專利名稱：陰道毛滴蟲和白色念珠菌雙通道熒光pcr檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的分子生物學(xué)檢測方法，特別是涉及陰道毛滴蟲、白色念珠菌的雙重檢測。
背景技術(shù)：
毛滴蟲是ー種有鞭毛的原蟲，目前發(fā)現(xiàn)寄生在人體的毛滴蟲有3種，即口腔毛滴蟲、人毛滴蟲和陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis, TV)。前兩種在人類病因?qū)W上無意義，而TV寄生在陰道、尿道或膀胱，能引起人的泌尿生殖道疾病，稱為滴蟲病。滴蟲病分為滴蟲性尿道炎、滴蟲性陰道炎、滴蟲性前列腺炎。陰道毛滴蟲引起的女性陰道炎，以泡沫狀陰道分泌物為典型表現(xiàn)。有人報道，陰道毛滴蟲能吞噬精子，導(dǎo)致不孕，還能引起細胞發(fā)育異常及細胞核異常，因此,有滴蟲女性的癌癥發(fā)生率顯著高于無滴蟲女性。女性患者滴蟲病的癥 狀涵蓋從陰道穹窿及子宮頸輕度充血到廣泛糜爛、瘀點及肛周糜爛、顆粒狀易碎及潮紅的子宮內(nèi)膜(草莓狀子宮頸)。男性患者癥狀輕微，有時表現(xiàn)為慢性前列腺炎的癥狀。滴蟲病與某些其他性傳播疾病的癥狀類似，故單純以臨床癥狀難以做出確診，需用實驗方法檢出陰道毛滴蟲方可確診。TV感染是ー種十分常見的性傳播疾病，該病呈全球分布，人群普遍易感。傳染源是滴蟲患者和滴蟲攜帯者，主要通過性交直接傳染，亦可通過被污染的毛巾、公共浴池、游泳池、坐式馬桶、浴缸等物品等間接傳播。世界衛(wèi)生組織將陰道毛滴蟲病作為性傳播疾病。據(jù)WHO報道，全球每年有I. 7億人感染TV。除引起泌尿生殖道感染外，TV還是HIV感染和誘發(fā)宮頸癌的危險因素之一。女性妊娠中期感染TV常引起胎膜早破、早產(chǎn)、低體重兒等，它也是男性非淋菌性尿道炎的ー個重要病因。念珠菌是ー種內(nèi)源性真菌，它可以侵犯皮膚、粘膜和內(nèi)臟，表現(xiàn)為急性、亞急性和慢性炎癥。目前發(fā)現(xiàn)對人體致病的念珠菌有七種，其中以白色念珠菌(Canidia Albicans, CA)在臨床上最為常見，其毒力也最強。人生殖器官皮膚粘膜的念珠菌感染稱為生殖器念珠菌病。白色念珠菌可引起女性的外陰及陰道炎癥，主要表現(xiàn)為外陰及陰道瘙癢及陰道分泌物增多并呈豆渣樣白帯，陰道壁粘膜紅腫，有灼燒感。可通過性交傳染給男性，引發(fā)男性的念珠菌性龜頭炎和包皮龜頭炎，表現(xiàn)為包皮和龜頭輕度潮紅，龜頭部有紅丘疹，包皮垢異常增多，呈白色乳酪狀。白色念珠菌陰道炎的危害極大可能會造成暫時性不孕，如果患了念珠菌性陰道炎，陰道的酸堿度的改變會使精子的活動カ受到抑制，且炎性細胞可吞噬精子，并使精子活動カ減弱；可影響胎兒發(fā)育，極少數(shù)孕婦陰道中的念珠菌能經(jīng)宮頸上行，穿透胎膜感染胎兒，引起早產(chǎn)。另外經(jīng)陰道分娩時，也可能感染引起口腔念珠菌病——鵝ロ瘡。有些嬰兒還可能出現(xiàn)肛門周圍念珠菌性皮炎；引起其他疾病，若念珠菌性陰道炎長期不治療的話，易造成炎癥上行，引起宮頸炎和宮頸糜爛，如果病原體進入子宮腔，則會引起輸卵管卵巣炎癥、盆腔炎等，最終影響懷孕。與其他性傳播疾病一祥，這兩種病菌引起的臨床癥狀不典型，臨床確診常借助實驗檢測。常用的方法有培養(yǎng)法(診斷“金標準”)、涂片染色法、懸滴法、免疫學(xué)方法及核酸檢測法等。這些方法在準確性、可靠性、易用性等ー個或多個方面有缺點。例如，涂片染色法陽性率低，培養(yǎng)法耗時需要3-7天，且不夠敏感。因此，如何選擇準確、可靠、方便的實驗診斷方法頗為重要，合適的方法能有效減少該病帶來的危害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面提供了用于在ー個反應(yīng)管中同時對陰道毛滴蟲和白色念珠菌進行實時熒光PCR檢測的引物和Taqman探針。在一個實施方案中，對于陰道毛滴蟲檢測，其上游引物序列為SEQID NO :1或13的核苷酸序列，下游引物序列為SEQ ID NO :2或14的核苷酸序列，TaqMan探針為SEQ ID NO:3或12的核苷酸序列；對于白色念珠菌檢測，上游引物序列為SEQ I·D NO:4的核苷酸序列，下游引物為SEQ ID NO 5的核苷酸序列，TaqMan探針為SEQ ID NO 6的核苷酸序列。在一個實施方案中，上述TaqMan探針為經(jīng)過突光標記的,其5’端標記有報告突光基團(R)，并且3’端標記有熒光淬滅基團(Q)。在一個實施方案中，上述陰道毛滴蟲TaqMan探針(SEQ ID NO 3或12) 5’端的報告熒光基團為FAM，3’端的熒光淬滅基團為BHQ2。在一個實施方案中，白色念球菌TaqMan探針(SEQ ID NO 6) 5’端的報告熒光基團為HEX，3’端的熒光淬滅基團為BHQ2。本發(fā)明的第二方面提供了一種靈敏度高且同時檢測陰道毛滴蟲和白色念珠菌的雙通道實時熒光PCR檢測方法，所述檢測方法包括以本發(fā)明的引物和TaqMan探針進行實時熒光定量PCR的步驟。本發(fā)明的第三方面提供了一種用于同時對陰道毛滴蟲和白色念珠菌進行檢測的實時熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明用于檢測陰道毛滴蟲和白色念珠菌的引物和Taqman探針。在本發(fā)明中，在同一個反應(yīng)體系同時對陰道毛滴蟲和白色念珠菌進行檢測的雙通道實時熒光PCR檢測方法以待測樣品中的陰道毛滴蟲RNA和白色念珠菌DNA為檢測對象，準確度和精確性高。同時，本發(fā)明的方法還具有以下優(yōu)點I、首次建立了針對陰道毛滴蟲和白色念珠菌雙通道實時熒光PCR檢測的方法(SP為多重實時熒光PCR方法)，利用此檢測方法可以同時對待測樣本中的陰道毛滴蟲和白色念珠菌進行檢測。2、檢測樣本多祥化，如男性泌尿道分泌物、女性陰道分泌物、尿液等。同時，利用本發(fā)明的方法可以避免常規(guī)的陰道后穹窿取樣，因為孕婦、兒童和青少年一般不能忍受窺陰器檢查，對這些人群篩檢陰道ロ取樣即可。3、本檢測方法與陰道毛滴蟲和白色念珠菌的其它常規(guī)檢測方法如濕片法、分離培養(yǎng)法、免疫熒光、酶免疫法和嵌套式PCR相比，靈敏度和特異性極高，檢測效率得到了很大的提高，在DNA提取、PCR擴增、雜交過程是均需設(shè)立陽性和陰性對照，可避免出現(xiàn)假陽性有效的防止了污染。本檢測方法對于生殖道常見的微生物，包括金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、沙眼衣原體、淋病奈瑟氏菌、生殖支原體和陰道加特納菌等的檢測結(jié)果均為陰性，說明了該檢測方法有極高的特異性。4、本檢測方法與陰道毛滴蟲和白色念珠菌的其它常規(guī)檢測方法如濕片法、分離培養(yǎng)法、免疫熒光、酶免疫法和嵌套式PCR相比，具有操作程序簡單易用的特點，并可進一歩制成檢測試劑盒，操作程序化，減輕患者的取樣痛苦和等待時間，大大提高檢測效率，適合廣泛推廣和應(yīng)用。5、本檢測方法可以同時對陰道毛滴蟲和白色念珠菌進行檢測，可以用于日常⑶C監(jiān)測和臨床常規(guī)檢查，也可以在發(fā)病期間作為診斷類型的分辨。綜上所述，本發(fā)明實現(xiàn)了一次同時對陰道毛滴蟲和白色念珠菌進行快速、準確檢測，對于性病的防控和監(jiān)測具有很大的現(xiàn)實意義。本發(fā)明的檢測方法及試劑盒可以用于多種臨床樣本男性泌尿道分泌物、女性陰道分泌物、尿液等陰道毛滴蟲RNA和白色念珠菌DNA進行定性檢測，用于陰道毛滴蟲和白色念珠菌的輔助診斷及流行病學(xué)監(jiān)控。下面對本發(fā)明做進ー步詳細說明。
具體實施例方式下述實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Samtoook等人所編《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商建議的條件。所用引物及TaqMan探針由寶生物工程(大連)有限公司合成，所有序列測定工作均由寶生物工程(大連)有限公司完成。實施例I、用于對陰道毛滴蟲RNA和白色念珠菌DNA進行雙通道檢測的實時熒光PCR引物和Taqman探針以及篩選。從 GenBank 數(shù)據(jù)(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/FLU/FLU. html)下載陰道毛滴蟲亞型rRNA基因全序列，軟件比對分析所有陰道毛滴蟲rRNA基因序列的一致性，選擇相對保守區(qū)設(shè)計引物和探針；保守區(qū)的選擇原則為序列同源性分析中保守性高且適合PCR特異性擴增的區(qū)域作為靶擴增區(qū)。從GenBank 數(shù)據(jù)(http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/FLU/FLU. html)下載白色念珠菌的LlAl全序列進行比對選取保守區(qū)域作為靶擴增區(qū)。陰道毛滴蟲和白色念珠菌的靶擴增區(qū)都選定后可以使用0LIG06. O實時熒光PCR引物探針設(shè)計軟件設(shè)計合成TaqMan探針及引物。引物和探針設(shè)計中允許同一變異位點允許2個及2個以下簡并堿基。將所提取的備選引物滿足以下要求進行篩選①探針長度(L)在19 一 28bp之間；@Tm值在58-60°C之間； GC%在25 — 75%之間；④連續(xù)相同堿基數(shù)polyN彡4bp ;⑤發(fā)夾結(jié)構(gòu)Hairpin彡4bp !⑥序列同源性>90%;⑦擴增產(chǎn)物長度控制在50 — 150bp之間引物Tm值比探針Tm值低10°C左右；⑨進行序列比對BLAST篩選，排除其它同屬物種和檢測取樣時可能污染的其它種屬病原菌的序列。最佳Tm值設(shè)定在60°C，最佳探針長度為20-25bp。探針的熒光標記選擇FAM/HEX(5’端)作為報告發(fā)光基團，BHQ2 (3’端)為淬滅基團。引物/探針的篩選原則為在目的保守區(qū)中選擇PCR擴增效率和探針結(jié)合效率較高的引物和探針作為候選引物和探針。具體篩選方法如下在引物、探針的兩次篩選過程中均需選擇在目的保守區(qū)中PCR擴增效率和探針結(jié)合效率較高的引物和探針(所用PCR引物和熒光探針由大連寶生物公司合成，引物要求以PAGE純化，探針要求以HPLC純化。到貨時為引物或探針干粉，用無菌水復(fù)溶后，對干粉進行含量測定，探針配制至lOOpmol/μ 1，引物配制至lOOpmol/μ I貯存液后備用)。針對陰道毛滴蟲共設(shè)計了 5組上游和下游引物以及熒光探針，序列如下TV-I上游引物(SEQID NO :7 ) : 5 ’ -TTCATCAAAAACCAAGTCTCTAA-3 ’下游引物(SEQID NO 8) :5，-TTACTTAACACATTATGCCACGT-3，Taqman 探針(SEQ ID NO :3) :5，F(xiàn)AM-TCTTGGCTCCTCACACGATGA_BHQ23，TV-2上游引物(SEQID NO : I) : 5 ’ -AAGTCTCTAAGCAATGGATGTCT -3 ’下游引物(SEQID NO :2 ) : 5 ’ -CAAAGATTAACCTGTCATGATGT -3 ’ Taqman 探針(SEQ ID NO :3) :5，F(xiàn)AM-TCTTGGCTCCTCACACGATGA_BHQ23，TV-3上游引物(SEQID NO :9) :5，-AACCAAGTCTCTAAGCAATGGAT -3，下游引物(SEQID NO 8) :5，-TTACTTAACACATTATGCCACGT-3，Taqman 探針(SEQ ID NO :3) :5’FAM-TCTTGGCTCCTCACACGATGA _BHQ23，TV-4上游引物(SEQ ID NO : 10) :5’ -TCAAAAACCAAGTCTCTAAGCA-3’下游引物(SEQID NO :11) :5’ -ACTCCGGTTACTTAACACATTAT-3’Taqman 探針(SEQ ID NO 12) :5’ FAM-CAATGGATGTCTTGGCTCCTCA_BHQ23，TV-5上游引物(SEQID NO : 13 ) : 5 ’ -ACTTCATCAAAAACCAAGTCT-3 ’下游引物(SEQID NO 14) :5，-TGCATTCAAAGATTAACCTGT-3，Taqman 探針(SEQ ID NO 12) :5’ FAM-CAATGGATGTCTTGGCTCCTCA_BHQ23，針對白色念珠菌共設(shè)計了 4組上游和下游引物以及熒光探針，序列如下CA-I上游引物(SEQID NO : 15 ) : 5 ’ -ACCGTTCATTTGCTCAACTAT-3 ’下游引物(SEQID NO 16) :5’ -TCAATAAGGAATCAATTAAAT-3’Taqman 探針(SEQ ID NO 17) :5’ HEX-TTGGAGACGTGATGCTGCTCA_BHQ2-3’CA-2上游引物(SEQID NO : 18) :5’ -AAAGATATTTTGATAACCCTGA-3’下游引物(SEQID NO :5 ) : 5，-ACCCATAATCAACTTCATCAGA-3 ’Taqman 探針(SEQ ID NO 19) :5’ HEX-TGCTGCCAAAGCTAATTCTGTT_BHQ2-3’CA-3上游引物(SEQID NO 4) :5，-TTGATAACCCTGAAGATTTTGA-3’下游引物(SEQID NO :5 ) : 5，-ACCCATAATCAACTTCATCAGA-3 ’Taqman 探針(SEQ ID NO 6) :5，HEX-TGGGATACTGCTGCTGCCAA_BHQ23，CA-4上游引物(SEQID NO :20) :5’-TGTTTACAACTTAGTATGGCAA -3’下游引物(SEQID NO :21) :5’ -TCACCATACTTTTGACGACA-3’Taqman 探針(SEQ ID NO :22) :5’HEX-TTGGATTCCTTGGTTTGGTTCT 22_BHQ23’
實驗中所用樣品是由遼寧省⑶C提供的陰道毛滴蟲樣品和白色念珠菌樣品3ml，使用科駿生物有限公司的硅膠膜核酸提取試劑盒(貨號KJ001)依照說明書進行陰道毛滴蟲RNA和白色念珠菌DNA提取，將提取的RNA和DNA進行10倍稀釋，作為實時熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化用陽性模板。取10_4、10_5、10_6、10_7、10_8、10_9稀釋度，編號L1-L6。分裝后于-70°C保存?zhèn)溆谩Ｌ结樢锖Y選在篩選實驗中，陰道毛滴蟲和白色念珠菌的雙通道實時熒光PCR檢測體系(25 μ I)如下TV 系 TaqMan 探針 O. 5μ L (IOpmol/μ L)，TV 系上游引物 I. O μ L (lOpmol/μ L),TV 系下游引物 I. O μ L (IOpmoI/ μ L)；CA 系 TaqMan 探針 O. 5 μ L (IOpmoI/ μ L)，CA 系上游引物 I. OyL (10pmol/yL)，CA 系下游引物 LOyL (IOpmol/μ L);樣品 DNA/RNA 5μ L(注在具體的檢測體系中，因為一般都是對未知樣品進行檢測 ，所以DNA/RNA模板的濃度基本上都是未知的);DNA聚合酶(5U/ μ L)0. 5 μ L ;逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/ μ L)0. 5 μ L ;實時熒光PCR緩沖液2 X (用購自Takara公司IOX緩沖液，加dNTP和DEPC水配制而成)12. 5 μ L ;補充無菌水至25 μ L0與上述雙通道實時熒光PCR檢測體系相比，陰道毛滴蟲實時熒光PCR檢測體系不含CA系TaqMan探針、CA系上游引物和CA系下游引物；白色念珠菌實時熒光PCR檢測體系不含TV系TaqMan探針、TV系上游引物和TV系下游引物，并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶。其中的探針、引物以及其他組分的量同上，補充無菌水至25yL。在所述實驗中，實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為先逆轉(zhuǎn)錄50°C 30min ;然后預(yù)變性95 0C 5min ;最后擴增95°C 5sec，55°C 40sec，共40個循環(huán)，在每個循環(huán)的延伸結(jié)束時收集FAM和HEX熒光信號。對于白色念珠菌實時熒光PCR檢測體系，不包括逆轉(zhuǎn)錄步驟。本文使用的PCR儀器為熒光實時定量PCR儀(ABI公司，型號是Prism 7500)。在設(shè)置熒光PCR基線后，熒光PCR的閾值設(shè)定為剛剛超過熒光背景及陰性特異性對照的擴增曲線為準。閾值設(shè)定后，標本的Ct值(C代表反應(yīng)循環(huán)數(shù)，t代表閾值，Ct的含義是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))由儀器自動給出。如果有個別標本的擴增曲線異常，造成儀器誤判，需要人為加以糾正。本試劑盒經(jīng)多次試驗發(fā)現(xiàn)，Ct值在37. O以內(nèi)的模板能得到比較穩(wěn)定可重復(fù)的結(jié)果，可判定為陽性，而Ct在37以上的模板，結(jié)果的重復(fù)性與人為操作、熒光PCR儀分辨能力有關(guān)，甚至出現(xiàn)陰性結(jié)果，本試劑盒確定Ct值在37以上的區(qū)域定為灰區(qū)，即低于檢出極限區(qū)。結(jié)果在灰區(qū)的樣本需重復(fù)試驗取400 μ I樣本重新提取核酸(核酸分離試劑盒中裂解液、助沉劑、無水こ醇的用量加倍，其他組分的用量不變)并檢測。復(fù)檢結(jié)果Ct < 40. O的樣本為陽性，否則為陰性。用陰道毛滴蟲實時熒光PCR檢測體系，對上面的陰道毛滴蟲的5組引物探針，用陽性模板進行篩選，實驗結(jié)果如下，Ct值小于20說明靈敏度高。所有實驗以生理鹽水作為陰性對照，陰性對照的Ct值為O或無數(shù)值說明特異性好。最后確認TV-2、TV-3和TV-5三組的靈敏度和特異性較好。同樣，用白色念珠菌實時熒光PCR檢測體系，對白色念珠菌的4組引物探針，用陽性模板進行篩選，最后確認CA_1、CA-3和CA-4 ニ組的靈敏度和特異性較好。上述檢測的結(jié)果如下
樣品檢測結(jié)果Ct值
權(quán)利要求
1.用于對陰道毛滴蟲和白色念珠菌進行雙通道熒光檢測的引物和TaqMan探針，所述引物和TaqMan探針是根據(jù)陰道毛滴蟲的保守區(qū)設(shè)計的陰道毛滴蟲引物和陰道毛滴蟲TaqMan探針，以及根據(jù)白色念珠菌的保守區(qū)設(shè)計的白色念珠菌引物和白色念珠菌TaqMan探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物和TaqMan探針，其特征在于所述陰道毛滴蟲引物是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，所述陰道毛滴蟲TaqMan探針是SEQ ID NO :3 ;所述白色念珠菌引物是SEQID NO :4和SEQ ID NO :5，并且所述白色念珠菌TaqMan探針是SEQ ID NO :6。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物和Ta qMan探針，其特征在于所述陰道毛滴蟲引物是SEQ ID N0:13和SEQ ID NO : 14，所述陰道毛滴蟲TaqMan探針是SEQ ID N0:12，所述白色念珠菌引物是SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，并且所述白色念珠菌TaqMan探針是SEQ IDNO :6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的引物和TaqMan探針，其特征在于所述陰道毛滴蟲TaqMan探針為經(jīng)過突光標記的,其5’端標記有第一報告突光基團，3’端標記有淬滅突光基團；所述白色念珠菌TaqMan探針為經(jīng)過熒光標記的，其5’端標記有第二報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物和TaqMan探針，其特征在于所述第一報告熒光基團為FAM，所述第二報告熒光基團為HEX，所述熒光淬滅基團為BHQ2。
6.一種用于檢測陰道毛滴蟲和白色念珠菌的雙通道熒光PCR檢測方法，所述方法包括以權(quán)利要求1-5任一項所述的引物和TaqMan探針進行實時熒光定量PCR的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙通道熒光PCR檢測方法，其特征在于所述實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為先逆轉(zhuǎn)錄50°C 30min ;然后預(yù)變性95°C 5min ;最后擴增95°C 5sec,55°C 40sec，共 40 個循環(huán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙通道熒光PCR檢測方法，其特征在于當(dāng)所述陰道毛滴蟲TaqMan探針以FAM標記且所述白色念珠菌TaqMan探針以HEX標記時，在每個循環(huán)的延伸結(jié)束時收集FAM和HEX熒光信號。
9.一種用于對陰道毛滴蟲和白色念珠菌進行熒光PCR檢測的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求I 一 5任一項所述的引物和TaqMan探針。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，還包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液和無菌水。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于對陰道毛滴蟲和白色念珠菌進行雙通道熒光檢測的引物和TaqMan探針，所述引物和TaqMan探針是根據(jù)陰道毛滴蟲的保守區(qū)設(shè)計的陰道毛滴蟲引物和陰道毛滴蟲TaqMan探針，以及根據(jù)白色念珠菌的保守區(qū)設(shè)計的白色念珠菌引物和白色念珠菌TaqMan探針，用以同時一次性檢測待測樣品中是否存在陰道毛滴蟲RNA和白色念珠菌DNA。本發(fā)明還涉及使用所述引物和TaqMan探針進行檢測的方法和包含所述引物和TaqMan探針的試劑盒。
文檔編號C12N15/11GK102719529SQ201210136748
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者劉巨波, 張陸明, 張穎, 熊麗娟 申請人:遼寧科駿生物有限公司