專利名稱：H1亞型禽流感病毒rt-lamp可視化檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及Hl亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒。
背景技術：
禽流感(Avian Influenza，Al)是禽流行性感冒的簡稱，是由正粘病毒科流感病毒屬A型禽流感流行性感冒病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)傳染病。根據A型流感病毒表面糖蛋白(Hemagglutinin, HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同，禽流感病毒(AIV)可進ー步分為不同的亞型，目前已發現有16種HA亞型和9種NA亞型。AIV是ー種有包膜、單股負鏈、分節段的RNA病毒，病毒基因組由8個分節段負鏈RNA組成。AIV基因組的分節段特性使得兩種或兩種以上不同亞型流感病毒共同感染ー個細胞時，子代病毒在裝配時其核酸片段可能以同源交換的形式發生基因重排而導致抗原轉變，從而產生能引起大流行的新流行株。人類歷史上幾次大流感的流行毒株(H2N2、H3N2)均是禽流感病毒與人流感病毒發生基因重排而產生，而HlNl亞型AIV傳播給人直接導致了 1918年世界范圍內的毀滅性人類大流感流行。當前流行的甲型HlNl流感病毒的部分基因也來源于AIV。因此Hl亞型AIV雖為低致病性AIV，但具有重要的公共衛生學意義。加強Hl亞型AIV的檢測和監測，對保障人類健康意義重大，而快速簡便特異的檢測技術有助于Hl亞型AIV的早期大規模診斷。目前禽流感病毒常采用的檢測方法包括病毒雞胚分離、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫熒光技術(IFA)、逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、實時熒光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene chips)。傳統的病毒雞胚分離方法準確、簡便，但耗時太長，通常需要兩天到一周的時間；IFA、ELISA快速但需要特殊試劑；RT-PCR、RRT-PCR、Genechips檢測技術快速、靈敏，但都需要特殊儀器和技術人員，且成本較高，不適合在基層推廣使用。環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是利用ー種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下進行核酸的變性和自動循環的鏈置換核酸擴增反應，整個反應不需要特殊的儀器設備，僅在水浴鍋中就可完成。LAMP技術在目的基因保守區設計了針對8個特異區域的6條引物，使擴增反應具有很高的特異性。LAMP反應結果的觀察方法非常簡便，反應結束后可通過肉眼在可見光或紫外線下直接觀察反應液的顏色變化來判定結果。由于LAMP反應的擴增效率很高，在少量cDNA存在的條件下就可進行核酸的大量擴增，所以只需要在LAMP反應體系中加入反轉錄酶，通過逆轉錄環介導等溫擴增反應(RT-LAMP)就可以完成RNA的檢測。RT-LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優勢，尤其適合在基層開展RT-LAMP試劑盒的應用推廣。RT-LAMP技術中，引物是決定檢測結果靈敏度和特異性的關鍵因素
發明內容

本發明所要解決的ー個技術問題是提供ー種檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物。本發明所提供的檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，由簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-Hl和簡并引物LB-Hl組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3、序列
4、序列5和序列6。所述成套引物中，各簡并引物的摩爾比可為^^!!!!!(^所述簡并引物？^-^、
I.6 u mo I所述簡并引物BIP-HUO. 2iimol所述簡并引物F3_H1、0. 2 y mol所述簡并引物B3-HU0. 8 u mo I所述簡并引物LF_H1、0. 8 u mo I所述簡并引物LB-H1。所述摩爾比是總摩爾數之比，所述總摩爾數是簡并引物中各種單鏈DNA摩爾數之和。
本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑。本發明所提供的檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試齊U，包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+、反轉錄酶和上述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物。所述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑中，所述簡并引物FIP-Hl、簡并引物BIP-Hl、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-Hl和簡并引物LB-Hl、所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述甜菜堿和所述反轉錄酶在所述擴增試劑中的配比可為I. 6 u mo I所述簡并引物FIP-Hl、I. 6 u mo I所述簡并引物BIP-HU0. 2iimol所述簡并引物F3_H1、0. 2 y mol所述簡并引物B3-H1、0. 8 u mo I所述簡并引物LF-H1、0. 8 u mo I所述簡并引物LB-H1、Immol所述dATP、Immol所述dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol 所述 dTTP、6mmol 所述 Mg2+ 和 Immol 所述甜菜喊。所述簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-Hl和簡并引物LB-Hl的摩爾數均是指簡并引物中各種單鏈DNA的總摩爾數。所述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑中，所述鏈置換型DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶大片段；所述反轉錄酶可為M-MLV反轉錄酶。所述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑還可包括突光顯色劑。進一步，所述突光顯色劑可為每I試劑由Iii I濃度為625iimol/L的隹丐黃綠素溶液、I U I濃度為12. 5mmol/L MnCl2的溶液和2 U I滅菌超純水組成。本發明所要解決的再一個技術問題是提供一種檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒。本發明所提供的檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒，包括上述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物或上述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑。進一步，所述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒還可包括陽性對照和陰性對照。其中，陽性對照可為Hl亞型禽流感病毒RNA ;陰性對照可為滅菌超純水。另外，上述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物在制備檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑或試劑盒中的應用也屬于本發明的保護范圍。
上述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物和上述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑和檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒中，所述簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-Hl和簡并引物LB-Hl可分別單獨包裝或按照所述比例混合在一起。本發明所要解決的再一個技術問題是提供ー種檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物。本發明所提供的檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，由簡并引物FIP-H1 、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-H1、簡并引物LB-H1、簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物LF-N1、簡并引物LB-N1、簡并引物FIP-N2、簡并引物BIP-N2、簡并引物F3-N2、簡并引物B3-N2、簡并引物LF-N2和簡并引物LB-N2組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17和序列18。所述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物中，各簡并引物的摩爾比為1.6μπι01所述簡并引物FIP-Hl、1.6ymol所述簡并引物BIP-HU0. 2ymol簡并引物F3_H1、0. 2 μ mol簡并引物Β3_Η1、0· 8 μ mol簡并引物LF-HU O. 8 μ mo I簡并引物LB-H1、L 6 μ mol所述簡并引物FIP-N1、I. 6 μ mol所述簡并引物ΒΙΡ-Ν1、0· 2ymol簡并引物F3-N1、0. 2ymol簡并引物Β3_Ν1、0· 8 μ mol簡并引物LF-NU0. 8 μ mol簡并引物LB-N1、I. 6 μ mol所述簡并引物FIP-N2、I. 6 μ mol所述簡并引物ΒΙΡ-Ν2、0· 2 μ mol 簡并引物 F3_N2、0. 2 μ mol 簡并引物 Β3_Ν2、0· 8 μ mol 簡并引物 LF-N2 和
0.8 μ mol 簡并引物 LB-N2。本發明所要解決的另一個技術問題是提供ー種檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑。所述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑包括鏈置換型DNA聚合酶、甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+、反轉錄酶和所述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物。所述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑中包括三套獨立的試劑，分別為A、B、C。反應試劑A含有I. 6 μ mol所述簡并引物FIP-H1、
1.6 μ mol所述簡并引物ΒΙΡ-Η1、0· 2μπιο1所述簡并引物F3_H1、0. 2 μ mol所述簡并引物B3-HU0. 8ymol所述簡并引物LF-HU0. 8 μ mol所述簡并引物LB-HlUmmol所述dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol 所述 dTTP、6mmol 所述 Mg2+ 和 Immol 所述甜菜喊。反應試劑B含有I. 6 μ mol所述簡并引物FIP-Nl、I. 6 μ mol所述簡并引物BIP-Nl、
O.2 μ mol所述簡并引物F3-N1、0. 2 μ mol所述簡并引物Β3_Ν1、0· 8 μ mol所述簡并引物LF-NKO. 8 μ mol 所述簡并引物 LB-N1、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊。反應試劑C含有I. 6 μ mol所述簡并引物FIP-N2、I. 6 μ mol所述簡并引物BIP-N2、O. 2 μ mol所述簡并引物F3-N2、0. 2 μ mol所述簡并引物B3_N2、0. 8 μ mol所述簡并引物LF-N2、0. 8 μ mol 所述簡并引物 LB-N2、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊。上述試劑A和試劑B組合使用，可檢測HlNl亞型禽流感病毒。試劑A和試劑C組合使用，可檢測H1N2亞型禽流感病毒。所述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑中，所述鏈置換型DNA聚合酶可為Bst DNA聚合酶大片段；所述反轉錄酶可為M-MLV反轉錄酶。所述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑還可包括熒光顯色劑。進一步，所述熒光試劑可為每4 試劑由I 濃度為625 iimol/L的鈣黃綠素、I U I濃度為12. 5mmol/L的MnCl2和2 yl滅菌超純水組成。
本發明所要解決的再一個技術問題是提供一種檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒。本發明所提供的檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒，包括上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物或上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試齊U。進一步，所述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒還可包括陽性對照和陰性對照。其中，陽性對照可為HlNl亞型禽流感病毒RNA和H1N2亞型禽流感病毒RNA ;陰性對照可為滅菌超純水。另外，上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物在制備檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑或試劑盒中的應用也屬于本發明的保護范圍。上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，或上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑，或上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒均可采用下述I)或2)的方法進行制備I)上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，和上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試齊U，和上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的制備方法，均包括將所述成套引物中的所述簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-H1、簡并引物LB-H1、簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物LF-N1、簡并引物LB-N1、簡并引物FIP-N2、簡并引物BIP-N2、簡并引物F3-N2、簡并引物B3-N2、簡并引物LF-N2和簡并引物LB-N2分別單獨包裝的步驟；2)上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，和上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑，和上述檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑盒的制備方法，均包括制備如下3個單獨包裝的步驟a)將所述成套引物中的所述簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-H1、簡并引物LB-Hl按照所述比例混合在一起得到一個單獨包裝；
b)將所述成套引物中的所述簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物LF-N1、簡并引物LB-Nl按照所述比例混合在一起得到一個單獨包裝；c)將所述成套引物中的所述簡并引物FIP-N2、簡并引物BIP-N2、簡并引物F3-N2、簡并引物B3-N2、簡并引物LF-N2和簡并引物LB-N2按照所述比例混合在一起得到一個單獨包裝本發明通過比較分析大量的Hl亞型AIV-HA基因序列、NI亞型AIV-NA基因序列和N2亞型AIV-NA基因序列，設計了 9對特異性引物，TRIZOL法或用RNA提取試劑盒提取感染家禽喉氣管、泄殖腔棉拭子及組織樣品的總RNA，在反轉錄酶和Bst DNA聚合酶作用下，于水浴鍋63°C反應45分鐘，一步法進行反轉錄和環介導等溫擴增，80°C作用5min終止反應。本發明在反應前向反應試劑中添加入熒光試劑(Calcein和MnCl2的混合液)，反應結束后可直接通過肉眼在可見光或365nm波長紫外線照射下觀察反應液的顏色變化來判定結果，實現了 RT-LAMP反應結果的可視化觀察同時也避免了打開反應管蓋后引起環境污染而造成下次實驗的假陽性結果。反應開始之前鈣黃綠素(Calcein)與熒光淬滅劑錳離子結合而不發熒光，反應液為淺桔色。隨著反應的擴增，產生大量的焦磷酸根離子，而焦磷酸根離子更易與錳離子結合從而釋放了鈣黃綠素。游離的鈣黃綠素就可自發熒光，鎂離子還可以加強這種熒光效果，陽性反應液肉眼可見顏色變綠，在紫外線照射下可激發綠色熒光。實驗證明，本發明的檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒、或HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物、試劑和試劑盒可特異性地檢測Hl亞型禽流感病毒，而對其它亞型禽流感病毒、呼吸道病原體無交叉反應，針對Hl亞型禽流感病毒HA基因的RT-LAMP方法最少可以檢測到IOfg的禽流感病毒總RNA，靈敏度是常規RT-PCR方法的1000倍。針對HlNl、H1N2亞型禽流感病毒NA基因的RT-LAMP方法最少可以檢測到IOOfg的禽流感病毒總RNA，靈敏度是常規RT-PCR方法的100倍。RT-LAMP方法對臨床樣品的檢出率與經典的雞胚分離方法一致，但略高于常規RT-PCR方法。本發明特異性強、靈敏度高、儀器設備及操作簡單、結果便于觀察，尤其適合在基層獸醫站、養殖場及邊境ロ岸進行Hl亞型、HlNl亞型、H1N2亞型禽流感病毒的快速診斷和早期篩查。


圖I為RT-LAMP和RT-PCR方法檢測Hl亞型AIV-HA基因的靈敏度比較。圖中，M:100bp DNA分子量標準；其它從左至右分別為加入AIV總RNA含量為lng/2 μ 1,100pg/2 μ 1,10pg/2 μ I, lpg/2 μ I, IOOfg/2 μ I, IOfg/2 μ I 和 lfg/2y I 的管、陰性對照(NC)。其中A圖為可見光下RT-LAMP反應結果，B圖為365nm波長紫外線照射下RT-LAMP反應結果，C圖為RT-PCR的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為RT-LAMP和RT-PCR方法檢測HlNl亞型AIV-NA基因的靈敏度比較。圖中，M:100bp DNA分子量標準；其它從左至右分別為加入AIV總RNA含量為lng/2 μ I、100pg/2 μ I、10pg/2 μ I、lpg/2 μ I、100fg/2 μ I、10fg/2 μ I 和 If g/2 μ I 的 AIV 總RNA的管、陰性對照(NC)。其中A圖為可見光下RT-LAMP反應結果，B圖為365nm波長紫外線照射下RT-LAMP反應結果，C圖為RT-PCR的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為RT-LAMP和RT-PCR方法檢測H1N2亞型AIV-NA基因的靈敏度比較。
圖中，M:100bp DNA分子量標準；其它從左至右分別為加入AIV總RNA含量為lng/2 u I、100pg/2 u I、10pg/2 u I、lpg/2 u I、100fg/2 u I、10fg/2 u I 和 lfg/2 u I 的 AIV 總RNA的管、陰性對照(NC)。其中A圖為可見光下RT-LAMP反應結果，B圖為365nm波長紫外線照射下RT-LAMP反應結果，C圖為RT-PCR的1%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖4為檢測Hl亞型AIV-HA基因的RT-LAMP引物在模板基因(A/Duck/Guangxi/030D/2009 (HlNl)HA 基因)的具體位置。其中 Flc-HU LF-HU B2-H1、B3-H1 引物序列與模板基因序列反向互補。FIP-Hl引物由Flc-Hl和F2-H1引物組成，BIP-Hl引物由Blc-Hl和B2-H1引物組成圖5為檢測HlNl亞型AIV-NA基因的RT-LAMP引物在模板基因(A/Duck/Guangxi/030D/2009 (HlNl) NA 基因)的具體位置。其中 Flc-NU LF-NU B2-N1、B3-N1 引物序列與模板基因序列反向互補。FIP-Nl引物由Flc-Nl和F2-N1引物組成，BIP-Nl引物由Blc-Nl和B2-N1引物組成。圖6為檢測H1N2亞型AIV-NA基因的RT-LAMP引物在模板基因(A/Duck/Guangxi/D/2011 (H1N2)NA基因)的具體位置。其中Flc-N2、LF-N2、B2-N2、B3_N2引物序列與模板基因序列反向互補。FIP-N2引物由Flc-N2和F2-N2引物組成，BIP-N2引物由Blc_N2和B2-N2引物組成。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中的毒株或毒株核酸樣品公眾均可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得，除A/Duck/Guangxi/D/2011 _2)記載在GenBank外(登錄號JQ904458，在該登錄號中的名稱為A/duck/Guangxi/D/2011 (H1N2),其它均記載在如下文獻中Yi Peng, et al. Visual detectionof H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay. Virology Journal, 2011，8:337。實施例I、成套引物本實施例的檢測或輔助檢測Hl、HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，由檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物、檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物和檢測或輔助檢測N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物這三套引物組成。其中，檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，由簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-Hl和簡并引物LB-Hl組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6 (表I)。其中，F3-H1和B3-H1為外引物，FIP-Hl和BIP-Hl為內引物，LF-Hl和LB-Hl為環引物。各引物在HlNl亞型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/030D/2009 (HlNl) HA 基因中的位置見圖 4。檢測或輔助檢測NI亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，由簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物LF-Nl和簡并引物LB-Nl組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12 (表I)。其中，F3-N1和B3-N1為外引物，FIP-Nl和BIP-Nl為內引物，LF-Nl和LB-Nl為環引物。各引物在HlNl亞型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)NA基因中的具體位置見圖5。檢測或輔助檢測N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，由簡并引物FIP-N2、簡并引物BIP-N2、簡并引物F3-N2、簡并引物B3-N2、簡并引物LF-N2和簡并引物LB-N2組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列13、序列14、序列15、序列16、序列17和序列18 (表I)。其中，F3-N2和B3-N2為外引物，FIP-N2和BIP-N2為內引物，LF-N2和LB-N2為環引物。各引物在H1N2亞型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/D/2011 (H1N2)NA基因中的具體位置見圖6。表IRT-LAMP引物序列

權利要求
1.檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，由簡 并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-H1、簡并 引物LB-H1、簡并引物FIP-N1、簡并引物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引 物LF-N1、簡并引物LB-N1、簡并引物FIP-N2、簡并引物BIP-N2、簡并引物F3-N2、簡并引物 B3-N2、簡并引物LF-N2和簡并引物LB-N2組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列 I、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序 列13、序列14、序列15、序列16、序列17和序列18。
2.根據權利要求I所述的成套引物，其特征在于所述成套引物中，各簡并引物的摩爾 比為I. 6 u mo I所述簡并引物FIP-Hl、1.6iimol所述簡并引物BIP_H1、0. 2 y mol所述簡并 引物F3-HU0. 2 u mo I所述簡并引物B3-HU0. 8 u mo I所述簡并引物LF-HU 0. 8mol所述簡 并引物LB-H1U. 6iimol所述簡并引物FIP_N1、1. 6 y mol所述簡并引物BIP_N1、0. 2 y mol 所述簡并引物F3-N1、0. 2 ii mol所述簡并引物B3-N1、0. 8 y mol所述簡并引物LF-Nl、0.8u mo I所述簡并引物LB-Nl、1.6iimol所述簡并引物FIP-N2、I. 6 y mol所述簡并引物 BIP-N2.0. 2umol所述簡并引物F3_N2、0. 2 y mol所述簡并引物B3_N2、0. 8mol所述簡并引 物LF-N2和所述0. 8 ii mol簡并引物LB-N2。
3.檢測或輔助檢測HlNl和H1N2亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑或試劑 盒，其特征在于所述試劑或試劑盒包括甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+和權利要求 I或2所述的成套引物。
4.根據權利要求3所述的試劑或試劑盒，其特征在于所述試劑或試劑盒中包括三 套獨立包裝的試劑，分別為反應試劑A、反應試劑B和反應試劑C ;所述反應試劑A含有1.6 u mo I所述簡并引物FIP-Hl、1.6iimol所述簡并引物BIP_H1、0. 2 y mol所述簡并引物 F3-H1、0. 2iimol所述簡并引物B3-Hl、0.8iimol所述簡并引物LF-Hl、0.8iimol所述簡并弓丨 物 LB-Hl、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol 所述 dTTP、6mmol 所述 Mg2+和Immol所述甜菜堿；所述反應試劑B含有1.6 iimol所述簡并引物FIP-Nl、1.6 iimol所述簡并引物BIP-Nl、 0. 2 u mol所述簡并引物F3-N1、0. 2 u mo I所述簡并引物B3_N1、0. 8 u mol所述簡并引物 LF-Nl >0. 8 u mo I 所述簡并引物 LB-N1、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、 Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊；所述反應試劑C含有I. 6iimol所述簡并引物FIP-N2、1. mol所述簡并引物BIP-N2、 0. 2 u mol所述簡并引物F3-N2、0. 2 u mo I所述簡并引物B3_N2、0. 8 u mol所述簡并引物 LF-N2、0. 8 u mo I 所述簡并引物 LB-N2、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、 Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊。
5.檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，由簡并引物 FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-Hl和簡并引物 LB-Hl組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5和序 列6。
6.根據權利要求5所述的成套引物，其特征在于所述成套引物中，各簡并引物的摩爾 比為I. 6 u mo I所述簡并引物FIP-Hl、1.6 ii mo I所述簡并引物BIP_H1、0. 2 y mol簡并引物 F3-HU0. 2umol 簡并引物 B3-HU0. 8umol 簡并引物 LF-Hl 和 0. 8 u mo I 簡并引物 LB-Hl
7.檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的逆轉錄環介導等溫擴增試劑或試劑盒，其特 征在于所述試劑或試劑盒均包括甜菜堿、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+和權利要求5或 6所述的成套引物。
8.根據權利要求7所述的試劑或試劑盒，其特征在于所述試劑或試劑盒中均含有 I. 6 μ mo I所述簡并引物FIP-HU1. 6 μ mo I所述簡并引物ΒΙΡ_Η1、0· 2 μ mo I所述簡并引物 F3-H1、0. 2 μ mol所述簡并引物Β3-Η1、0· 8 μ mol所述簡并引物LF-H1、0. 8 μ mol所述簡并引 物 LB-Hl、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol 所述 dTTP、6mmol 所述 Mg2+和Immol所述甜菜堿。
9.如下I)或2)的應用1)權利要求I或2所述成套引物在制備檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環介 導等溫擴增試劑或試劑盒中的應用；2)權利要求5或6所述成套引物在制備檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導 等溫擴增試劑或試劑盒中的應用；進一步，所述檢測或輔助檢測HlNl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增試劑或試劑盒 具體可為權利要求3或4所述的試劑或試劑盒；進一步，所述檢測或輔助檢測Hl亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增試劑或試劑盒具 體可為權利要求7或8所述的試劑或試劑盒。
10.如下I)或2)或3)的制備方法1)權利要求I或2所述成套引物或權利要求3或4所述的試劑或試劑盒的制備方法， 均包括將權利要求I或2所述成套引物中的所述簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并 引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-H1、簡并引物LB-H1、簡并引物FIP-N1、簡并引 物BIP-N1、簡并引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物LF-N1、簡并引物LB-N1、簡并引物 FIP-N2、簡并引物BIP-N2、簡并引物F3-N2、簡并引物B3-N2、簡并引物LF-N2和簡并引物 LB-N2分別單獨包裝的步驟；2)權利要求I或2所述成套引物或權利要求3或4所述的試劑或試劑盒的制備方法， 均包括制備如下3個單獨包裝的步驟a)將權利要求I或2所述成套引物中的所述簡并引物FIP-Hl、簡并引物BIP-Hl、簡并 引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-Hl、簡并引物LB-Hl按照所述比例混合在一起得 到一個單獨包裝；b)將權利要求I或2所述成套引物中的所述簡并引物FIP-Nl、簡并引物BIP-Nl、簡并 引物F3-N1、簡并引物B3-N1、簡并引物LF-Nl、簡并引物LB-Nl按照所述比例混合在一起得 到另一個單獨包裝；c)將權利要求I或2所述成套引物中的所述簡并引物FIP-N2、簡并引物BIP-N2、簡并 引物F3-N2、簡并引物B3-N2、簡并引物LF-N2和簡并引物LB-N2按照所述比例混合在一起 得到再一個單獨包裝；3)權利要求5或6所述成套引物或權利要求7或8所述的試劑或試劑盒的制備方法， 均包括將權利要求5或6所述成套引物中的所述簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并 引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-Hl和簡并引物LB-Hl分別單獨包裝或按照所述 比例混合在一起的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種H1亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測或輔助檢測H1亞型禽流感病毒的環介導等溫擴增成套引物，該成套引物由簡并引物FIP-H1、簡并引物BIP-H1、簡并引物F3-H1、簡并引物B3-H1、簡并引物LF-H1和簡并引物LB-H1組成，它們的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本發明特異性強、靈敏度高、儀器設備及操作簡單、結果便于觀察，尤其適合在基層獸醫站、養殖場及邊境口岸進行H1亞型禽流感病毒的快速診斷和早期篩查。
文檔編號C12Q1/70GK102649983SQ20121014755
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者劉加波, 龐耀珊, 彭宜, 范晴, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所