'端為CAACACTGACACGACTCATGACA (-)
經過定量分析發現，ZmTaxilin雖然在所有組織中均有表達，但是在籽粒胚乳約授粉后10天左右的時期具有表達高峰。因此，可以認為，ZmTaxilin與Opaque-2在表達的時間和空間上具有重疊性，參見圖4。實施例四ZmTaxilin和Opaque-2在洋蔥表皮細胞中的單獨定位與共定位
將ZmTaxilin和Opaque-2基因全長通過GATEWAY體系分別連入pB7CWG2和pB7YWG2載體中，使其N端帶有熒光蛋白標簽。載體鑒定正確后分別大抽質粒，并且將質粒濃度稀釋至Li I U g/U I。利用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞的方法通過Biolistic PDS-1000/He Gene GunSystem (Bio-Rad)基因槍將這兩個載體分別打入已經在MS固體培養基中25°C暗培養至少8小時的洋蔥表皮細胞中。MS固體培養基配方為
MS salt 4.33g/L
鹿糖30g/L 瓊脂粉7g/L
用 1M/L KOH 調 pH 至 5. 8
轟擊完畢后，繼續25°C暗培養I天。將洋蔥表皮細胞在載玻片中制備成樣本在共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM 710)中觀察ZmTaxilin和Opaque-2的單獨定位與共定位。在共聚焦顯微鏡的觀察中，采用了 433nm激發波長以及458nm發射波長來檢測CFP的信號，采用了 513nm激發波長和530nm發射波長來檢測YFP的信號。在共聚焦顯微鏡的觀察過程中發現，YFP-02主要定位在細胞核，但在細胞質中有一定彌散分布(圖6A)。相比于YFP-02，CFP-Taxilin并沒有定位于細胞核，并在細胞核附近聚集分布(圖6B)。從這兩個蛋白單獨定位的結果中可以很明顯的觀察到，YFP-02和CFP-Taxilin在單獨表達的時候具有各自不同的定位。而當這兩個蛋白共表達的時候，YFP-02非但和CFP-Taxilin有非常一致的共定位，而且共定位信號類似于CFP — Taxilin單獨定位的部位(圖6C)。同時，原本主要定位于細胞核，并且在細胞質中呈現彌散分布的YFP-02主要在細胞質中表達。因此，可以認為，CFP-Taxilin可以改變YFP-02的定位。實施例五在洋蔥表皮細胞中檢測ZmTaxilin對Opaque-2調控22kD醇溶蛋白啟動子的影響
由于在實施例四中發現CFP-Taxilin可以改變YFP-02的定位，為了查清ZmTaxilin在Opaque-2調控22kD醇溶蛋白的過程中起到了什么作用。我們利用洋蔥活細胞系統來檢測ZmTaxilin的功能。為了和實施例四的結果具有可比較性，因此繼續選擇CFP-Taxilin和YFP-02這兩個載體，并且重新構建pUC18-P22kD:⑶S和pUC18_35S: Luciferase載體。pUC18-P22kD:⑶S載體中的22kD醇溶蛋白啟動子包含了 I個Prolamin box和3個Opaque-2結合位點。pUC18_P22kD:⑶S構建的引物堿基序列為
正向引物從 5’ 至 3’ 端為GCCCCGGGGGAITTCAATTAGTCTATA 反向引物從 5’ 至 3’ 端為GCGAAITCTGTTGTTAGGTTGITGCTA
此外，選擇熒光素酶作為該實驗體系的內參，將熒光素酶基因全長連入pUC18-35S中。pUC18_35S:Luciferase構建的引物喊基序列為正向引物從 5’ 至 3’ 端為GCGGATCCATGGAAGACGCCAAAAACAT 反向引物從 5’ 至 3’ 端為GCGAAITCTTACACGGCGATCTTTCCG
載體構建完成后，大抽質粒并且打基因槍。步驟同亞細胞定位。培養一天后，進行酶活測定。酶活測定步驟為
I.將已培養的洋蔥表皮細胞從MS培養基中小心取出放入I. 5ml離心管中，并且液氮研磨。2.加入⑶S裂解緩沖液，并且12000rpm 4度離心5分鐘，取上清；
GUS裂解緩沖液配方為
IOOmM 磷酸鉀 pH7.8 ImM EDTA 1% Triton X-100 10%甘油
7mM 巰基乙醇
3.BCA定量；
4.取50ill上清加入到180 u I經過37°C預熱的⑶S活性檢測液(2mM 4-MUG)中，迅速混勻，并立刻取出IOiU加入到190 ill反應終止液(0. 2M Na2C03)中，將該管作為酶促反應的0點，其余的反應液繼續37°C孵育，并且計時；
5.⑶S活性檢測液(2mM4-MUG)配方為將50mg 4-MUG溶解到72ml⑶S酶提取液中，配制成2mM工作液。6.在10分鐘，30分鐘，60分鐘時分別取出10 U I反應液，轉入190 U I反應終止
液中；
7.用酶標儀在365nm激發波長，455nm發射波長下，測定不同時間點的GUS吸光度；
8.在測定熒光素酶活性的實驗中，首先配制熒光素酶反應緩沖液，配方為
20mM Tricine pH7. 8
5mM MgC12
0.ImM EDTA
3.3mM DTT
0.27mM 輔酶 A500mM熒光素500mM ATP
9.取10 ill蛋白樣品加入190 ill熒光素酶反應緩沖液中，用酶標儀測定不同樣品的熒光素酶吸光度。 通過3次重復試驗發現，ZmTaxilin本身不具有對祀標啟動子的激活活性,但是可以抑制Opaque-2對祀標啟動子(22kD醇溶蛋白)的轉錄激活功能。綜合在實施例四中CFP-Taxi I in可以改變YFP-02的定位的結果，我們得出以下結論=ZmTaxi I in可以通過改變bZIP類轉錄因子Opaque-2的亞細胞定位，從而起到抑制下游被調控基因(22kD醇溶蛋白)啟動子的表達。
序列表
<110>上海大學
〈120〉對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因、其克隆方法及其應用
〈160〉 I
〈210〉 I
〈211〉 1278
〈212〉 DNA
〈213〉基因序列
〈400〉 I
Atgga aggct cgccg gtggc gcgcc tcccg gaggc taatt ctctc cccga cggct tcgtc60
cccga cagcg agagc tcaga cacgg acgcg gctcc tccct cctcc gcgcc catag ttgac120
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gagaa attga aaaat caaag ggaga agctc gaatc cctgt gtcga acact acagg cagaa1200
aggaa acaag gcccc tccgc cagta ttcca gatgc ccctt ctagc caaga agtgt cagcg1260 acaag tcaag aatct taa1278
權利要求
1.ー種對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因，其特征在于該基因為SEQ ID N0:1所不的喊基序列。
2.一種克隆根據權利要求I所述的對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因，其特征在于該方法的具體步驟為 將均一化的玉米籽粒cDNA片段與單雜載體pGADH-Rec連接轉化，構建餌質粒，選取其中包含bZIP結構域以及核定位信號又屏蔽了其轉錄激活結構域02-2片段，將其連入PGBKT7載體中，構建庫質粒； b.將步驟a所得的庫質粒以及餌質粒轉入酵母AH109中，得到酵母轉化子，通過DDO與QDO的篩選，共獲得了疑似陽性克隆，對該克隆 質粒抽提、測序分析以及回轉酵母，篩選出一個與Taxilin同源的基因，即得到對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因。
3.ー種根據權利要求I所述的對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因在對轉錄因子下游靶標基因的轉錄中的調控作用。
4.ー種根據權利要求I所述的對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因在和bZIP類轉錄因子發生相互結合并且改變轉錄因子在細胞內分布中的應用。
5.ー種根據權利要求I所述的對bZIP類轉錄因子在調控bZIP類轉錄因子轉錄激活能力中作用。
6.ー種根據權利要求I所述的對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因在抑制被調控轉錄因子對下游靶標基因的基因表達中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種對bZIP類轉錄因子具有調控作用的基因、其克隆方法及其應用。該基因為SEQIDNO1所示的堿基序列。該序列可以和bZIP類轉錄因子(如Opaque-2)發生蛋白互作，和互作轉錄因子(以Opaque-2為例)具有時空表達重疊性；在ZmTaxilin和互作轉錄因子(以Opaque-2為例)的亞細胞定位以及共定位中發現，ZmTaxilin可以明顯改變互作轉錄因子(以Opaque－2為例)的亞細胞定位；在植物活細胞體系中進行轉錄激活活性檢測，發現ZmTaxilin可以抑制互作轉錄因子(以Opaque-2為例)對靶標基因(以22kD醇溶蛋白基因為例)啟動子的轉錄活性。
文檔編號C12N15/29GK102653766SQ20121013308
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月3日 優先權日2012年5月3日
發明者喬禎逸, 宋任濤, 張男, 梁錚, 許政暟 申請人:上海大學