專利名稱：焦磷酸測序法檢測巰嘌呤個體化用藥基因多態性的試劑盒及方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及焦磷酸測序法檢測巰嘌呤個體化用藥基因多態性的試劑盒及方法。
背景技術：
硫嘌呤是6-巰基嘌呤咪唑衍生物，為具有免疫抑制作用的抗代謝劑。可產生烷基化作用抑制核酸的生物合成，防止細胞的增生，并可引起的DNA損傷。通過抑制T淋巴細胞而影響免疫，可抑制遲發過敏反應。臨床上主要用于急慢性白血病、絨毛膜上皮癌和器官移植。巰嘌呤甲基轉移酶(TPMT)參與巰嘌呤和咪唑硫嘌呤的甲基化作用，與其化療效果和毒性關系密切。TPMT的活性受到遺傳多態性的影響，它可以通過TPMT改變巰嘌呤的代謝率。TPMT的活性在患者間個體差異明顯，86. 6%的野生型TPMT*1人群TPMT活性較高，而
11.I %具有中等活性，有O. 3%活性缺失。其中3個(TPMT*2，*3A和*3C[G460A])占中等和低活性狀況的80-95%。TPMT*3A的患者TPMT活性完全喪失，TPMT*3B和TPMT*3C患者的TPMT催化活性分別降低9和I. 4倍。區分ΤΡΜΤ*1/*3 (中等代謝者)和TPMT*3B/*3C (低代謝者)。研究表明，TPMT中等活性和較低活性的患者只能接受10% 50%的平均巰嘌呤化療劑量。人群中約O. 3%的TPMT活性缺失，11%的人群活性中等，都面臨著患骨髄抑制增加的風險。TPMT基因的遺傳變異對于急性淋巴細胞性白血病化療反應的療效和毒副作用具有重要意義。TPMT活性與上述嘌呤類藥物的治療效果及毒副作用密切相關，是目前FDA批準修改藥物說明書增加基因遺傳變異警示的有限的幾種藥物之一，臨床醫生應結合TPMT基因型慎重使用嘌呤類藥物。綜上所述，TPMT (rsll42345)基因多態性是影響硫嘌呤需求劑量差異性的主要因素，開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測TPMT (rsll42345)基因多態性的試劑盒將為硫嘌呤的臨床個體化治療起到積極的推動作用。焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術,該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是ー種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發明內容
TPMT (rsll42345)基因多態性是影響巰嘌呤劑量個體差異的最主要因素。本發明提供一種檢測影響臨床巰嘌呤個體化用藥治療的用藥基因TPMT (rsll42345) (SEQ IDNO. I)多態性的試劑盒及方法，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測巰嘌呤個體化用藥相關基因SNP。為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為
一種焦磷酸測序法檢測巰嘌呤個體化用藥基因多態性的試劑盒，包括如下引物
(I)擴增引物TPMT (rsll42345)上游引物5、TGG GGA ATT GAC TGT CTT TTT GA~3r (SEQ IDNO. 2)；
TPMT (rsll42345)下游引物5、TCC ATT ACA TTT TCA GGC TTT AGCHT (SEQ IDNO. 3)；
其中，下游引物的5,進行生物素標記；
(2)測序引物
TPMT (rsll42345)測序引物5r - GAC TGT CTT TTT GAA AAG TT -3, (SEQ ID NO. 4)；試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑。一種應用上述試劑盒檢測巰嘌呤個體化用藥基因多態性的方法，包括如下步驟 (O DNA提取；
(2)聚合酶鏈反應
配制 50 μ I PCR 擴增體系，包含10XPCR buffer 5. Ομ I, dNTP 3·0μ1，上游引物
O.5 μ 1，下游引物O. 5 μ 1，rTaqO. 5μ 1，水39. 5μ 1，模板Ι.Ομ I ;按照下面的循環參數設置擴增儀95 0C 5min預變性；然后依次在95°C 30S, 55°C 30S, 72°C 30S，進行35個循環；再在72°C保持5min，最終保持在4 °C，得擴增產物；
(3)焦磷酸測序單鏈樣本純化；
(4)焦磷酸測序及結果分析。本發明的試劑盒對TPMT (rsl 142345)目標序列進行分析和檢測野生型AGTTATATCTAC (SEQ ID NO. 5)和突變型 AGTTATGTCTAC (SEQ ID NO. 6)，擴增出的片段長度為 132bp。由于設計了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發明的試劑盒適用于對他莫昔芬個體化用藥基因進行快速檢測，可廣泛應用于臨床上他莫昔芬個體化用藥方案制定的基因檢測。與現有技術相比，其應用焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便于構建標準化操作流程；具有高通量、低成本等特點；PCR產物即可直接用于測序，不需進行產物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。


圖I為本發明TPMT (rsll42345) AA焦磷酸測序結果。
具體實施例方式下面結合實施例對上述試劑盒及檢測方法進行詳細描述。實施例I :
TPMT (rsll42345)上游引物5、TGG GGA ATT GAC TGT CTT TTT GA~3r (SEQ IDNO. 2)；
TPMT (rsll42345)下游引物5、TCC ATT ACA TTT TCA GGC TTT AGCHT (SEQ IDNO. 3)；
TPMT (rsll42345)測序引物:5,- GAC TGT CTT TTT GAA AAG TT -3, (SEQ ID NO. 4)；
I.DNA提取
I.I實驗前試劑材料準備與檢查工作如下(I)檢查試劑盒保質期以及確保Wash Buffer I和2中已添加こ醇，并在瓶上相應標識處打勾V; (2)異丙醇(如無，可用無水こ醇替代)和75%こ醇；(3)高壓滅菌有效期內的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數次混勻；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管對應標本卩隹一性標識做好標記；
I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血轉移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6蓋上Eppendorf管蓋，室溫孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室溫離心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；· I. 9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管ロ棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；
I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；
1.11移取30011しNuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛倒數次混勻；
I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；
I. 13移取上清轉移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數次混勻，可見白色絮狀gDNA析
出；
I. 15 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I. 16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管ロ棄去上清；
I. 17移取300uL 75%こ醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I.19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管ロ棄去上清；
I.20在實驗臺上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側放風干；
I. 21目測沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22過夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計進行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入こ醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標清樣本唯一性編號，并用透明膠帶纏繞保護；
1.24保存核酸標本至4°C冰箱；
2.聚合酶鏈反應
2.I在試劑準備區配制50 μ I PCR擴增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
權利要求
1.焦磷酸測序法檢測巰嘌呤個體化用藥基因多態性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物 (1)擴增引物上游引物5、TGG GGA ATT GAC TGT CTT TTT GA~3r ；下游引物:5,-TCC ATT ACA TTT TCA GGC TTT AGCHT ；其中，下游引物的5,進行生物素標記； (2)測序引物5r~GAC TGT CTT TTT GAA AAG TT -3、
2.ー種應用權利要求I所述的試劑盒檢測巰嘌呤個體化用藥基因多態性的方法，包括如下步驟 (O DNA提取； (2)聚合酶鏈反應 配制 50 μ I PCR 擴增體系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP 3. O μ 1，上游引物O.5 μ 1，下游引物 O. 5 μ 1，rTaqO. 5μ 1，水 39. 5μ 1，模板 I. Ομ I ;循環程序為:95 0C 5min預變性；依次在95°C 30S, 55°C 30S, 72°C 30S,進行35個循環；72°C保持5min，最終保持在4 °C，得擴增產物； (3)焦磷酸測序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測序及結果分析。
全文摘要
本發明公開了一種焦磷酸測序法檢測巰嘌呤個體化用藥基因多態性的試劑盒及方法。具體是指TPMT(rs1142345)單核苷酸多態性。試劑盒包含如SEQIDNO.3—6所示的引物。本發明的試劑盒，可以實現準確、快捷、高通量TPMT(rs1142345)的檢測，從而達到對巰嘌呤用藥實現安全合理有效的個體化給藥。
文檔編號C12Q1/68GK102676667SQ20121013536
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年5月4日
發明者周宏灝 申請人:周宏灝