專利名稱：單細胞陣列微芯片及其制造、電測量和電穿孔方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及一種單細胞陣列微芯片及其制造、電測量和電穿孔方法。
背景技術：
細胞是生命活動的基本単元，細胞測量和分析已引起科學界和醫療領域的極大關注。細胞測量一般包括生物力學測量、電學測量、運動行為和物理化學特性測量等，采用的測量方法主要有顯微觀察、電化學測量、光學測量等，其中顯微觀察和光學測量常常需要對細胞進行化學或者熒光標記，其操作復雜、功能単一，并在一定程度上改變了細胞原有的特質。而電化學測量則不需要標記，對細胞無損傷，能夠對細胞在自然培養狀態下連續、實時測量，具有比常規化學方法更高的靈敏度、測量可以全自動進行、無需人工干預等諸多優勢。
電化學測量技術中，為實現單細胞原位精細測量，細胞定位必不可少，在眾多微操作技術中，介電泳(dielectrophoresis,DEP)被廣泛用于各種細胞、病毒、DNA等研究,成為生命科學領域研究細胞和生物分子不可或缺的有效工具。現有的有關細胞電測量技術的器件通常不對細胞進行定位，由于細胞分布的隨機性，其電測量的效率較低、精度差；且現有的細胞電穿孔技術通常不對細胞進行定位、測量，由于細胞分布的隨機性，其電穿孔的效率低、精度差、細胞死亡率高、可控性不好。

發明內容
(一 )要解決的技術問題本發明要解決的技術問題是提供一種單細胞陣列微芯片及其制造、電測量和電穿孔方法，其能夠有效提高單細胞的電測量效率、精度，并可提升單細胞的電穿孔效率和可控性、降低細胞死亡率。( ニ )技術方案為解決上述問題，本發明提供了一種單細胞陣列微芯片，包括基底、陣列式的多個定位微電極、陣列式的多個電測量微電極對和樣品池微腔體，其中，每相鄰的四個定位微電極構成ー個排列呈菱形的定位単元；所述陣列式的多個定位微電極中的每一行定位微電極通過橫向電極連線連接，或者，所述陣列式的多個定位微電極中，每個排列呈菱形的定位単元中的兩個相対的定位微電極分別通過橫向電極連線和縱向電極連線與相鄰定位單元中的定位微電極連接；所述定位単元的中心位置分布有ー電測量微電極對，所述電測量微電極對中的兩個電極分別通過橫向電極連線和縱向電極連線與相鄰電測量微電極對中的電極連接。前述的單細胞陣列微芯片中，所述橫向電極連線和縱向電極連線分別布置在兩層連線層中，兩連線層之間由絕緣層隔開。前述的單細胞陣列微芯片中，所述基底為絕緣材料或上覆有絕緣層的硅材料。
前述的單細胞陣列微芯片中，所述樣品池微腔體為聚合物材料。ー種前述的單細胞陣列微芯片的制造方法，包括以下步驟A :在絕緣的基底上沉積第一層金屬層并刻蝕，使所述第一層金屬層上形成縱向電極連線；B :沉積第一層絕緣層并刻蝕，使所述第一層絕緣層上露出電極窗ロ ；C :沉積第二層金屬層并刻蝕，使所述第二層金屬層上形成橫向電極連線；D :沉積第二層絕緣層并刻蝕，使所述第二層絕緣層上露出電極窗ロ ；E :沉積第三層金屬層并刻蝕，使所述第三層金屬層上形成定位微電極和電測量微電極對；
F :黏附樣品池微腔體。ー種利用前述單細胞陣列微芯片對細胞進行電測量的方法，包括以下步驟SI :將細胞溶液放入樣品池微腔體中；S2 :向定位微電極施加交流信號，細胞在負的介電カ的作用下向電場中場強較低的位置運動；S3:采用橫、縱向掃描的方式，遍歷由多個電測量微電極對構成的陣列，分別對每個電測量微電極對中的兩電極施加電壓，測量兩電極間的電流信號；S4:根據測得的每個電測量微電極對中的兩電極間的電流信號，判斷電測量微電極對中的電極處是否有細胞被定位；S5 :分別對電極處定位有細胞的電測量微電極對中的兩電極施加電壓，測量兩電極間的電流信號，完成對細胞的電測量。前述的對細胞進行電測量的方法中，所述步驟S4進ー步包括提前通過實驗標定電測量微電極對中兩電極間的在細胞被定位和細胞未被定位時的電流范圍，根據測得的電測量微電極對中兩電極間的電流所對應的電流范圍判斷細胞是否被定位。ー種利用前述單細胞陣列微芯片對細胞進行電穿孔的方法，包括以下步驟Sll :將細胞溶液放入樣品池微腔體中；S22 :向定位微電極施加交流信號，細胞在負的介電カ的作用下向電場中場強較低的位置運動；S33:采用橫、縱向掃描的方式，遍歷由多個電測量微電極對構成的陣列，分別對每個電測量微電極對中的兩電極施加電壓，測量兩電極間的電流信號；S44:根據測得的電測量微電極對中兩電極間的電流信號，判斷電測量微電極對中的電極處是否有細胞被定位；S55 :分別對電極處定位有細胞的電測量微電極對中的兩電極施加脈沖電壓信號，實現對被定位在電測量微電極對的電極處的細胞的電穿孔。前述的對細胞進行電穿孔的方法中，所述步驟S44進ー步包括提前通過實驗標定電測量微電極對中兩電極間的在細胞被定位和細胞未被定位時的電流范圍，根據測得的電測量微電極對中兩電極間的電流所對應的電流范圍判斷細胞是否被定位。(三)有益效果本發明將細胞定位與細胞電測量和電穿孔相結合，采用無標記、無損傷的微操縱、定位和參數測量分析技術，可實現單細胞陣列、多模式的原位在線測量和分析；由于定位后的細胞位置固定，可有效提高細胞的電學檢測精度，并可提升細胞的電穿孔效率、降低細胞死亡率。本發明還可將自動化控制技術引入細胞微操縱和電測量中，通過電測量反饋進行細胞定位的自動控制，最終可實現快速、精確和多模式的細胞自動化測量和分析。


圖I為本發明所述單細胞陣列微芯片的電極結構示意圖；圖2為本發明實施例I中單細胞陣列微芯片的電極連線結構示意圖；圖3為本發明實施例2中單細胞陣列微芯片的電極連線結構示意圖；圖4a_4f為本發明實施例3中所述單細胞陣列微芯片的制作エ藝的流程圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式
作進ー步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例I :如圖1-2所示，本發明提供了一種單細胞陣列微芯片，包括基底I、陣列式的多個定位微電極2、陣列式的多個電測量微電極對3和樣品池微腔體4，其中，每相鄰的四個定位微電極2構成ー個排列呈菱形的定位単元，所述定位単元的中心位置分布有ー電測量微電極對3 ;每一行定位微電極2通過橫向電極連線5連接，所述電測量微電極對3中的兩個電極分別通過橫向電極連線5和縱向電極連線6與相鄰電測量微電極對3中的電極 連接。所述橫向電極連線5和縱向電極連線6分別布置在兩層連線層中，兩連線層之間由絕緣層隔開。所述基底I為絕緣材料(如玻璃)或上覆有絕緣層的硅材料。所述樣品池微腔體4為PDMS聚合物材料。所述絕緣層為氮化硅、ニ氧化硅或聚合物材料。所述樣品池微腔體4可采用模具制作而成。電測量微電極對3的橫向電極連線通過焊盤14電輸入和電輸出，電測量微電極對3的縱向電極連線通過焊盤15電輸入和電輸出；定位微電極2的橫向電極連線通過焊盤16電輸入。實施例2 :如圖3所示，本實施例與實施例I不同的是，所述排列呈菱形的每個定位単元中的兩個相対的定位微電極2，分別通過橫向電極連線5和縱向電極連線6與相鄰定位單元中的定位微電極2連接。實施例3 :—種前述的單細胞陣列微芯片的制造方法，包括以下步驟A :在絕緣的基底I上沉積第一層金屬層并刻蝕，使所述第一層金屬層上形成縱向電極連線6 ；B :沉積第一層絕緣層并刻蝕，使所述第一層絕緣層上露出電極窗ロ ；C :沉積第二層金屬層并刻蝕，使所述第二層金屬層上形成橫向電極連線5 ；D :沉積第二層絕緣層并刻蝕，使所述第二層絕緣層上露出電極窗ロ ；E :沉積第三層金屬層并刻蝕，使所述第三層金屬層上形成定位微電極2和電測量微電極對3 ；F :黏附樣品池微腔體4。如圖4a_圖4f所示，本實施例提供了一種單細胞陣列微芯片的具體制作エ藝，其采用玻璃片作為基底，然后沿同一方向在所述基底上順序進行如下エ藝步驟步驟(a):在玻璃基底I上濺射ー層鈦/金(Ti/Au)薄膜形成第一層金屬層7，通過光刻圖形化該金屬層形成電測量微電極對的縱向電極連線6 ；步驟(b):沉積ー層SiO2薄膜8，刻蝕絕緣層露出電極(或焊盤)窗ロ 9 ;步驟(c):濺射第二層金屬層鈦/金(Ti/Au)薄膜10，通過光刻圖形化該金屬層形成橫向電極連線5 ；步驟(d):沉積第二層Si02薄膜11，刻蝕絕緣層露出電極(或焊盤)窗ロ 12;
步驟(e):濺射第三層金屬層鈦/金(Ti/Au)薄膜13，通過光刻圖形化該金屬層形成定位微電極2、電測量微電極對3和焊盤14、15、16、17 ；步驟(f):將樣品池微腔體4黏附在芯片上，使得陣列式定位微電極2和電測量微電極對3位于樣品池微腔體4內，焊盤14、15、16、17位于樣品池微腔體4外。實施例4 :ー種利用前述單細胞陣列微芯片對細胞進行電測量的方法，包括以下步驟SI :將細胞溶液放入樣品池微腔體4中；S2 :向定位微電極2施加交流信號，在相對電極上施加相同的正弦信號，在相鄰電極上施加相位相差180°的正弦信號；細胞在負的介電カ的作用下向電場中場強較低的位
置運動；S3:采用橫、縱向掃描的方式，遍歷由多個電測量微電極對3構成的陣列，分別對每個電測量微電極對3中的兩電極施加電壓，測量兩電極間的電流信號；S4 :根據測得的每個電測量微電極對3中的兩電極間的電流信號，判斷電測量微電極對3中的電極處是否有細胞被定位；本步驟中，需提前通過實驗標定電測量微電極對3中兩電極間的在細胞被定位和細胞未被定位時的電流范圍，根據測得的電測量微電極對3中兩電極間的電流所對應的電流范圍判斷細胞是否被定位。若測得的電測量微電極對3中兩電極間的電流落在電測量微電極對3中兩電極間的在細胞被定位時的電流范圍內，則有細胞被定位。若測得的電測量微電極對3中兩電極間的電流落在電測量微電極對3中兩電極間的在細胞未被定位時的電流范圍內，則細胞未被定位。S5 :分別對電極處定位有細胞的電測量微電極對3中的兩電極施加電壓，測量兩電極間的電流信號，完成對細胞的電測量。對測量電極施加的電壓可以是直流、交流或脈沖信號。實施例5 :—種利用前述單細胞陣列微芯片對細胞進行電穿孔的方法，包括以下步驟Sll :將細胞溶液放入樣品池微腔體4中；S22 :向定位微電極2施加交流信號，在相對電極上施加相同的正弦信號，在相鄰電極上施加相位相差180°的正弦信號,細胞在負的介電カ的作用下向電場中場強較低的位置運動；S33 :采用橫、縱向掃描的方式，遍歷由多個電測量微電極對3構成的陣列，對每個電測量微電極對3中的兩電極施加電壓，測量兩電極間的電流信號；
S44 :根據測得的電測量微電極對3中兩電極間的電流信號，判斷電測量微電極對3中的電極處是否有細胞被定位；本步驟中，需提前通過實驗標定電測量微電極對3中兩電極間的在細胞被定位和細胞未被定位時的電流范圍，根據測得的電測量微電極對3中兩電極間的電流所對應的電流范圍判斷細胞是否被定位。若測得的電測量微電極對3中兩電極間的電流落在電測量微電極對3中兩電極間的在細胞被定位時的電流范圍內，則有細胞被定位。若測得的電測量微電極對3中兩電極間的電流落在電測量微電極對3中兩電極間的在細胞未被定位時的電流范圍內，則細胞未被定位。S55 :分別對電極處定位有細胞的電測量微電極對3中的兩電極施加脈沖電壓信號，實現對被定位在電測量微電極對3的電極處的細胞的電穿孔。
以上實施方式僅用于說明本發明，而并非對本發明的限制，有關技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，還可以做出各種變化和變型，因此所有等同的技術方案也屬于本發明的范疇，本發明的專利保護范圍應由權利要求限定。
權利要求
1.一種單細胞陣列微芯片，其特征在于，包括基底(I)、陣列式的多個定位微電極(2)、陣列式的多個電測量微電極對(3)和樣品池微腔體(4)，其中，每相鄰的四個定位微電極(2)構成一個排列呈菱形的定位單元； 所述陣列式的多個定位微電極(2)中的每一行定位微電極(2)通過橫向電極連線(5)連接，或者，所述陣列式的多個定位微電極(2)中，每個排列呈菱形的定位單元中的兩個相對的定位微電極(2)分別通過橫向電極連線(5)和縱向電極連線(6)與相鄰定位單元中的定位微電極⑵連接； 所述定位單元的中心位置分布有一電測量微電極對(3)，所述電測量微電極對(3)中的兩個電極分別通過橫向電極連線(5)和縱向電極連線(6)與相鄰電測量微電極對(3)中的電極連接。
2.如權利要求I所述的單細胞陣列微芯片，其特征在于，所述橫向電極連線(5)和縱向電極連線(6)分別布置在兩層連線層中，兩連線層之間由絕緣層隔開。
3.如權利要求I所述的單細胞陣列微芯片，其特征在于，所述基底(I)為絕緣材料或上覆有絕緣層的硅材料。
4.如權利要求I所述的單細胞陣列微芯片，其特征在于，所述樣品池微腔體(4)為聚合物材料。
5.一種權利要求1-4中任一項所述的單細胞陣列微芯片的制造方法，其特征在于，包括以下步驟 A :在絕緣的基底(I)上沉積第一層金屬層并刻蝕，使所述第一層金屬層上形成縱向電極連線(6)； B :沉積第一層絕緣層并刻蝕，使所述第一層絕緣層上露出電極窗口 ； C :沉積第二層金屬層并刻蝕，使所述第二層金屬層上形成橫向電極連線(5)； D :沉積第二層絕緣層并刻蝕，使所述第二層絕緣層上露出電極窗口 ； E :沉積第三層金屬層并刻蝕，使所述第三層金屬層上形成定位微電極(2)和電測量微電極對⑶； F :黏附樣品池微腔體⑷。
6.一種利用權利要求1-4中任一項所述單細胞陣列微芯片對細胞進行電測量的方法，其特征在于，包括以下步驟 51:將細胞溶液放入樣品池微腔體(4)中； 52:向定位微電極(2)施加交流信號,細胞在負的介電力的作用下向電場中場強較低的位置運動； S3:采用橫、縱向掃描的方式，遍歷由多個電測量微電極對(3)構成的陣列，分別對每個電測量微電極對⑶中的兩電極施加電壓，測量兩電極間的電流信號； S4:根據測得的每個電測量微電極對(3)中的兩電極間的電流信號，判斷電測量微電極對(3)中的電極處是否有細胞被定位； S5:分別對電極處定位有細胞的電測量微電極對(3)中的兩電極施加電壓，測量兩電極間的電流信號，完成對細胞的電測量。
7.如權利要求6所述的對細胞進行電測量的方法，其特征在于，所述步驟S4進一步包括提前通過實驗標定電測量微電極對(3)中兩電極間的在細胞被定位和細胞未被定位時的電流范圍，根據測得的電測量微電極對⑶中兩電極間的電流所對應的電流范圍判斷細胞是否被定位。
8.一種利用權利要求1-4中任一項所述單細胞陣列微芯片對細胞進行電穿孔的方法，其特征在于，包括以下步驟 Sll :將細胞溶液放入樣品池微腔體(4)中； S22 :向定位微電極(2)施加交流信號,細胞在負的介電力的作用下向電場中場強較低的位置運動； S33:采用橫、縱向掃描的方式，遍歷由多個電測量微電極對(3)構成的陣列，分別對每個電測量微電極對⑶中的兩電極施加電壓，測量兩電極間的電流信號； S44:根據測得的電測量微電極對(3)中兩電極間的電流信號，判斷電測量微電極對(3)中的電極處是否有細胞被定位； S55:分別對電極處定位有細胞的電測量微電極對(3)中的兩電極施加脈沖電壓信號，實現對被定位在電測量微電極對(3)的電極處的細胞的電穿孔。
9.如權利要求8所述的對細胞進行電穿孔的方法，其特征在于，所述步驟S44進一步包括提前通過實驗標定電測量微電極對(3)中兩電極間的在細胞被定位和細胞未被定位時的電流范圍，根據測得的電測量微電極對⑶中兩電極間的電流所對應的電流范圍判斷細胞是否被定位。
全文摘要
本發明公開了一種單細胞陣列電測量微芯片，包括基底、陣列式的多個定位微電極、陣列式的多個電測量微電極對和樣品池微腔體，本發明還公開了單細胞陣列電測量微芯片的制造方法、以及利用該微芯片對細胞進行電測量和電穿孔的方法。本發明將細胞定位與細胞電測量和電穿孔相結合，采用無標記、無損傷的微操縱、定位和參數測量分析技術，實現單細胞陣列、多模式的原位在線測量和分析；由于定位后的細胞位置固定，可有效提高細胞的電學檢測精度，并可提升細胞的電穿孔效率、降低細胞死亡率。本發明還將自動化控制技術引入細胞微操縱和電測量中，通過電測量反饋進行細胞定位的自動控制，最終能夠實現快速、精確和多模式的細胞自動化測量和分析。
文檔編號C12M1/42GK102680526SQ20121015213
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月16日 優先權日2012年5月16日
發明者朱榮, 郭霄亮 申請人:清華大學