專利名稱：包含來自Cohn分級分離階段上清液的哺乳動物細胞培養基及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于哺乳動物細胞培養基的補充物。所述補充物從去纖維蛋白的人血漿(基本上無纖維蛋白原和纖維蛋白)獲得，當它作為補充物添加至培養基中時，其提供用于所培養細胞的令人滿意的維持和/或増殖的不同營養素和因子。
背景技術：
在生物技術エ業中使用細胞培養主要是產生重組蛋白和單克隆抗體。然而，在最近，已經發展了培養用于聯合或不聯合基因治療的細胞治療中的不同類型的核心細胞的技術。為了成功培養和維持不同細胞系，需要模擬這些細胞體內所存在于的內部介質的條件的培養基。通常，培養基可以由基礎培養基組成，基礎培養基提供pH、營養素和鹽并且可以向基礎培養基中加入一系列補充物以保證細胞増殖。最廣泛使用的補充物之一是動物血清。由于血清是動物來源的，可能會嚴重地限制了其用于獲得在人中使用的產品，原因在于動物來源的殘基作為外來抗原被識別并且可在接受者中引起不良反應。此外，動物血清具有缺乏確定成分的缺點，這是因為由于使用不同動物品系使得不同生產商之間存在大的差異性。此外，由于獲得它們的方法不同，在批次之間存在大的差異性，這意味著在生長能力和特定培養物的生產方面會發生廣泛的變化。在建立細胞系中的主要困難是獲得能夠替代天然培養基例如胚胎提取物、蛋白質水解物或血清的適宜營養培養基。第一組培養基，例如Eagle基礎培養基(MEM) (Eagle，H. (1955)" The specific aminoacid requirements of mammalian cells(strain L)intissue culture " . J. Biol. Chem. 214 :839)和更復雜的 Morgan 等的 199 培養基(Morgan,J. G. , Morton, J. H.和 Parker, R. C. (1950) " Nutrition of animal cells in tissueculture.I Initial studies on a synthetic medium" . Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73 1)是確定成分培養基，但是它們需要5%和20%之間的血清補充物。
為了消除成分不確定的復合培養基的作用，已經配制了更加復雜的培養基，例如 NCTC 109 (Evans, V. J. , Bryant, J. C. , Fioramonti, M. C. , McQuilkin, ff. Τ. , Sanford,K. K.和 Earle, W. R. (1956) " Studies of nutrient media for tissue C cells invitro. I A protein-free chemically defined medium for cultivation of strainL cells " Cancer Res. 16 :77)、135(Evans, V. J.和 Briant, J. C. (1965) " Advancesin tissue culture at the National Cancer Institute in the United States ofAmerica ",在"Tissue culture "中，由 C. V. Ramakrishnan, W. Junk 編，The Hague,第145-167 頁)、Ham FlO 和 F12((Ham, R. G. (1963). " An improved nutrient solutionfor diploid Chinese hamster and human cell lines " . Exp. Cell Res. 29 :515,Ham, R. G. (1965) " Clonal growth of mammalian cells in a chemically definedsynthetic medium " Proc. Natl. Sci. USA 53 :288)、MCDB 系列(Ham, R. G.和 McKeehan,ff. L. (1978)" Development of improved media and culture conditions for clonalgrowth of normal diploid cells " In vitro 14 :11-22)和補充激素的 Sato 培養基(Barnes,D.和Sato,G. (1980)" Methods for growth of cultured cells in serum-freemedium" Anal. Biochem. 102 :255-270)。為建立確定成分培養基的推薦方法是以補充有高濃度血清(20% )的豐富培養基例如Ham F12開始，并且測試用于減少血清量的補充物直到血清可以減少或者去除。在對培養基成分研究數年之后，對它們仍然是以經驗為主進行選擇。所使用的主要培養基以及它們的應用為、-Eagle基礎培養基(EBM)。這是僅具有必需氨基酸的基礎培養基。其總是需要補充10%胎牛血清。其用于小鼠成纖維細胞和HeLa細胞的生長。-Eagle極限必需培養基(MEM)。這是最常用的培養基，其包含比EBM更高濃度的更多氨基酸。其用于幾乎所有類型培養并且需要添加血清(10%)。-R. P.M. I. 1640。這是設計用于淋巴母細胞和白血病細胞系懸浮生長的培養基。添加適宜的補充物之后，其具有廣泛的應用。-Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)。其包含濃度4倍于EBM的氨基酸和維生素。其在補充HAT (次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷)或HT (次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷)后用于選擇雜交瘤。-Iscove改良DMEM(MDM)。這是非常完全的培養基，具有除了其他成分之外還包括牛白蛋白、轉鐵蛋白和亞硒酸鹽的配方。其在無血清培養基中的淋巴細胞培養中是十分有用的。其還用于其它細胞類型，但是在該情況下需要低濃度血清。-McCoy 5a培養基。設計用于大鼠和人二倍體細胞系的生長。-Leibovitz L-15培養基。用于病韋培養。-Ham F_10培養基。其用于人細胞系生長并且必須補充蛋白質和激素。其包含金屬，例如Fe、Cu和Zn。其用于羊水細胞培養。-HamF-12培養基。添加蛋白質補充物后，其用于細胞系生長。其與IMDM結合用
作無血清培養基。-培養基199。其極其廣泛地用于未分化細胞的培養并且用于研究染色體病癥。所有培養基包含下列成分I.平衡鹽溶液(BSS)。2.氨基酸。3.維生素。4.具有低分子量的其它有機補充物(核苷、三羧酸循環中間體、丙酮酸、脂類)。5.激素和生長因子(血清)。6.污染物生長抑制劑(抗生素和抗真菌劑)。在成分不確定培養基中，血清通常提供激素和生長因子。所使用的血清類型是小牛血清(CF)、胎牛血清(FCS)、馬血清(HS)和人血清(HuS)。最廣泛使用的是小牛血清，而胎牛血清用于要求更高的細胞系并且人血清用于人細胞系。血清的使用是有疑問的，因為盡管血清成分部分地已知，但具有以不定量存在的、會明顯影響培養的非常多的成分。此外，血清在批次與批次之間不同，這是由于獲得血液的技術、獲得血清的方法(血液凝固)和分離血清的條件的差異以及各血清來源之間的差異造成的。此外，血清批次的每ー變化需要一系列冗長且昂貴的檢查。此外，如果培養基產物不得不純化的話，血清中不定成分的存在使得這些過程明顯更加困難。ー些血清因子，例如血小板衍生生長因子(TOGF)，刺激成纖維細胞増殖，這在建立專門的原代培養中成為ー個難題，特別是當它們的含量廣泛變化時更是如此。
總體上看，在培養基中包含血清對于試驗方案和細胞生產標準化而言是ー個重大的缺點。因此，正投入巨大的精力來建立用于細胞生長的具有確定成分的培養基。除了所尋找的重現性之外，這還使得建立所需要的細胞類型在其中可以生長的選擇性培養基。這些培養基的缺點是在許多情況下細胞生長更低并且細胞系的存活力僅保留了少數幾代。已經做出多種嘗試以產生用于細胞培養基的、避免出現因當前使用血清所引起的問題的補充物。在其中，已經測試了來自人血漿的多個級分，并且在現有技術中對不同人血漿級分的有用性存在明顯的矛盾。一般而言，已經測試了源自使用Cohn法(Cohn E. J.等；J Am Chem Soc, 1946)及其變化方法(Kistler 和 Friedli, Nischmann ；Curling, JM 編，Methods of plasmafractionation,Academic Press 1980)的血衆分級分離的不同人血衆級分,所有這些測試均涉及使用在分級分離中獲得的不同沉淀物，特別是該分級分離方法的不同的變化方法中的11+111、III、IVdV1或IV4)和V級分或者它們的等效物。分離上述級分(沉淀物)的最初目標是獲得富含特定蛋白質的、作為用于所述蛋白質純化的起始點的沉淀物，所述特定蛋白質例如對于Π+ΙΙΙ或III級分的Y-球蛋白和α和球蛋白、在IV級分中的α-球蛋白和轉鐵蛋白以及在V級分中的白蛋白。因此，這些級分通常具有單ー類型的蛋白質，其他蛋白質作為雜質存在，通常以小得多的量存在。這些級分在細胞培養中的使用包括向培養基加入主要的蛋白質類型和作為雜質伴隨的多種蛋白質，如果所述物質的使用是成功的，則在這當中一定存在在培養基中的細胞所需要的那些。時至今日，這還是補充細胞培養基的一個明顯但無效率的方式。這一定是造成所獲得結果存在差異的原因，因為對分級分離方法的小的改動不會明顯影響主要蛋白質的回收，但是會在回收多種伴隨蛋白質中帶來巨大差異。例如，使用Cohn法在20%和25%之間的こ醇濃度、_5°C和6. 9的pH下獲得II+III級分。使用Nitschmann方法，以等效物質開始，其在19%的こ醇濃度、-5°C和5. 8的pH下被沉淀。pH的這種改變使得所獲得的級分具有不同的特性，特別是在Y-球蛋白和其它伴隨蛋白質的含量上不同。此外，與沉淀級分的使用相比，上清液的使用具有另外的優點，包括維持培養基中高白蛋白濃度，以及最重要的是避免成分(例如激素、細胞因子、脂質等)的損失，所述成分對于細胞生長是重要的，并且不會存在于沉淀物中或者在超過20%的醇濃度存在下失去它們的功能性(被失活)，例如用于在一定條件下(25% )沉淀II+III級分或者沉淀IVJIV4和V級分所使用的濃度(40 %こ醇)。文獻EP0143648 (Macleod)描述了 IRnKIIKIV1和IV4級分作為代替動物血清的培養基補充物的用途。其還闡述了 II級分和V級分皆不能用于該應用中。在所有情況中，該文獻排他性地提到了 Cohn分級分離或其變體中沉淀的級分。此外，該文獻公開了用于從上述級分中獲得適宜補充培養基的物質的方法。該方法基本上由在水中懸浮沉淀物并且將所述沉淀物勻化組成。接著，調節PH以達到更好的蛋白質溶解并產生細胞生長的生理條件。此外，該方法還考慮了通過以聚こニ醇沉淀消除存在的Y-球蛋白和通過分子排斥層析分離低分子量的物質。因此，以該方式制備的物質的有效性極其依賴于特定制備方法。Macleod 的另一篇文獻(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 37 ；1988)表明II、III和IV級分對細胞生長具有少的影響或者沒有影響，這可能歸因于生長抑制劑的存在，并且還將注意力集中在作為補充物培養基的理想物質的IV4級分。EP O 440 509 (Macleod)描述了基于Cohn法IV級分或II+III級分的用于細胞培養基的補充物，以及用于獲得它的方法。使用所述的方法，獲得了基本上無免疫球蛋白、病毒滅活的和穩定的產物。免疫球蛋白通過聚こニ醇沉淀加以分離，并且病毒通過巴氏消毒 法在作為穩定劑的山梨糖醇存在下滅活。該方法特別適用于Ivav1或iv4)級分。文獻EP 0264748 (Antoniades)描述了作為代替動物血清的細胞培養基補充物的Cohn V級分的上清液。根據該文獻，該物質的優點是沒有成本并且它可以加熱至60°C達20小吋。V級分的上清液是來自Cohn分級分離的最終廢物并且因此它們的使用顯然沒有經濟成本，未減損所述分級分離的益處。該物質具有高こ醇含量(40%)，這具有高的毒性，并且該文獻沒有闡明的這一點必須被消除。此外，對于在60°C下的所述處理，所存在的蛋白質將必須被穩定化，但是該細節也從該文獻省略了，使得該發明難以入所述產生。在該情況下如此高濃度こ醇的變性效應也不應該被低估。WO 94/18310 (Mankarious)描述了從Cohn IV4級分產生用于細胞培養基的補充物的方法。該方法考慮IV4級分的懸浮和隨后的浄化，并且還考慮通過巴氏消毒法和/或過濾滅活或消除病毒。專利GB 2 166 756 A描述了用于培養生產干擾素的脾細胞的方法。該方法基于RPMI培養基，其補充有從已經除去纖維蛋白原并且特征在于前清蛋白和Y球蛋白已經被去除的血清或血漿獲得的血清級分(第I頁，第30-34行)。在優選實施方案中，該級分通過用10%和20%之間的醇在pH 5. 85下沉淀來純化(第I頁，第37-38行)。在具體實施方案中(獲得EPF級分)，用作培養基的上清液在19%的こ醇濃度和pH 5. 85下獲得(第2頁，第44-45行)。透析所獲得的上清液以除去こ醇，然后凍干以便保存。任選地，其被凍干而沒有經過先前透析以及隨后也沒有去除こ醇。根據發明人所述，通過使用補充所述級分的培養基(RPMI)，獲得了極好的干擾素生產。在血漿的醇沉淀中，必須仔細設置エ藝條件(こ醇濃度、pH、培養基的離子強度、溫度和蛋白質濃度)以維持溶液中的特定蛋白質并且使其他物質不溶解以便其他物質被沉淀并因此被分離。ー個或ー個以上所述條件的變化將使所獲得的產物明顯不同，其中こ醇濃度和PH是決定所獲得的沉淀物和上清液組成的因素。還做出了其它嘗試以使用人來源的血清或血清級分代替胎牛血清來補充細胞培養基，如文獻WO 2004/055174,EP 1820852或CA 1177424中所示。從全血或者從血漿獲得的血清不能與明確確定成分的和表征的血漿級分相比，并且具有在不同批次之間缺乏再現性的缺點。此外，這些文獻中沒有ー個在限定和表征所使用物質的確切組成成分中取得成功。因此，與使用動物來源血清相關的大多數問題繼續出現。Kwok等描述了來自孕婦的血漿代替胎牛血清用于培養特定細胞類型的用途，其效果被歸因于未知因子的存在。他還假定人白蛋白在該類型培養中具有協同效應。本領域技術人員明白，使用來自孕婦的血漿目的是尋找與胎兒血清中的那些細胞生長因子相當的細胞生長因子的存在，但是該物質的同質性與來自成千上萬的供體的血漿混合物不能相比，如下面所述。如上面所述，對于作為細胞培養基補充物來替代動物血清已經做出眾多嘗試。這些嘗試中的一些嘗試了人血漿級分，特別是使用Cohn法的級分。盡管如此，當前動物血清繼續廣泛用作哺乳動物細胞培養基的補充物，而對使用人血漿衍生物替代它的嘗試已經失敗。 從上面所有情況可以推斷出，在現有技術，沒有這樣的人源物質可利用，其可用于補充細胞培養基并且其就病原體傳播而言是安全的、可以以可接受的成本和利潤以エ業規模獲得、在各個批次之間具有足夠的一致性以及具有藥物級質量。

發明內容
發明人開展了 g在以人血漿級分替代動物來源血清作為培養基補充物的研究，并且令人驚奇的是他們已經發現，從Cohn分級分離上清液、特別是II+III級分上清液或者I級分上清液開始，能夠補充細胞培養基并且就細胞生長而言得到優異的結果。該物質的使用解決了上述問題，因為它是人源的、使用具有可接受成本與利潤的優良制造規范(GMP)エ業獲得的、顯示了足夠一致性和批次間再現性、以及具有藥物級質量。此外，該物質可以通過避免病原體傳播的方法處理。用于制備這些衍生物的方法在下文描述。首先，從健康供體獲得人血漿，向血漿中以保證血漿不凝固的足夠的量加入僅包含在本發明中優選使用的檸檬酸鈉的抗凝劑溶液。為改善血細胞的保存而加入一些物質(例如碳水化合物如葡萄糖)不是必須的，因為在本發明中使用的血漿是基本上無細胞的，這已有可能通過抗凝劑存在下的血漿去除術獲得，而不是通過全血捐贈。抗凝劑的量和獲得、儲存和處理人血漿所必須滿足的其他標準描述于公眾可獲得的影響人血漿分級分離エ業的國際標準中，例如美國聯邦法規、美國食品和藥品管理局(FDA)和歐洲藥品評價局(EMEA)的指令和標準、以及國際協調大會(ICH)和國際藥典如歐洲、日本或美國藥典的指令和標準以及稱作現行優良制造規范(cGMP)的標準。在本文件的其余部分，所有這些標準將被稱作“用于制藥目的的影響人血漿分級分離的標準組”。該組標準也適用于下文所述的本發明的階段。一旦已經獲得人血漿，按照用于制藥目的的影響人血漿分級分離的標準組，并且在本發明的優選使用中尤其根據歐洲藥典專著0853的要求，冷凍、儲存和運輸人血漿。分析每ー血漿單位(捐贈物)以排除先前經過問卷和按照上述標準進行體格檢查的供體中病毒感染標志物的存在。在本發明的優選應用中，不使用可能存在病毒感染標志物的供體的血漿，直到供體在六個月內經受兩次評定過程，并且到那時供體變成了 “合格供體”。在本發明的優選應用中，分析從每ー捐贈物獲得的樣品以排除感染標志物的存在，諸如例如人免疫缺陷病毒(HIV)、こ型肝炎病毒和丙型肝炎病毒(HBV和HCV)以及對人為病原性的其他病毒。本發明的一部分是血漿捐贈物的受控儲存達不少于60天、優選不少于90天的期間，這將允許如果先前健康的供體在捐贈后表現出被病原體或者其他健康危險因素感染征兆則撤出先前的捐贈。在本發明的優選應用中，來自每ー捐贈物的樣品在從可變數量，例如可在10和10，000之間、優選在90和2000之間并且更優選在100和1000之間變動的數量的捐贈物制備中試混合物(小池或中試池)之后重復分析一次或者一次以上。擴增病毒遺傳物質的方法可以用于這些重復的分析，諸如例如聚合酶鏈式反應(PCR)或歸屬于核酸測試(NAT)的那些已知方法中的其他方法。一旦所有分析和受控儲存期(庫存倉)完成，在通過分析排除了不適宜的単位之后，血漿可用于本發明的隨后階段。下一個階段由將編號不少于100個單位、優選超過1000個單位并且更優選超過 4000個單位的捐贈物融化組成。在本發明的優選應用中，融化將在0°C和4°C之間的溫度下進行。在融化過程中將捐贈物混合以產生血漿混合物(血漿庫)。任選地，所沉淀物質可被分離，因為在融化過程中其是不穩定的。其通常描述為冷沉淀物并且富含von Willebrand因子(FVW)、VIII因子(FVIII)、纖維蛋白原(FBN)、纖連蛋白(FNC)和其他蛋白質。接著，在本發明的優選使用中，向血漿加入96%的制藥級こ醇一直到濃度近似8% (體積/體積)。為了保證蛋白質不會因為こ醇溶解于血漿的放熱過程而變性，其以可控體積加入。同時地并且以相同的目標，血漿庫的溫度逐漸降低至近似-2°C。こ醇的存在保證血漿不凍結。在這些條件下，如果所述冷沉淀物在本發明應用中沒有在加入醇之前分離，則纖維蛋白原極其豐富的并且包括在冷沉淀物中存在的大部分蛋白質的蛋白質級分被沉淀。該級分總稱為Cohn級分I (Fr-I),因為其通過基本上對應于Edwin J. Cohn (CohnE. J.等J Am Chem Soc, 1946)所述的方法獲得。當在該階段獲得的沉淀物被分離時,發現上清液級分基本上無纖維蛋白原，并且因此無纖維蛋白原在細胞培養中可導致的任何干擾，因此一旦所加入的醇因其具有細胞毒性而被去除后，這作為細胞培養基補充物適合本發明的目的。在本發明的優選應用中，在較早描述的兩種沉淀物(冷沉淀物和Fr-I)中任何一個已經分離或者均未分離之后，向現有的混合物加入96%的制藥級こ醇至20%和25% (體積/體積)之間的濃度。為了避免因為こ醇溶解于血漿中的放熱過程所致的蛋白質變性，加入以受控體積開展。同時地并且以相同的目標，血漿庫的溫度逐漸降低至近似-5°C。乙醇的存在保證血漿不凍結。在這些條件下，蛋白質級分被沉淀，在所述蛋白質級分中，先前描述的存在于冷沉淀物和Fr-I (如果其還沒有被分離，如較早所述)的蛋白質極其豐富并且免疫球蛋白、主要是IgG和IgM也極其豐富。如果Cohn Fr-I級分沒有先前分離的話，則該級分總稱為Ι+Π+ΙΙΙ級分(Fr-1+II+III)，或者如果Cohn Fr-I先前已經被分離，則該級分總稱為II+III級分(Fr-11+III)。當在該階段獲得的沉淀物被分離時，發現上清液級分基本上無纖維蛋白原和免疫球蛋白，并且因此無這些蛋白質在細胞培養中可導致的任何干擾，因此一旦所加入的醇因其具有細胞毒性而被去除后，這作為細胞培養基補充物適合本發明的目的。在所述的階段中，向生產血漿衍生物質的過程施加控制，以保證過程依照關于蛋白質濃度、pH、微生物計數等所需要的規范開展。
這些上清液通過基本上對應于Edwin J. Cohn所述的方法獲得，盡管由于生產規模(捐贈物數量和血漿庫體積)和根據本發明的過程與在那時應用的過程之間的變化導致在組成成分上可能不同。從人血漿的エ業分級分離(基于Cohn法)直接獲得的這些上清液，除了去除它們所包含的こ醇(在I級分上清液中為近似8%并且在II+III級分上清液中為近似20% -25% )之外，不需要隨后的純化處理。在這些上清液中包含的こ醇可以通過現有技術中已知的任何方法去除。優選地，其通過透析或滲濾或直接通過冷凍干燥、蒸發或干燥(例如噴霧干燥)開展，此類方法容易エ業化。獲得完全穩定產物的有效制備方法由下列組成以所述的任何上清液開始，和任選的以注射用水、生理鹽水溶液或者緩沖液，在PH 7-8和2-8°C之間的溫度下適當稀釋它們。溶液通過不吸收蛋白質的纖維素板或深板浄化，并且最后其經近似O. 5微米的孔大小 浄化。然后使用近似IOkDa額定分子量截留值的膜將產物對兩倍或兩倍以上體積的注射用水、生理鹽水溶液或者緩沖液在近似7的優選pH下滲濾。優選地,滲濾交換體積的數量為近似5。滲濾的溶液通過使用O. 2至O. I微米孔大小的過濾梯度的絕對過濾凈化。接著，產物可以經過近似35nm和20nm的孔大小，優選地在2_8°C的溫度下和小于或等于I巴的跨膜壓カ下進行納米過濾。所應用的加載優選是大約70升/m2具有較小孔大小的過濾面積。所獲得的產物可以通過超濾濃縮至與起始物質(上清液)相同的總蛋白濃度值，或者如果優選的話更大程度濃縮。在任ー情況中，所獲得的物質計量裝入玻璃管形瓶或容器中，并且優選儲存于-30°C或者更低的溫度下直至使用。在將上清液計量裝入管形瓶內之前的步驟中，可以通過O. I和O. 2微米之間的孔大小開展滅菌過濾。凍結的產物也可以被凍干或者經受其他處理以提供干燥的產物。然后產物可以經受Y輻射并且可以以干燥狀態優選在2至8°C下保存直至使用。如果對起始物質(S/Fr-I或S/Fr-11+III或等效物)沒有開展滲濾并且選擇通過冷凍干燥法直接去除醇，則其被計量裝入玻璃小瓶或容器中。在將上清液計量裝入管形瓶中之前，可以通過O. I和O. 2微米之間的孔大小開展滅菌過濾過程。所測量的物質優選在小于或等于_30°C的溫度下凍結，并且使用已知技術使其經受冷凍干燥和Y輻射。任選地，物質可以以用于消除/滅活病原體的方法處理。優選地，或者凍結或者凍干的物質以15和35千戈瑞之間的Y福射被照射，其中使用25千戈瑞獲得在成分穩定與病毒消除之間的最適條件。凍干產物可以儲存長時間段，優選在2_8°C之間。至于細胞増殖，Fr-11+III上清液以凍干形式保存在冷凍機(2_8°C )保持穩定(増殖百分數等于(100 ±20)%或大于FCS)達至少168天。在Ham F12培養基中重構的該物質在小于或等于_18°C的條件下保持穩定達至少113天(細胞増殖百分數等于或者大于時間零點)。補充有50% S/Fr-11+III的Ham F12培養基在冷凍機中的穩定性是4天。保存該物質直至其被使用的優選方式是在其最終包裝內作為凍干物。以該方式，其可以直接計量成劑量并且こ醇可以在實際的冷凍干燥過程中去除。將這些上清液加入至包含除了細胞生長所必需成分之外的無機鹽、氨基酸和維生素的常規無血清培養基中，例如Ham F12培養基或Dulbecco改良培養基(DMEM)。所獲得的培養基可以用于培養廣泛多種哺乳動物細胞。本領域技術人員已知的常規技術和培養條件以此目的使用。凍干上清液可以在基礎培養基例如Ham F12培養基或Dulbecco改良極限必需培養基(DMEM)中、在蒸餾水或去離子和無熱源的水中、或者在細胞培養中常見的鹽水溶液或緩沖液中重構。在培養基中重構的上清液可以用于通過加入2%和50% (v/v)之間的重構上清液，例如2ml的在培養基中重構的級分I上清液或級分II+III上清液與98ml基礎培養基(2% )，來補充基礎培養基。另ー實例將是加入50ml在培養基中重構的級分I上清液或級 分II+III上清液與50ml基礎培養基(50% )0推薦的是，在水、鹽水溶液或者適宜細胞培養的緩沖液中重構的上清液以2%和20% (v/v)之間的濃度加入至基礎培養基中，例如20ml重構上清液加入至80ml培養基中(20%)。如果需要50% (v/v)的濃度，重構的上清液將必須加入至雙倍濃縮的基礎培養基中(2X)，例如加入50ml水中的級分I上清液或級分II+III上清液至50ml的2X基礎培
養基中。所補充的培養基可以用于通常的培養技術，并且該補充的培養基可以直接使用或者預先經O. 22 μ m過濾。保存的凍結物質(上清液)必須在加入基礎培養基中之前融化。一旦融化，則推薦將其以2%和20% (v/v)的濃度加入至基礎培養基中，例如20ml的重構級分II+III上清液加入至80ml培養基中(20%)。如果需要50% (v/v)的濃度，當補充培養基時，級分I或級分II+III上清液將必須加入至雙倍濃縮的培養基(2X)中，例如加入50ml級分II+III上清液至50ml的2X基礎培養基中。所補充的培養基可以用于通常的培養技術，并且補充的培養基可以直接使用或者經O. 22 μ m過濾后使用。實施例I級分I和II+III上清液的制備通過血漿去除術產生的各個血漿捐贈物混合并融化，融化在反應器內于0°C和4°C之間的可控溫度下開展。最后,獲得3783kg血衆。為了分離冷沉淀物，在9000和12000 Xg之間離心血漿，而保持離心溫度在0°C和
4°C之間。為了分離級分I，檢查了冷沉淀物上清液(C/S)的蛋白質濃度，其應該近似5%。如果其較高，則用注射用水稀釋。PH也調整至近似7。以C/S開始，加入こ醇至8% (體積/體積)的濃度。こ醇加入的速度必須緩慢(小于或等于2kg/分鐘)并且適度攪拌以避免變性。在加入こ醇過程中，在沉淀反應器中上清液的溫度逐漸降低直到其達到最終溫度_2°C。最終pH必須近似7。在大約2小時的反應之后，離心以分離級分I。該離心在9000和12000Xg之間進行。所獲得的上清液(S/Fr-I)以0°C和-4°C之間的溫度保存。
在該點，或者在C/S中，凝血酶原復合物可以任選地通過離子交換層析(Curling,JM 編；Methods of plasma fractionation, Academic Press 1980)提取。為了分離級分11+111，S/Fr-I的pH調整至近似7并且加入こ醇至其近似20%(體積/體積)。加入こ醇的速度必須緩慢(小于或等于2kg/分鐘)并且適度攪拌以避免變性。在加入こ醇的過程中，在沉淀反應器中上清液的溫度逐漸降低至近似-5°C的終溫度。最終pH應該大約7。在該實施例中，在近似6小時的反應之后分離級分11+111。在該點(級分II+III的上清液)，或者在C/S中，或者在S/FrI中，抗凝血酶可以任選地通過肝素親和層析(Fernandez J.等，Sangre 41 (增刊3) 42 (1996)提取。 實施例2劑量測量和冷凍干燥根據實施例I獲得的級分II+III的上清液以注射用水稀釋至pH 7-8并且溫度在2°C和8°C之間直到達到8%的こ醇濃度。溶液通過可達O. 5微米孔大小的纖維素板凈化。接著，產物任選地使用IOkDa額定分子量截留值的聚砜膜在注射用水存在下于pH 7下經受滲濾以去除こ醇。在滲濾過程中的交換體積數量是5。溶液通過使用O. 2微米至O. I微米孔大小的過濾梯度的絕對過濾凈化。接著，產物可以任選地經過35nm和20nm的孔大小，使用銅-銨纖維素濾器于2°C和8°C之間的溫度下和小于I巴的跨膜壓カ下進行納米過濾，最多直到濾器被堵塞。產物可以通過超濾濃縮至與起始物質相同的總蛋白濃度值，并且在通過O. 2微米的孔大小滅菌過濾之后，計量裝入玻璃管形瓶并且儲存于_30°C下直至使用。凍結的產物也可以被凍干以提供干燥的產物，所述干燥的產物經受Y輻射并且可以在2°C和8°C之間的溫度下保存直至使用。實施例3根據實施例2獲得的不同批次物質(在H2O中重構的凍干上清液)的主要成分與胎牛血清的主要成分比較示于下表
權利要求
1.用于培養哺乳動物細胞的培養基，特征在于除了用于哺乳動物細胞培養的基礎培養基中的通常營養素之外，其包含Cohn法級分II+III的上清液。
2.根據權利要求I的培養基，特征在于Cohn法級分II+III的上清液從來自至少1000個人供體的混合物獲得。
3.根據權利要求I或2的培養基，特征在于Cohn法級分II+III的上清液被干燥。
4.根據權利要求I或2的培養基，特征在于Cohn法級分II+III的上清液被凍結。
5.根據權利要求3的培養基，特征在于Cohn法級分II+III的上清液被凍結。
6.根據權利要求I至5任ー項的哺乳動物細胞培養基的制備方法，特征在于所述Cohn法級分II+III的上清液的制備包括階段 -使用こ醇沉淀 -分離上清液 -凍結或干燥 和任選的階段 -稀釋和/或 -透析或滲濾和/或 -去除病原體； 并且隨后將如此制備的上清液加入至基礎培養基中。
7.根據權利要求6的方法，特征在于干燥的上清液在基礎培養基中、在蒸餾水或去離子和無熱源的水中、或者在細胞培養中常用的鹽水溶液或緩沖液中重構。
8.根據權利要求6的方法，特征在于干燥的上清液在基礎培養基中重構。
9.根據權利要求6至8的方法，特征在于人血漿從來自至少1000個人供體的混合物(庫)獲得。
10.包含根據權利要求I至5的培養基在培養哺乳動物細胞中的用途。
全文摘要
本發明涉及哺乳動物細胞培養基，其包含來自根據Cohn法人血漿分級分離的一些級分的人上清液，更加具體而言是級分I和II+III的上清液。當所述上清液作為培養基添加物加入時，其提供用于所培養哺乳動物細胞有效維持和/或增殖的多種營養素和因子。而且，本發明涉及所述培養基的制備方法及其在哺乳動物細胞培養中的用途。
文檔編號C12N5/071GK102660496SQ20121015989
公開日2012年9月12日 申請日期2010年7月27日 優先權日2009年7月28日
發明者何塞·馬里亞·迪茨塞萬提斯, 胡安·伊格納西奧·霍爾克拉捏托, 蒙特塞拉特·科斯塔里爾若拉 申請人:基立福有限公司